Die membrangebundene Sensorkinase KdpD und der cytoplasmatische Antwortregulator KdpE regulieren die Expression des kdpFABC-Operons, welches für das hoch affine Kaliumaufnahmesystem KdpFABC von Escherichia coli kodiert. Aktiviert wird die Signal-transduktionskaskade zum einen durch Kalium limitierende Bedingungen im Medium und zum anderen aber weniger stark durch erhöhte Osmolarität.Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels dem "Bacterial Two Hybrid" System nach bisher unbekannten Interaktionspartnern der Sensorkinase KdpD gesucht, die einen Einfluss auf die Regulation des Zweikomponenten-systems haben könnten.Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit biochemischen Untersuchungen der Sensorkinase.Neben der Etablierung der kdpD-Expression in Lactococcus lactis, wurde ein neues Reinigungsprotokoll für KdpD erstellt. Das gereinigte KdpD konnte im Anschluss rekonstituiert werden. Kinase-Aktivitätstests zeigten, dass das Protein innerhalb der Membran aktiv ist, wogegen das solubilisierte Protein nur in oligomeren Zuständen vorkommt und kaum aktiv zu sein scheint. Mittels spektroskopischer Messungen wurde außerdem die ATP-Bindung an KdpD untersucht.

Unter K+-limitierenden Wachstumsbedingungen oder, in wesentlich geringerem Ausmaß, unter Salzstress synthetisiert E. coli den KdpFABC-Komplex, ein hoch-affines K+-Transportsystem (Km ~ 2μM). Die Regulation der Expression des kdpFABC-Operons erfolgt durch das Sensorkinase/Antwortregulator-System KdpD/KdpE. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Identifizierung des Stimulus, der von der Sensorkinase KdpD wahrgenommen wird. Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Beobachtung, dass die K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM inhibiert wird. Diese wichtige Eigenschaft des Kdp-Systems wurde in der Vergangenheit häufig übersehen, da die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren pH-Werten (pH 7,8) durch eine hohe Rate unspezifischen K+-Transports kompensiert und somit überdeckt wird. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Aspartat-Substitutionen in den periplasmatischen Schleifen der Sensor-Domäne von KdpD ausreichten, um die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren K+-Konzentrationen aufzuheben. Diese KdpD-Derivate zeigten eine, im Vergleich zum KdpD-WT, veränderte Regulation der kdpFABC-Expression bei K+-Konzentrationen >5 mM, die eine adäquate K+-Aufnahme via KdpFABC ermöglichte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM auf einer Inhibierung der kdpFABC-Expression durch KdpD basiert. Weiterhin konnte gezeigt werde, dass eine Abnahme der extrazellulären K+-Konzentration eine effiziente und sofortige Stimulierung der KdpD/KdpE-Signaltransduktion bewirkt. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass die extrazelluläre K+-Konzentration als Reiz für die Sensorkinase KdpD dient. Im zweiten Teil dieser Arbeit erfolgte erstmals eine absolute Quantifizierung von KdpD und KdpE, sowie der Untereinheiten des KdpFABC-Komplexes unter induzierenden und nicht-induzierenden Bedingungen mittels hoch-sensitiver und selektiver Massenspektrometrie. Unter nicht-induzierenden Bedingungen liegt die KdpFABC-Synthese in der gleichen Größenordnung wie die KdpD- und KdpE-Synthese vor. Dieser Befund ist eine wichtige Voraussetzung für die postulierte, regulatorische Interaktion zwischen der Sensorkinase KdpD und der K+-Transportuntereinheit KdpB (Kipschull, 2011). Unter induzierenden Bedingungen stieg die KdpFABC-Synthese 100-300-fach, während eine etwa 10-fache Erhöhung der KdpD- und KdpE-Synthese nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung bestätigt, dass das Zweikomponenten-System KdpD/KdpE unter induzierenden Bedingungen einer Autoregulation unterliegt. Die Autoregulation konnte durch eine räumliche Trennung des kdpFABC- und kdpDE-Operons aufgehoben werden. Die Aufhebung der Autoregulation von KdpD/KdpE hatte jedoch keinen Einfluss auf die Expressionskinetik des kdpFABC-Operons unter induzierenden Bedingungen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt die Konstruktion eines E. coli-Stamms, der eine vollständige Deletion des kdpD-Gens trägt. Nach einer zeitlichen Verzögerung konnte in dem daraus resultierenden E. coli-Stamm (LB2240ΔkdpD) unter K+-Limitation eine KdpD-unabhängige Expression des kdpFABC-Operons nachgewiesen werden. Die kdpFABC-Expression befähigte diesen Stamm, in Abwesenheit von KdpD unter K+-Limitation zu wachsen. Es konnte gezeigt werde, dass das K+-limitierte Wachstum von LB2240ΔkdpD eine Phosphorylierung von KdpE voraussetzt, wobei Acetylphosphat nicht als alternativer Phosphodonor diente. Da nur wenige Zellen einer LB2240ΔkdpD-Kultur den beschriebenen Phänotyp zeigten, liegt die Vermutung nahe, dass diese Zellen Träger einer Suppressormutation sind, die eine KdpD-unabhängige Phosphorylierung von KdpE und daraus folgend eine kdpFABC-Expression verursacht.

Mittels Quorum sensing können Bakterienzellen die Expression von Genen Zelldichte-abhängig steuern. Dies spielt eine besondere Rolle bei der Expression von Virulenzfaktoren oder Antibiotikaproduktion, der Biofilmentwicklung oder Phänomenen wie genetischer Kompetenz, Sporulation oder Biolumineszenz. Vibrio harveyi, ein Gram-negativer, mariner, frei lebender Organismus, reguliert die Expression von Biolumineszenz-Genen Zelldichte-abhängig nach dem Prinzip des Quorum sensing und sollte im Rahmen dieser Arbeit als Modell für die Mechanismen der Signaltransduktion untersucht werden. Dazu wurden die Proteine der Lux-Signaltransduktionskaskade heterolog in E. coli überexprimiert und teilweise gereinigt. Mittels in vitro Phosphorylierung konnten die enzymatischen Aktivitäten der Proteine erstmals biochemisch charakterisiert werden. Für die Hybridsensorkinase LuxN konnte neben einer Kinase-Aktivität ein Phosphotransfer auf das Histidin-Phosphotransferprotein LuxU gezeigt werden. Die Autophosphorylierungsaktivität ist dabei eindeutig von der Konzentration des Signalmoleküls, eines Acyl-Homoserinlaktons, abhängig. Eine ebenfalls eindeutig nachgewiesene Phosphatase-Aktivität von LuxN, die zur Dephosphorylierung von LuxU führt, war dagegen konstitutiv. Damit konnte ein auf biochemischen Daten basierendes Modell der Signaltransduktion von V. harveyi postuliert werden. Basierend auf den Ergebnissen von Topologieuntersuchungen mittels luxN-Reportergenfusionen und Protease-Zugänglichkeitsstudien konnten neue Hinweise auf die Membrantopologie der Hybridsensorkinase ermittelt werden. Diese lassen auf ein Modell mit neun Transmembranhelices schließen, bei der der N-terminus des Proteins im Periplasma der Zelle lokalisiert zu sein scheint.