Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido selenocisteína é um evento cotraducional dirigido pelo códon de terminação UGA e deve se a uma complexa via de biosíntese cujas principais proteínas envolvidas são: Selenocisteína sintase (SELA), Fator de elongação de selenocisteína (SELB), Selenofosfato sintetase (SELD), Seril-tRNAser sintetase, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNAsec ou SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro, denominada de Sequência de inserção de selenocisteína (SECIS). A incorporação de selenocisteína em proteínas bacterianas inicia-se com a aminoacilação do tRNAsec com serina pela enzima Seril-tRNA sintetase formando seril-tRNAsec que é posteriormente convertido a selenocisteil-tRNAsec pela enzima SELA através de selenofosfato. Dessa forma, o trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos bioquímicos e biofísicos da proteína SELA e na análise da interação dessa proteína com o ligante SELC para determinação de parâmetros de ligação envolvidos na formação desse complexo. O gene codificante para a proteína SELA foi subclonado, expresso em linhagem bacteriana WL81460(DE3) e a proteína SELA foi purificada como descrito na literatura; entretanto, uma nova metodologia para sua purificação foi desenvolvida proporcionando maior rapidez e rendimento. Estudos de filtração em gel, eletroforese nativa, focalização isoelétrica, dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência intrínseca e crosslinking químico proporcionaram uma melhor caracterização da proteína SELA e consequentemente uma maior compreensão de seu comportamento em solução. Ensaios de espectroscopia de anisotropia de fluorescência revelaram que a proteína SELA é capaz de se associar em estruturas superiores ao estado decamérico; essa análise pôde ser corroborada principalmente por dados de microscopia eletrônica empregando a técnica de negative staining. A metodologia de anisotropia de fluorescência também permitiu analisar a interação da macromolécula SELA com o ligante específico SELC, bem como com outros tRNAs mutantes possibilitando a realização de um mapeamento das regiões de SELC importantes para a interação. Além disso, essa técnica também foi satisfatoriamente empregada na determinação da estequiometria de ligação do complexo SELA-SELC revelando a proporção de 1 molécula de SELA para 10 tRNAs, o que contraria dados literários publicados em 1991 e 1992. / The formation and incorporation of the amino acid selenocysteine in Escherichia coli is an event directed by cotraducional UGA codon and involves a complex biosynthesis pathway whose main proteins are: Selenocysteine synthase (SELA), elongation factor of selenocysteine (SELB), Selenophosphate synthetase (SELD), Seryl-tRNA synthetase, a selenocysteine tRNA (tRNAsec or SELC) and a specific sequence on the messenger RNA, called Selenocysteine insertion sequence (SECIS). The incorporation of selenocysteine in proteins of bacteria begins with the tRNAsec aminoacylation with serine by the enzyme Seryl-tRNA synthetase resulting in seryl-tRNAsec which is subsequently converted to selenocysteyl-tRNAsec by the enzyme Selenocysteine synthase (SELA). The selenium used in the conversion reaction is provided by Selenophosphate synthetase as selenophosphate and finally, the selenocysteyl-tRNAsec is delivered by the factor SELB to the ribosome. The present study focused on biochemical and biophysical studies of SELA protein and analysis of its interaction with the specific ligand (SELC) for determination of binding parameters involved in the formation of the complex. The gene coding for SELA protein was subcloned, expressed in WL81460(DE3) bacterial strain and the protein was purified as described in the literature; however a new, faster and more efficient method for its purification was developed. Studies of gel filtration, native gel electrophoresis, isoelectric focusing, circular dichroism, intrinsic fluorescence spectroscopy and chemical crosslinking provided a better characterization of SELA protein and a greater understanding of its behavior in solution. Analysis of fluorescence anisotropy spectroscopy revealed that SELA was able to associate in a supramolecular state. This analysis was mainly corroborated by data from electron microscopy employing negative staining technique. Fluorescence anisotropy methodology allowed us to analyse the interaction of SELA protein with the specific ligand SELC, as well as with others mutated tRNAs enabling a mapping of important regions in SELC for interaction. In addition, fluorescence anisotropy technique was also successfully used in determining the stoichiometry ratio of the complex SELA-SELC, showing a proportion of 1 molecule of SELA to 10 tRNAs, contraring to the literary data published in 1991 and 1992.

Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido selenocisteína é um evento cotraducional dirigido pelo códon de terminação UGA e deve se a uma complexa via de biosíntese cujas principais proteínas envolvidas são: Selenocisteína sintase (SELA), Fator de elongação de selenocisteína (SELB), Selenofosfato sintetase (SELD), Seril-tRNAser sintetase, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNAsec ou SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro, denominada de Sequência de inserção de selenocisteína (SECIS). A incorporação de selenocisteína em proteínas bacterianas inicia-se com a aminoacilação do tRNAsec com serina pela enzima Seril-tRNA sintetase formando seril-tRNAsec que é posteriormente convertido a selenocisteil-tRNAsec pela enzima SELA através de selenofosfato. Dessa forma, o trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos bioquímicos e biofísicos da proteína SELA e na análise da interação dessa proteína com o ligante SELC para determinação de parâmetros de ligação envolvidos na formação desse complexo. O gene codificante para a proteína SELA foi subclonado, expresso em linhagem bacteriana WL81460(DE3) e a proteína SELA foi purificada como descrito na literatura; entretanto, uma nova metodologia para sua purificação foi desenvolvida proporcionando maior rapidez e rendimento. Estudos de filtração em gel, eletroforese nativa, focalização isoelétrica, dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência intrínseca e crosslinking químico proporcionaram uma melhor caracterização da proteína SELA e consequentemente uma maior compreensão de seu comportamento em solução. Ensaios de espectroscopia de anisotropia de fluorescência revelaram que a proteína SELA é capaz de se associar em estruturas superiores ao estado decamérico; essa análise pôde ser corroborada principalmente por dados de microscopia eletrônica empregando a técnica de negative staining. A metodologia de anisotropia de fluorescência também permitiu analisar a interação da macromolécula SELA com o ligante específico SELC, bem como com outros tRNAs mutantes possibilitando a realização de um mapeamento das regiões de SELC importantes para a interação. Além disso, essa técnica também foi satisfatoriamente empregada na determinação da estequiometria de ligação do complexo SELA-SELC revelando a proporção de 1 molécula de SELA para 10 tRNAs, o que contraria dados literários publicados em 1991 e 1992. / The formation and incorporation of the amino acid selenocysteine in Escherichia coli is an event directed by cotraducional UGA codon and involves a complex biosynthesis pathway whose main proteins are: Selenocysteine synthase (SELA), elongation factor of selenocysteine (SELB), Selenophosphate synthetase (SELD), Seryl-tRNA synthetase, a selenocysteine tRNA (tRNAsec or SELC) and a specific sequence on the messenger RNA, called Selenocysteine insertion sequence (SECIS). The incorporation of selenocysteine in proteins of bacteria begins with the tRNAsec aminoacylation with serine by the enzyme Seryl-tRNA synthetase resulting in seryl-tRNAsec which is subsequently converted to selenocysteyl-tRNAsec by the enzyme Selenocysteine synthase (SELA). The selenium used in the conversion reaction is provided by Selenophosphate synthetase as selenophosphate and finally, the selenocysteyl-tRNAsec is delivered by the factor SELB to the ribosome. The present study focused on biochemical and biophysical studies of SELA protein and analysis of its interaction with the specific ligand (SELC) for determination of binding parameters involved in the formation of the complex. The gene coding for SELA protein was subcloned, expressed in WL81460(DE3) bacterial strain and the protein was purified as described in the literature; however a new, faster and more efficient method for its purification was developed. Studies of gel filtration, native gel electrophoresis, isoelectric focusing, circular dichroism, intrinsic fluorescence spectroscopy and chemical crosslinking provided a better characterization of SELA protein and a greater understanding of its behavior in solution. Analysis of fluorescence anisotropy spectroscopy revealed that SELA was able to associate in a supramolecular state. This analysis was mainly corroborated by data from electron microscopy employing negative staining technique. Fluorescence anisotropy methodology allowed us to analyse the interaction of SELA protein with the specific ligand SELC, as well as with others mutated tRNAs enabling a mapping of important regions in SELC for interaction. In addition, fluorescence anisotropy technique was also successfully used in determining the stoichiometry ratio of the complex SELA-SELC, showing a proportion of 1 molecule of SELA to 10 tRNAs, contraring to the literary data published in 1991 and 1992.

