The secretory pathway of G. max performs a prominent role in its defense to H. glycines parasitism, a finding reinforced by the identification of the SNARE-associated gene ALPHA-SNAP-5 being rhg1. Other proteins performing important roles in secretion are Sec61-ALPHA, Sec61-BETA and Sec61-GAMMA which bind to form a trimeric complex that imports proteins into the ER for their eventual secretion. Comparative analyses to the Saccharomyces cerevisiae Sec61ALPHA, Sec61BETA and Sec61GAMMA proteins, respectively, shows G. max has 4 Sec61-ALPHA, 9 Sec61-BETA and4 Sec61-GAMMA proteins. At least one paralog from each gene family is expressed in H. glycines-parasitized root cells in G. max, but while undergoing a defense process. The overexpression of one selected Sec61-ALPHA, Sec61-BETA and Sec61-GAMMA in the H. glycines-susceptible genotype G. max[Williams 82/PI 518671] leads to an engineered defense response. In contrast, RNAi of the same selected Sec61-ALPHA, Sec61-BETA and Sec61-GAMMA genes in the H. glycines-resistant genotype G. max[Peking/PI 548402] leads to an engineered susceptible response. The combined opposite outcomes of the Sec61-ALPHA, Sec61-BETA and Sec61-GAMMA gene overexpression and RNAi provides evidence that they function in the defense process, consistent with the hypothesis that the G. max secretion system plays a role in its defense to H. glycines parasitism.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Beteiligung der Protein-Translokase des Endoplasmatischen Retikulums aus Canis familiaris an der Vermittlung eines passiven Calcium-Ausstromes aus dem ER-Lumen untersucht. Der Sec61-Komplex konstituiert eine ionenpermeable Pore im Translokon des Endoplasmatischen Retikulums. Der Kanal zeigt eine hohe Dynamik im Schaltverhalten mit einer Vielzahl von Unterleitwerten, deren Mittelwerte gut mit publizierten Daten übereinstimmen. Zudem besitzt die Pore eine geringe Anionenselektivität in Experimenten mit KCl-Lösungen. Unter Verwendung von CaCl2- und MgCl2-Elektrolyten steigt diese deutlich an, was in vivo den Sec61-vermittelten, passiven Calcium-Ausstrom aus dem ER limitieren kann. Calmodulin (CaM) konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit als potenter Effektor des Sec61-Kanales identifiziert werden. Das Protein vermittelt ein Calcium-abhängiges, nahezu vollständiges Schließen des Kanals, während Calcium-freies ApoCalmodulin keinen Effekt auf den Offenzustand hat. Mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass ein IQ-Motiv als putative Calmodulin-Bindestelle im cytosolischen N-Terminus der Sec61alpha-Untereinheit Ca2 -CaM mit nanomolarer Affinität bindet, eine Interaktion mit ApoCaM hingegen erst bei wesentlich höheren Konzentrationen stattfindet. Die CaM-vermittelte, negative Feedback-Regulation des Sec61-Komplexes durch Calcium legt einen CDI- (calcium-dependent inactivation) Mechanismus nahe, der die Membranbarriere des Endoplasmatischen Retikulums auch in Anwesenheit des weiten Translokonkanals aufrecht erhält.Vergleichende Experimente haben zudem ergeben, dass der Sec61-Kanal aus Saccharomyces cerevisiae im Hinblick auf die grundsätzlichen elektrophysiologischen Eigenschaften übereinstimmende Charakteristika mit dem Komplex aus Canis familiaris zeigt.

Gleich einem Etikett dient die N-Glykokosylierung vom Ribosom neu synthetisierter Proteine durch die Oligosaccharyltransferase (OST) bei der kotranslationalen Translokation in das Endoplasmatische Retikulum (ER) als Startpunkt vielschichtiger Prozessierungen. Bisher fehlte der strukturelle Nachweis, dass die OST als mit dem Ribosom assoziierten Membranprotein (RAMP) Bestandteil des auf dem proteinleitenden Kanal, dem Sec61-Komplex, basierenden Translokons ist. In dieser Arbeit berichten wir von der kryoelektronenmikroskopischen 3D-Struktur eines definierten OST-Sec61-Ribosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae bei 15,4 Å Auflösung. Dazu wurden die Komponenten (OST, Sec61 und Ribosomen mit naszierender Proteinkette) affinitätschromatographisch gereinigt und das Bindungsverhalten mit 80S-Ribosomen in vitro untersucht. Die OST band mit einer KD von 12,8 nM hochaffin und spezifisch an den bekannten Sec61-Ribosomen-Komplex. Dieser in vitro rekonstituierte trimere Komplex zeigte eine neuartige eng an das Ribosom anschließende Translokonstruktur mit zwei bisher unbekannten ribosomalen Verbindungen, einer einzigen dezentralen porenförmigen Vertiefung und zusätzlichen luminalen Bereichen. Durch das Docken eines Sec61-Homologs in einer alternativen Bindeposition sowie das Docken eines Stt3p-Homologs (der katalytischen Untereinheit der OST) und mit Hilfe der mittels (Kryo-)Negativkontrastierung gewonnenen 3D-Struktur der OST konnten Hybridmodelle erstellt werden. Daraus wurde unter Einbeziehung von bekannten molekularbiologisch gewonnenen Interaktionsdaten das 3D-Modell eines aktiven Ribosomen-gebundenen OST-Sec61-Translokons entwickelt. / Like a label, N-glycosylation by the oligosaccharyltransferase (OST) of newly synthesized proteins emerging from the ribosome while being cotranslationally translocated into the endoplasmic reticulum (ER) provides a starting point for a multitude of processes. Hitherto no structural proof has been presented, that the OST as a ribosome associated membrane protein (RAMP) is a constituent of the translocon, based at its core on the protein conducting channel (Sec61-complex). In this work we report on the 3D-structure of a defined OST-Sec61-ribosome complex from Saccharomyces cerevisiae by cryo-electron microscopy at 15.4 Å resolution. Thereto, the components (OST, Sec61, ribosome nascent chain complexes) have been purified by affinity chromatography and the binding of 80S-ribosomes has been checked in vitro. The OST bound with high affinity by a KD of 12.8 nM specifically to the established Sec61-ribosome complex. This trimeric complex reconstituted in vitro exhibits a new kind of tightly bound ribosomal translocon showing two hitherto unknown connections to the ribosome, a single off-center pore-like indentation and an additional luminal domain. By docking of a Sec61 homologue at an alternative binding position plus the docking of a Stt3p homologue (the catalytic subunit of the OST) and by means of the 3D-structure of the OST using the (cryo-)negative staining technique, hybrid models could be created. Consequently, integrating known interaction data from molecular biology experiments has been used to develop a 3D-model of an active ribosome-bound OST-Sec61-translocon.