Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department: Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Jakub Burda Supervisor: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Title of Thesis: The employment of HPLC in the field of chiral separations V. Continuously growing requirements of regulatory authorities for the quality and safety of medicines put a high pressure on manufacturers. Last decades are marked by optically pure drugs, whose developement goes hand in hand with developement of chiral syntheses and separations. The most used method in the field of separations are direct separations using chiral stationary phases. The most often used carrier for these stationary phases is silica, which may contain metal impurities on its surface, negatively impacting separation process. The focus of this thesis was testing of influuence of chromatographic conditions on chiral and achiral interactions of seven selected analytes with stationary phase. Column with native β-cyclodextrin as chiral selector was used for the testing. 1

Les systèmes naturels ont montré l'intérêt de la multiplication des interactions pour une cible, permettant d'améliorer l'affinité et de moduler la spécificité de reconnaissance. Il est ainsi important pour des applications biologiques de concevoir des systèmes multivalents et biocompatibles. Le travail entreprit au cours de ce doctorat porte sur le développement de nouvelles méthodologies pour accéder à des systèmes multivalents originaux.Ainsi, nous avons conçu, par synthèse multi-étapes, une nouvelle plate-forme fonctionnalisée, basée sur un châssis α-PNA pour la reconnaissance multivalente d'oligonucléotides. Ce nouveau système peut potentiellement être impliqué dans la reconnaissance sélective multipoint d'ADN.En parallèle, nous avons préparé des clusters multivalents d'iminosucres sur des châssis peptidiques, construits à partir de ligations click sans métaux, pour l'inhibition enzymatique de glycosidases. En effet, des systèmes multivalents ont été récemment développés en tant qu'inhibiteurs de glycosidases. Cependant, leur méthodologie de synthèse repose quasiment exclusivement sur la ligation azoture-alcyne catalysée au cuivre, ce qui limite son application biologique en raison de sa toxicité. Nos travaux ont ainsi conduit à l'identification d'inhibiteurs efficaces d'α-mannosidases par une approche synthétique sans métaux.Dans le contexte de la vectorisation d'oligonucléotides, il existe un besoin de concevoir des systèmes dynamiques qui permettent un relargage contrôlé. Nous avons appliqué une stratégie d'auto-assemblage, par ligation click de type acylhydrazone, pour la génération in situ de clusters biomoléculaires à partir de châssis peptidiques et de ligands d'acides aminés modifiés. Etant donné le caractère dynamique de la ligation qui confère une adaptabilité au système, nous avons démontré que a) la présence d'une cible permet d'assister la formation des clusters par sélection de certains composants et b) l'ADN peut être relargué par échange de ligands. Cette technique efficace et rapide d'auto-assemblage de fragments a ensuite permis de réaliser un criblage pour sonder l'effet de l'architecture et de la valence sur la complexation. Ce projet a finalement conduit à l'identification de vecteurs efficace pour la transfection de siARN sur cellules.Enfin, dans un dernier projet, nous avons exploité diverses techniques orthogonales et chimiosélectives de ligations click dans le but de générer des nanostructures peptidiques. Deux cages ont ainsi été obtenues par la formation de ligations acylhydrazones et thiol-maléimides selon une approche one-pot.En résumé, ces travaux d'ingénierie et d'auto-assemblage de systèmes biomoléculaires multivalent ont permis le développement de méthodes innovantes pour répondre à des besoins d'actualité et permettre la construction de systèmes multivalents destinés à la reconnaissance d'oligonucléotides, la vectorisation et l'inhibition enzymatique. / Natural systems are inspiring in showing that the combination of multiple interactions enables improvement in binding affinity and selectivity for a target. Thus, the design of synthetic and biocompatible multivalent systems is of great importance for biological applications. The work described in this PhD thesis aims at developing novel methodologies for generating functional multivalent systems.In order to engineer multivalent systems for the recognition of oligonucleotides, we elaborated a multi-step synthesis of functionalized α-PNA scaffolds bearing side-groups. This new scaffold can potentially serve for the multi-point sequence-selective recognition of DNA.Multivalent nanoconstructs are emerging tools for enzyme inhibition. In this context, we prepared multivalent clusters of iminosugars – by metal-free click ligations on peptide scaffolds – as candidates for glycosidases inhibition. Although such enzyme inhibitors based on iminosugar clusters were recently reported, their synthesis relies almost exclusively on copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, which notorious toxicity represents a serious limitation for biological applications. Our approach demonstrates that iminosugar clusters can be prepared in a metal-free fashion and exhibit strong multivalent effects for the inhibition of α-mannosidases. Multivalent biomolecular systems are also candidates for gene delivery application. In this context, the design of dynamic systems is of interest for achieving controlled release. We implemented a self-assembly strategy, using the acylhydrazone click ligation, for the in situ generation of biomolecular clusters starting from peptide scaffolds and modified amino acids building blocks. We showed that, whereas both compounds are ineffective for DNA complexation, the mixed system spontaneously expresses cationic clusters that effectively complex DNA. We further demonstrated that, given the dynamic character of the acylhydrazone ligation, the system is able to a) adapt to the presence of the DNA target by selecting the optimal building blocks for the cluster self-assembly, and b) trigger DNA release by component exchange. This modular and versatile self-assembly approach was further exploited to perform a fragments screening varying molecular structure and valency. Thereby, we identified new and effective vectors for the transfection of siRNA in living cells.The last project described in this manuscript deals with the generation of cage-type peptide nanoconstructs by using a set of orthogonal and chemoselective click ligations. Two cages, based on acylhydrazone ligation on one side and thiol-maleimide on the other, were obtained successfully in one-pot.In summary, this work has led to the development of novel methodologies for the engineering and self-assembly of multivalent biomolecular nanoconstructs for diverse biological applications such as oligonucleotide recognition, delivery and enzyme inhibition.