A biossíntese do 21o. aminoácido, Selenocisteína (Sec - U), envolve uma complexa maquinaria enzimática composta, em eubactérias, pela Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB), Selenofosfato Sintetase (SELD) e tRNA de Inserção Selenocisteína (tRNAsec). Em arqueobactérias e eucariotos existem ainda O fosforil tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS como SELA, EFSec como SELB, SPS1 e 2 como SELD e Proteína Ligante ao SECIS 2 (SBP2). O resíduo Selenocisteína é incorporado à proteína nascente no códon semelhante ao UGA de terminação identificado como local para incorporação de Sec, pela presença da Sequência de Inserção de Selenocisteína (SECIS), juntamente ao códon UGA na região codificante em bactérias e na região 3\'não codificante em arqueobactérias e eucariotos. SELA desempenha um papel central nessa via de biossíntese pela modificação do resíduo de Serina carregado ao tRNAsec pela enzima Seril-tRNA Sintetase (SerRS) convertendo-o em Selenocisteína. Essa enzima forma um complexo homodecamérico que reconhece e liga-se especificamente a SeriltRNAsec. A interação específica entre SELA e o tRNA permanece ainda não determinada. Nosso objetivo é a investigação estrutural por Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e cristalização da SELA e SELA-tRNAsec de Escherichia coli. Dados de SAXS determinaram parâmetros dimensionais como dimensão máxima, massa molecular e raio de giro. O modelo ab-inition foi calculado assumindo a simetria P52 de projeções de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Os cristais obtidos do complexo SELA-tRNA mostraram o grupo espacial e dimensões da cela, apesar da baixa resolução dos dados. Para melhorar os estudos estruturais um modelo para proteína SELA de Escherichia coli foi construído usando o alinhamento da sequência de aminoácidos e o PDB, da proteína SELA putativa, de Methanococcus jannaschii, que apesar da baixa identidade resultou em um modelo muito bom. Adicionalmente, uma Análise de Acoplamento Estatístico (SCA) foi realizada baseada em alinhamentos múltiplos da proteína SELA, ordenando os aminoácidos mais conservados e a relação existente entre eles. / The biosynthesis of the 21th amino acid, Selenocysteine (Sec - U), requires complex enzymatic machinery composed in eubacteria of: Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Specific Elongation Factor (SELB), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a specific Selenocysteine Inserting tRNA (tRNAsec). In archaeabacteria and eukaryotes there are O phosphoryl tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS as SELA, EFSec as SELB, SPS1 and 2 as SELD and SECIS Binding Protein 2 (SBP2). The Selenocysteine residue is incorporated into a nascent protein at a UGA like stop codon signaling as a Sec incorporation site by the presence of a Selenocysteine Insertion Sequence (SECIS), embedding the UGA codon in the coding region in bacteria and in a 3\' UTR in archaea and eukarya. SELA plays a central role in this pathway by modifying the Serine residue charged into the tRNAsec by Seryl-tRNA Synthetase (SerRS) and converting it into Selenocysteine. This enzyme forms a homodecameric complex that specifically recognizes and binds to Seryl-tRNAsec. The specific interaction of SELA and its tRNA remains unclear. Our aim is the structural investigation by Small Angle X ray Scattering (SAXS) and crystallization of Escherichia coli SELA and SELA-tRNAsec. SAXS datas determined dimensional parameters as maximum dimension, molecular mass and radius of gyration. Abinition model calculation was made assuming a P52 symmetry from Transmission Electron Microscope (TEM) projections Crystals of SELA-tRNA complex shown the space-group and cell dimensions, although its low resolution. To improve the structural studies a SELA model of E. coli was built using the amino acid sequences alignment and the PDB from Methanococcus jannaschii, SELA putative protein, which although the lower identities result in a very good model. In addition, a Statistical Coupling Analysis (SCA) was performed based on a multiple sequence alignment of SELA, ordering the most preserved amino acid and the relation between them.