Orientador: Cesar Martins / Banca: Francis de Moraes Franco Nunes / Banca: Patrícia Pintor dos Reis / Banca: Danilo Pinhal / Banca: Rafael Henrique Nóbrega / Resumo: A Tilápia do Nilo é uma espécie de grande relevância na aqüicultura mundial. Espécimes do sexo masculino têm maior crescimento quando comparado as fêmeas, uma característica importante em sistemas de produção de peixe. Infelizmente, os mecanismos envolvidos no desenvolvimento que levam à diferenciação sexual em peixes ainda são pouco compreendidos. Vários genes e miRNAs tem sido propostos como influênciadores desses processos, porém seu efetivo papel, permanece desconhecido. Considerando a importância biológica do desenvolvimento embrionário e determinação do sexo, microRNomas de tilápia do Nilo, expressos durante o desenvolvimento e em indivíduos machos e fêmeas adultos, foram analisados. Bibliotecas de pequenos RNAs foram geradas a partir de embriões de 3 e 5 dias pós fertilização (dpf), e cérebro e gônadas de indivíduos adultos de ambos os sexos, e seqüenciados via plataforma Illumina. Foram identificados 194 miRNAs já conhecidos com base em bancos de dados referência de zebrafish, sendo que destes 120 apresentaram expressão diferencial entre macho e fêmea de O. niloticus. Foram identificados ainda 74 novos miRNAs não presentes no banco de dados referência. Vinte e dois miRNAs foram testados por qPCR e cinco tiveram seus genes-alvo candidatos testados pelo ensaio de gene repórter da luciferase. Os resultados de qPCR mostraram que a expressão da família do miR-10 foi alta durante os períodos de 3 e 5dpf. Softwares de predição sugerem que essa família de miRNAs regula a expressão de membros dos genes Hox. Sendo assim, foram testados por qPCR e pelo ensaio do gene réporter da luciferase três genes dessa família: HoxA3a, HoxB3a e HoxD10a. Os resultados mostraram que miR-10b tem como alvos Hoxb3a e HoxD10a. Já na diferenciação do sexo, os resultados de qPCR apontaram uma alta expressão do miR-145-5p durante o desenvolvimento de embriões de fêmea, enquanto seu possível alvo, Sox9a, teve... / Abstract: The Nile tilapia is a species of great importance in world aquaculture. Male specimens have increased growth compared with females, an important feature in fish production systems. Unfortunately, the mechanisms involved in the development and sexual differentiation in fish are still poorly understood. Several genes and miRNAs have been reported as influencing these processes, but its effective role remains unknown. Given the biological importance of miRNAs to embryonic development and sex determination, microRNomes were analyzed during development and in adult male and female of O. niloticus. Small RNAs libraries were generated from 3 and 5 dpf embryos, and brain and gonads of adult specimens, and sequenced using Illumina platform. Out of 194 miRNAs identified based on zebrafish database, 120 showed differential expression between male and female of O. niloticus. Additionally, 74 new miRNAs not detected in zefrafish database were found. Twenty-two miRNAs were tested by qPCR and five had their target candidate genes tested by luciferase reporter gene assay. The qPCR results showed that miR-10 family expression was high during the periods of 3 and 5dpf. Prediction software suggested that this family of miRNAs regulate the Hox genes family members. Therefore, were tested by qPCR and luciferase gene reporter assay, three Hox genes: Hoxa3a, HoxB3a and HoxD10a. The results showed that miR-10b have Hoxb3a and HoxD10a as target. In sex differentiation, the results of qPCR showed a high expression of miR-145-5p during the development of female embryos, while its possible target, Sox9, decreased. Moreover, the miR-181a expression decreased and his target gene, Cyp191a increased. The luciferase gene reporter assay validated the Cyp19a1 as a direct target of miR-181a, and Sox9 as a target of miR-145-5p. Our data suggest that, as in other vertebrates, Hox genes are extremely important in the development of Nile tilapia and are regulated by miR-10 ... / Doutor

Orientador: Luiz Claudio Nogueira Mendes / Coorientador: Sergio Moraes Aoki / Banca: Flavia Lombardi Lopes / Banca:Gisele Zoccal Mingotti / Banca:Maria denise Lopes / Banca: Eduardo Harry Birgel Junior / Resumo: Novas metodologias para a sexagem de sêmen são buscadas devido à citometria de fluxo apresentar limitações e desvantagens e os aptâmeros surgem como potenciais candidatos para a identificação de espermatozoides conforme a presença do cromossomo X ou Y. Os objetivos foram avaliar o uso de três aptâmeros desenvolvidos para se ligarem especificamente ao espermatozoide Y na separação magnética por sexo de espermatozoides de touro, e desenvolver uma técnica de qPCR que permita realizar facilmente o diagnóstico da proporção sexual em amostras de sêmen. Protocolos de separação por magnetismo utilizando aptâmeros biotinilados foram utilizados em sêmen comercial, e duas frações de espermatozoides foram obtidas para cada aptâmero testado (livre e retida). A proporção relativa de espermatozoides Y foi analisada em reações de qPCR desenvolvidas para este objetivo. A curva padrão utilizada na qPCR foi eficiente para a quantificação da proporção sexual relativa em amostras de sêmen convencional e sexado. Diferença significativa da proporção relativa de Y foi encontrada na fração de espermatozoides livres do aptâmero C12 em relação ao controle (47,7% vs. 51,3%, respectivamente; P = 0,009); as demais separações não apresentaram diferença significativa. Os aptâmeros selecionados não produziram o efeito desejado de separação do sêmen conforme a presença do cromossomo X ou Y, nestas condições utilizadas, mas a diminuição da proporção relativa de Y em uma das frações não retidas indica ser possí... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sex preselection of livestock offspring represents a big potential for genetic improvement. There are a search for new methods to sex-sort bull semen in order to avoid the limitations of flow cytometry/cell sorting technique. Aptamers emerge as potential candidates for sperm identification relative the presence of chromosome X or Y. In this work, the objectives were 1, to evaluate three aptamers developed to specifically binding to the Y-bearing sperm in magnetic separation by sex of bovine sperm and 2, to develop a SYBR Green Real-Time PCR method to determinate sex ratio in bovine semen in semen samples. Separation protocols by magnetism using biotinylated aptamers were used in commercial semen, and two fractions of sperm were obtained for each tested aptamer (free and trapped). The relative ratio of Y-bearing spermatozoa was analyzed in qPCR reactions developed for this purpose. The standard curve for qPCR was efficiently designed to quantify the sex relative ratio of sorted and unsorted semen samples. Significant difference in the relative proportion of Y-bearing sperm was found in the fraction of free sperm samples from aptamer C12 compared to the control samples (47.7% vs. 51.3%, respectively; P = 0.009); other separations showed no significant difference. Selected aptamers did not produce the wanted effect of sperm separation by the presence of chromosome X or Y, in these conditions used, but decreased relative proportion of Y-bearing sperm in one of the free fractions ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor