Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Mycobacterium avium e Mycobacterium kansasii são micobactérias não tuberculosas frequentemente isoladas em infecções em pacientes HIV positivos. Em um projeto anterior do laboratório foi estudado um cultivo misto de M. avium e M. kansasii isolado da medula óssea de um paciente HIV positivo. Estudando colônias isoladas deste cultivo, foi possível observar que a cepa de M. kansasii possuía a sequência de inserção IS1245, que é especifica de M. avium. A presença deste elemento de inserção em M. kansasii foi confirmada por PCR-IS1245, RFLP-IS1245 e sequenciamento. Este estudo teve como objetivo investigar o mecanismo de transferência da IS1245 para M. kansasii. Uma banda de aproximadamente 100 kb foi detectada por PFGE em colônias de M. avium e de M. kansasii deste cultivo misto. Testes de mobilidade desta banda de DNA em géis de PFGE, em diferentes condições de corrida, e testes com exonucleases e com topoisomerase I comprovaram que esta banda era um plasmídeo linear (pMA100), que continha proteínas covalentemente ligada nos seus terminais 5’. Estes achados levaram à hipótese de que o plasmídeo pMA100 seria responsável pela transferência natural do elemento IS1245 de M. avium para M. kansasii por conjugação. Experimentos in vitro reproduziram o evento de conjugação, tanto com a cepa de M. kansasii isolada do cultivo misto, como com outras duas cepas de M. kansasii não relacionadas. A sequência de inserção se manteve estável no genoma de M. kansasii após 10 subcultivos e foi observada a ocorrência de transposição de modo replicativo em M. kansasii. Pela primeira vez está sendo demonstrada a transferência horizontal de genes natural entre espécies diferentes de micobactérias. / Mycobacterium avium and Mycobacterium kansasii are non-tuberculous mycobacteria frequently isolated in infections from HIV positive patients. In a previous study from our laboratory, a mixed culture of M. avium and M. kansasii from a bone marrow isolate of an HIV positive patient was studied. The analysis of isolated colonies allowed the detection of the insertion sequence IS1245, specific from M. avium, in M. kansasii. The presence of this element in M. kansasii was confirmed by PCR-IS1245, RFLP-IS1245 and sequencing. The objective of this study was to investigate the mechanism of transference of the IS1245 to M. kansasii. A band of approximately 100 kb was detected by PFGE in colonies of M. avium and M. kansasii from this mixed culture. Tests of mobility of this DNA band in PFGE gels, in different running conditions, and tests with exonucleases and topoisomerase I demonstrated that this band was a linear plasmid (pMA100) with proteins covalently linked to the 5’ ends. These findings led to the hypothesis that the pMA100 plasmid was responsible for the natural transference of the IS1245 element from M. avium to M. kansasii by conjugation. Experiments performed in vitro reproduced the conjugation event, not only with the M. kansasii strain from the mixed culture, but also with other two unrelated M. kansasii strains. The insertion sequence was stably maintained in the M. kansasii genome after 10 subcultures and its replicative transposition in M. kansasii was also observed. For the first time the natural horizontal gene transfer between different species of mycobacteria has been demonstrated. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T11:57:27Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17456 bytes, checksum: 1d66a7d5cc0063d744a4b711bc90ee10 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T11:57:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 17456 bytes, checksum: 1d66a7d5cc0063d744a4b711bc90ee10 (MD5) Previous issue date: 2004-05-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foi feita a caracterização de um mutante espontâneo do Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 que mostrou-se desprovido da capacidade de imunoestimulação e também a investigação do possível papel da seqüência de inserção ISLdH2b20 nessa mutação. A confirmação da identidade genética de L. delbrueckii UFV H2b20 com a do mutante desprovido da capacidade de imunoestimular o hospedeiro foi realizada por análise dos perfis de PCR-DGGE. Ambas bactérias apresentaram na microscopia eletrônica de transmissão característica peculiar do H2b20, a de formar bastonete alongado quando na fase estacionária. As células do mutante mostraram-se com diâmetro maior do que as da cultura do L. delbrueckii UFV H2b20, porém as velocidades especificas máximas de crescimento (μ max ) foram iguais. As células do mutante sofrem lise mais rápida do que as da cultura original selvagem quando em presença de baixas concentrações de mutanolisina, no entanto, o perfil de lise é idêntico em presença de lisozima. A hidrofobicidade de superfície das células, determinada pelo teste de MATH, é maior nas células da cultura original do L. delbrueckii UFV H2b20. Os perfis de proteínas de superfície não se distinguem quanto ao número e posição das bandas em SDS-PAGE, contudo a banda referente à proteína de aproximadamente 36kDa apresentou mais proteína nos extratos do tipo selvagem do que a do mutante. O mutante apresentou uma maior quantidade de proteínas em quase todas as outras bandas, com destaque para duas bandas, 60 kDa e 75 kDa. O estudo de distribuição da ISLdH2b20 nos isolados selvagem e mutante, feito por análise de Southern, mostrou mesmo perfil de distribuição dessa seqüência de inserção nos dois solados. Os resultados indicam a possível participação de uma proteína de 36 kDa no processo de imunoestimulação do H2b20, possivelmente da camada S, e que a instabilidade desse, quanto à capacidade de imunoestimulação, não tem a participação direta da seqüência de inserção ISLdH2b20 em particular. / A mutant of L. delbrueckii UFV H2b20, without the capacity of immunestimulation, was characterized and the possible role of the insertional sequence ISLdH2b20 in this mutation also. PCR-DGGE confirmed its genetic identity as L. delbrueckii UFV H2b20. Transmission electron microscopy demonstrated the characteristic morphology of the cells in the stationary phase, when they appeared as long rods with 0,653μm diameter, for the wild type, and 0,735μm, for the mutant. Maximum specific growth rate (μ max ) was similar for both cultures. The effect of lysozyme on cells of H2b20 and mutants was the same; however, mutanolysin had a more rapid lytic effect on mutant cells, when in lower concentrations. The superficial hydrophobicity of the cells, determined by microbial adhesion to hexadecane (MATH) is higher in wild type cells. The profiles protein of superficial proteins, by SDS-PAGE, are similar when the position and number of bands are considered, however, the band represented by one protein with approximately 36kDa showed more protein in the wild type extract than in the mutant extract. The mutant presented more proteins in almost all of the other bands, especially in the two bands representing proteins with 60kDa and 75kDa. The consolidated results point to a possible role for the 36kDa protein in the immunestimulation capacity of the wild type cells. This is possible the S-layer protein of L. delbrueckii UFV H2b20. Southern analysis of the wild type and the mutant’s DNAs indicated no difference in the distribution of the several copies of ISLdH2b20 between the two strains. This leads to the conclusion that the mutation, which introduced to loss of the immunestimulation capacity, is not the result transposition of this putative element.