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAC.pdf: 5109781 bytes, checksum: 28cbdff07dea548d38125e3c33251370 (MD5) Previous issue date: 2005-05-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / The study of translation processes attracts the interest of a wide range of research groups due to its main role in general cellular metabolism. In particular, the investigation of new amino acid residues, such as selenocysteine and pyrrolysin, which result in an expansion of the genetic code from the traditional 20 residues to a total of 22 residues up to the current time. The amino acid, selenocysteine represents the main biological form of the selenium element and its synthesis and co-translational incorporation into selenoproteins are due to an in-frame UGA stop codon using complex molecular machinery. On Escherichia coli, the main proteins involved in this pathway are: Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Elongation Factor (SELB or EFSec), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a tRNAsec uca specific for this pathway named Selenocysteine Insertion tRNA (SELC). The SELA protein, the subject of this study, was firstly purified by Forchhammer in 1991 and the sole structural analysis realized to this day was developed by Engelhardt in 1992, using the Scanning Transmission Electron Microscope (STEM) technique. With a monomer of approximately 50kDa, SELA assumes an homodecamerical spatial configuration, each dimmer capable of binding to a tRNAsec uca with the serine amino acid which will be converted in selenocysteine, in a reaction dependant of the enzymatic cofactor piridoxal 5 fosfato. On this work it was possible to develop a new purification protocol for the SELA protein, considerably reducing the steps and consequently the time involved for obtaining purified protein. The process also yielded better protein production when compared to literature, from 1mg/ml starting with 10 liters to approximately 4.5mg/ml starting with 3 liters of bacterial medium. As for the structural experiments, it was possible to predict by Dynamic Light Scattering (DLS) the molecular mass as about 442kDa, Circular Dichroism (CD) predicted the secondary structure as mainly composed by α-helices and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) showed the global structure of SELA with a maximum diameter of 185Å, a molecular mass of about 527kDa and a radius of gyration of 67.3 Å / O estudo de processos de tradução atrai o interesse de diversos grupos de pesquisa pelo seu papel central no metabolismo geral da célula. Em particular o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como o selenocisteína e o pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos tradicionais 20 aminoácidos para atualmente um total de 22 aminoácidos. O aminoácido selenocisteína representa a principal forma biológica do elemento selênio, sendo sua síntese e sua incorporação co-traducional em selenoproteínas uma resposta a um códon de terminação UGA em fase de leitura através de uma complexa maquinaria molecular. Em Escherichia coli as principais proteínas envolvidas nessa via são: Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB ou EFSec), Selenofosfato Sintetase (SELD) além de um tRNAsec próprio dessa via denominado tRNA de Inserção de Selenocisteína (SELC). A proteína SELA alvo de estudo deste trabalho, foi primeiramente purificada por Forchhammer em 1991 e o único trabalho estrutural até agora realizado foi desenvolvido por Engelhardt em 1992, a partir da técnica de escaneamento por microscopia eletrônica de Transmissão (STEM). Possuindo um monômero de aproximadamente 50kDa a proteína SELA assume uma configuração espacial homodecamérica, em que cada dímero é capaz de ligarse a um tRNAsec portando o aminoácido serina que será convertido em selenocisteína, numa reação dependente do cofator enzimático piridoxal 5 fosfato. Nesse trabalho foi possível o desenvolvimento de um novo protocolo de purificação para a proteína SELA, reduzindo consideravelmente os passos e conseqüente tempo na obtenção da proteína purificada. Também aumentando os rendimentos obtidos pela literatura, de 1mg/mL a partir de 10 litros, para aproximadamente 4,5mg/mL a partir de 3 litros de cultura bacteriana. Quanto aos experimentos estruturais foi possível a partir de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) a predição da massa molecular em aproximadamente 442kDa, por Dicroísmo Circular (CD) a predição das estruturas secundárias como predominantemente constituída por hélices-α e experimentos de Espalhamento de raio X a Baixo Ângulo (SAXS), a determinação da estrutura global da proteína SELA com um diâmetro máximo de 185Å, sua massa molecular em aproximadamente 527kDa e um raio de giro de 67,3Å.