L'addition catalysée des amines ou phosphines sur des substrats insaturés (alcènes, alcynes ou allènes) constitue une méthode efficace pour la production d’amines et phosphines à hautes valeurs ajoutées. Pour ces réactions, les complexes hétéroleptiques des métaux alcalino-terreux ont émergé comme des précatalyseurs effi caces. Cette thèse décrit la synthèse de complexes des alcalino-terreux supportés par des ligands aminoalcoolates fluorés de type [{RO}AeN(SiMe2H)2] ({RO} = aminoalcoolate fluoré; Ae = Ca, Sr). Des études par diffraction de rayons X montrent que ces complexes utilisent des interactions Ae···F–C and β-Si–H···Ae pour être cinétiquement inertes. Étonnamment, la somme de ces interactions non-covalentes dites secondaires est prédominante par rapport à la coordination d'éthers sur le centre métallique. En outre, les ligands aminoalcoolates fluorés ont été utilisés pour préparer de rares exemples de complexes Ae hétéroleptiques impliquant la coordination intramoléculaire de donneurs d'électrons π (i.e. alcènes et alcynes). Ainsi, pour la première fois, des complexes Ae stabilisés par des combinaisons d’interactions Ae···Cπ, Ae···F−C et β-Si−H···Ae ont été synthétisés. La nature de ces interactions a été sondée par des moyens spectroscopiques, cristallographiques et calculatoires (DFT). En revanche, nos efforts pour obtenir des complexes Ca–aryles ont conduit à la formation de complexes trinucléaires originaux présentant des interactions secondaires β-Si-H···Ca extrêmement fortes. Certains de ces complexes de calcium ont ensuite été testés en catalyse d’hydrophosphination du styrène avec la diphénylphosphine. Ils ont démontré des activités remarquables (TOF ≈ 50 h−1) en conditions douces, ainsi qu’une régiosélectivité de 100% vers la formation du produit d'addition anti-Markovnikov. En collaboration avec le Pr. M. Etienne et le Dr C. Dinoi du Laboratoire de Chimie de Coordination (Toulouse), un précatalyseur hétéroleptique de calcium supporté par un ligand tris(indazolyl)borate fluoré a été utilisé pour l’hydroamination intramoléculaire du 2,2-diméthylpent-4-en-1-amine, et a fait preuve d’une activité catalytique parmi les plus élevées à ce jour. / The catalysed additions of amines or phosphines across unsaturated substrates (alkenes, alkynes or allenes) constitute atom-efficient routes for the production of valuable fine chemicals such as amines and phosphines. For these reactions, heteroleptic alkaline-earth complexes have emerged as promising precatalysts. This PhD thesis describes the synthesis and characterisation of a series of alkaline-earth complexes of type [{RO}AeN(SiMe2H)2] supported by fluorinated aminoalkoxides ({RO} = fluorinated aminoalkoxide; Ae = Ca, Sr ). X-ray diffraction studies show that these complexes heavily involve Ae···F–C and β-Si–H···Ae secondary interactions to achieve kinetic stabilisation. Remarkably, these so-called secondary, non-covalent interactions can be more beneficial towards the stabilisation of the metallic species than the coordination of ethers onto the metal centre. Furthermore, fluorinated aminoalkoxo ligands were used to prepare rare examples of Ae heteroleptic complexes featuring intramolecular coordination from π donors (i.e. alkenes and alkynes). For the first time, Ae complexes stabilised by a combination of Ae···Cπ, Ae···F–C and β-Si–H···Ae interactions were described. The structural and electronic features of these unique complexes were probed by crystallographic, spectroscopic and computational (DFT) methods. The utilisation of aryl-containing ligands resulted in the formation of trinuclear complexes featuring a unique pattern of strong β-Si–H···Ca agostic interactions. Some of these calcium heteroleptic complexes were tested in the hydrophosphination of styrene and HPPh2. They displayed high activities (TOF ≈ 50 h–1) under mild conditions with 100% regioselectivity towards the anti-Markovnikov addition product. In a collaboration with Prof. M. Etienne and Dr. C. Dinoi from the Laboratoire de Chimie de Coordination (Toulouse), a heteroleptic calcium complex supported by a fluorinated tris(indazolyl)borate was used in the intramolecular hydroamination of 2,2-dimethylpent-4-en-1-amine, and it displayed excellent performances.