Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-16T15:52:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-16T15:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O setor da agroindústria representa a maior fração das divisas na economia brasileira. No entanto, as culturas agronômicas estão sujeitas aos estresses do meio ambiente, incluindo os estresses bióticos (causados por microrganismos, herbívoros ou vírus) e abióticos (disponibilidade de água, nutrientes, presença de agentes estressantes no solo, etc) e eventos de desenvolvimento, como a senescência. No caso de defesa a estresses múltiplos, as plantas ativam uma via de sinalização de morte celular programada (PCD, programmed cell death) mediada pelos fatores de transcrição GmNAC081 e GmNAC030 que pertencem a uma grande família de transfatores específicos de plantas. Foi observado que GmNAC081 está envolvido com o processo de senescência natural e seu silenciamento retarda a senescência foliar e atenua os demais sintomas decorrentes da morte celular programada; porém, o mecanismo bioquímico envolvido não foi totalmente elucidado. Nesta investigação, foi explorada uma abordagem de genômica funcional para avaliar o mecanismo pelo qual GmNAC081 está envolvido em senescência, bem como o efeito da expressão ectópica de GmNAC081 durante o déficit hídrico. As linhagens transgênicas superexpressando o gene GmNAC081 senesceram mais rápido do que as plantas não transformadas. Nas linhagens transgênicas, GmNAC081-1, e GmNAC081-3, a expressão ectópica de GmNAC081 acelerou o amarelecimento foliar que foi associado com maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), comparado com as plantas controles. Enquanto que no estádio V3 (20 dias após germinação), nas linhagens transgênicas, o nível de transcritos de GmNAC081 foi muito superior àqueles de plantas não transformadas BR16, no estádio R7 (80 DAG), a expressão de GmNAC081 endógeno, em BR16, foi induzida pelo processo de senescência, alcançando níveis similares àqueles das linhagens transgênicas. A indução natural de GmNAC081 durante senescência mimetizou o fenótipo da superexpressão do transgene, uma vez que, em clusterização, as sequências expressas durante senescência natural em BR16 agruparam junto com as sequências expressas da linhagem GmNAC081-3 nas plantas em R7. Em contraste, nas plantas em V3, na linhagem transgênica, 1849 e 2813 genes foram induzidos e reprimidos, respectivamente, dos quais 455 genes regulados positivamente e 1200 genes regulados negativamente foram comum ao processo de senescência natural de folhas. Estes resultados indicam que GmNAC081 tem um papel predominante como regulador positivo de senescência foliar natural. Entre os genes regulados positivamente destacam-se alvos diretos de GmNAC081, validando os resultados de RNA-seq. Além disso, foram selecionados adicionais genes candidatos com o potencial de serem modulados por GmNAC081, como JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, os quais contem sítios de ligação para o gene GmNAC081 nos seus promotores. Estes resultados ampliaram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica, identificando um conjunto de possíveis alvos diretos que atuam para estabelecimento do processo de senescência. Também foi avaliado o efeito da superexpressão do gene GmNAC081 em resposta ao déficit hídrico. As plantas superexpressando GmNAC081 foram mais sensitivas ao déficit hídrico, apresentando menor teor de água e menor potencial hídrico, sob o mesmo regime de déficit hídrico, que as plantas não transformadas, o que foi associado com um fenótipo de senescência acelerada induzida por seca. Além disso, os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e de fluorescência monitorados durante o déficit demostraram a maior sensitividade das plantas transgênicas à seca. Coletivamene, os resultados dessa investigação descreveram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica e demonstraram que GmNAC081 exerce uma função positiva predominante no estabelecimento de senescência natural e regula negativamente a tolerância de plantas à seca. / In Brazil, the agribusiness contributes considerably to economy. However, the crops are exposed to environmental stresses, including biotic stresses, which are caused by microorganisms, herbivores or viruses, as well as abiotic stresses caused by water deficit, nutrient depravation, presence of stressing agents in the soil, etc. In the case of defense to multiple stresses, the plants activate a programmed cell death (PCD) signaling mediated by GmNAC081 and GmNAC030 proteins, which belong to a large family of plant-specific transcriptional factors. Recently, GmNAC081 has been demonstrated to play a positive role in natural leaf senescence, as GmNAC081 silencing delays leaf senescence and attenuates the hallmarks of PCD, although the underlying mechanism has not been totally elucidated. In this investigation, a functional genomic approach was exploited to evaluate the mechanism by which GmNAC081 mediates senescence, as well as the effect of ectopic expression of GmNAC081 during water deficit. The GmNAC081-overexpressing lines displayed accelerated senescence as compared to wild type, untransformed plants. In the transgenic lines, GmNAC081-1 and GmNAC081-3, the ectopic expression of GmNAC081 accelerated leaf yellowing, which was associated with a greater accumulation of ROS, as compared to control lines. While in V3 plants (20 days after germination (20 DAG)), in the transgenic lines, the transcript levels of GmNAC081 were much greater that those of untransformed plants, BR16, in R7 plants (80 DAG), the expression of endogenous GmNAC081 in BR16 was induced by senescence, reaching similar levels as the transgenic lines. The natural induction of GmNAC081 during senescence mimicked the phenotype of transgene overexpression because the expressed sequences during natural senescence in BR16 clustered together with the expressed sequences of the GmNAC081-3 line in plants at R7. In contrast, in V3 plants, in the transgenic line, 1849 and 2813 genes were induced and repressed, respectively; among those, 455 up-regulated genes and 1200 downregulated genes were common to the process of leaf senescence. These results indicate that GmNAC081 plays a major role as a positive regulator of natural leaf senescence. Among the up-regulated genes, direct targets of GmNAC081 were highlighted, validating the results of RNA-seq. Furthermore, additional candidate genes were selected with the potential to be modulated directly by GmNAC081, including JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, which contain GmNAC081 binding sites on their promoter. These results amplified the transcriptional activity of GmNAC081, as they identified a set of possible direct target genes, which function in the onset of senescence. The effect of GmNAC081 overexpression in response to water deficit was also examined. GmNAC081-overexpressing plants were more sensitive to water stress, as they displayed a lower water potential and relative water content than untransformed plants under the same regime of water deficit, which was associated with a drought-induced accelerated senescence phenotype. Furthermore, gas exchange and fluorescence physiological parameters during water deficit confirmed the greater sensitivity of transgenic lines to drought. Collectively, our results described the widegenomics transcriptional activity of GmNAC081, demonstrating that GmNAC081 plays a major positive role in leaf senescence and a negative role in water deficit tolerance.