A biossíntese do 21o. aminoácido, Selenocisteína (Sec - U), envolve uma complexa maquinaria enzimática composta, em eubactérias, pela Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB), Selenofosfato Sintetase (SELD) e tRNA de Inserção Selenocisteína (tRNAsec). Em arqueobactérias e eucariotos existem ainda O fosforil tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS como SELA, EFSec como SELB, SPS1 e 2 como SELD e Proteína Ligante ao SECIS 2 (SBP2). O resíduo Selenocisteína é incorporado à proteína nascente no códon semelhante ao UGA de terminação identificado como local para incorporação de Sec, pela presença da Sequência de Inserção de Selenocisteína (SECIS), juntamente ao códon UGA na região codificante em bactérias e na região 3\'não codificante em arqueobactérias e eucariotos. SELA desempenha um papel central nessa via de biossíntese pela modificação do resíduo de Serina carregado ao tRNAsec pela enzima Seril-tRNA Sintetase (SerRS) convertendo-o em Selenocisteína. Essa enzima forma um complexo homodecamérico que reconhece e liga-se especificamente a SeriltRNAsec. A interação específica entre SELA e o tRNA permanece ainda não determinada. Nosso objetivo é a investigação estrutural por Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e cristalização da SELA e SELA-tRNAsec de Escherichia coli. Dados de SAXS determinaram parâmetros dimensionais como dimensão máxima, massa molecular e raio de giro. O modelo ab-inition foi calculado assumindo a simetria P52 de projeções de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Os cristais obtidos do complexo SELA-tRNA mostraram o grupo espacial e dimensões da cela, apesar da baixa resolução dos dados. Para melhorar os estudos estruturais um modelo para proteína SELA de Escherichia coli foi construído usando o alinhamento da sequência de aminoácidos e o PDB, da proteína SELA putativa, de Methanococcus jannaschii, que apesar da baixa identidade resultou em um modelo muito bom. Adicionalmente, uma Análise de Acoplamento Estatístico (SCA) foi realizada baseada em alinhamentos múltiplos da proteína SELA, ordenando os aminoácidos mais conservados e a relação existente entre eles. / The biosynthesis of the 21th amino acid, Selenocysteine (Sec - U), requires complex enzymatic machinery composed in eubacteria of: Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Specific Elongation Factor (SELB), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a specific Selenocysteine Inserting tRNA (tRNAsec). In archaeabacteria and eukaryotes there are O phosphoryl tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS as SELA, EFSec as SELB, SPS1 and 2 as SELD and SECIS Binding Protein 2 (SBP2). The Selenocysteine residue is incorporated into a nascent protein at a UGA like stop codon signaling as a Sec incorporation site by the presence of a Selenocysteine Insertion Sequence (SECIS), embedding the UGA codon in the coding region in bacteria and in a 3\' UTR in archaea and eukarya. SELA plays a central role in this pathway by modifying the Serine residue charged into the tRNAsec by Seryl-tRNA Synthetase (SerRS) and converting it into Selenocysteine. This enzyme forms a homodecameric complex that specifically recognizes and binds to Seryl-tRNAsec. The specific interaction of SELA and its tRNA remains unclear. Our aim is the structural investigation by Small Angle X ray Scattering (SAXS) and crystallization of Escherichia coli SELA and SELA-tRNAsec. SAXS datas determined dimensional parameters as maximum dimension, molecular mass and radius of gyration. Abinition model calculation was made assuming a P52 symmetry from Transmission Electron Microscope (TEM) projections Crystals of SELA-tRNA complex shown the space-group and cell dimensions, although its low resolution. To improve the structural studies a SELA model of E. coli was built using the amino acid sequences alignment and the PDB from Methanococcus jannaschii, SELA putative protein, which although the lower identities result in a very good model. In addition, a Statistical Coupling Analysis (SCA) was performed based on a multiple sequence alignment of SELA, ordering the most preserved amino acid and the relation between them.