Doctora en Ciencias, Mención Computación / La infertilidad es un problema clínico que afecta hasta a 15% de parejas en edad reproductiva, con implicancias tanto emocionales como fisiológicas. Un análisis de semen es el primer paso en la evaluación de una pareja infértil. El énfasis en identificar no sólo cabezas normales de espermatozoides sino también categorías de cabezas anormales puede tener una significativa utilidad clínica al decidir por un tratamiento de fertilidad. Esta tesis propone una nueva metodología para detectar, segmentar, caracterizar y clasificar cabezas de espermatozoides humanos, con el objetivo de facilitar el posterior análisis morfológico, para diagnósticos de fertilidad, toxicología reproductiva, investigación básica o estudios de salud pública. En la primera parte de este tesis, se ha tratado la detección y segmentación de cabezas de espermatozoides humanos. En este sentido, se propone un gold-standard para segmentación de espermatozoides construido con la cooperación de un experto referente en el área, para comparar métodos para detección y segmentación de espermatozoides. Además, se ha desarrollado un framework para la detección y segmentación de componentes de cabezas de espermatozoides humanos (incluyendo acrosoma y núcleo) que usa tres espacios de color además de técnicas de clustering y análisis estadístico del histograma. La evaluación experimental muestra que el método propuesto mejora el desempeño del estado del arte. Los resultados logran 98% de detección correcta a expensas de un número menor de falsos positivos, comparado con el estado del arte. Así mismo, los resultados de segmentación de cabeza, acrosoma y núcleo muestran más de 80% de solapamiento comparado con las máscaras de segmentación manual del gold-standard. En la segunda parte de esta tesis, el enfoque estuvo en la caracterización y clasificación de cabezas de espermatozoides humanos. Así, se introduce un gold-standard para clasificación de cabezas de espermatozoides humanos, construido con la colaboración de tres expertos referentes en área, y de acuerdo al criterio de la OMS. Además, se ha formulado un nuevo descriptor para cabezas de espermatozoides que, combinado con otros descriptores basados en forma, permite discriminar entre cabezas de espermatozoides normales y anormales, identificando cuatro tipos de cabezas anormales. También se propone un esquema de clasificación, que permite categorizar las cabezas de espermatozoides en 5 clases diferentes, según la OMS. La evaluación experimental muestra que el esquema propuesto tiene mejor desempeño que distintos clasificadores monolíticos, así como varios esquemas de clasificación en cascada que fueron diseñados en el contexto de esta investigación. Los resultados muestran más de 70% de clasificación correcta usando un dataset de total concordancia entre expertos del área.

La reacción del acrosoma (RA), es un evento previo a la penetración de la zona pelúcida (ZP) y fusión de membranas durante la fecundación, está gobernado por la activación de proteasas, en especial por el sistema proacrosina/acrosina en mamíferos. La presencia de este sistema ya ha sido previamente descrito en espermatozoides de alpaca por Valdivia et al. (2000); sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué sistema de proteasas gobierna la RA en espermatozoides de alpaca ya que recientes estudios en espermatozoides humanos, caninos y bovinos han demostrado que enzimas con actividad tipo tripsina y quimotripsina gobiernan la RA. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diferentes inhibidores de enzimas tipo tripsina y quimotripsina sobre la RA y la actividad proteolítica en espermatozoides de alpaca, con la finalidad de conocer qué sistema enzimático gobierna al espermatozoide de alpaca. Se evaluó el efecto de tres inhibidores de enzimas semejantes a tripsina: Benzamidina (2, 4 y 6mM), Inhibidor de tripsina de frejol de soya (SBTI) (20, 40 y 60µM), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); y de un inhibidor de enzimas semejantes a quimotripsina: tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM). Se encontró que la RA y la actividad proteolítica fue más eficientemente inhibida por benzamidina (4mM) y PMSF (0.6mM), cuando estos fueron añadidos 10 minutos antes de la inducción de la reacción del acrosoma por lisofosfatidilcolina. TPCK no tuvo efecto alguno sobre la RA o la actividad proteolítica individual. Al evaluar los extractos ácidos (EAs) de espermatozoides de alpaca a pH3 en geles de actividad, se observó una gran banda de digestión de 55KDa, que corresponde a proacrosina. Los EAs fueron posteriormente activados con el incremento del pH 3 a pH 8. La activación del sistema proacrosina/acrosina fue evaluada a los 15, 30 minutos, 1, 1.5 y 2 horas de activación en geles de actividad. Se observaron tres bandas de digestión: de 55 KDa que corresponde a la proenzima proacrosina, una banda de 47 KDa que corresponde a α- acrosina y una banda de 39 KDa que corresponde a β-acrosina. Este ensayo reveló que a los 15 minutos el sistema proacrosina/acrosina está activo y que a la hora y media de activación la proenzima está completamente activada. La fusión de membranas acrosomales, la dispersión del contenido acrosomal y la actividad proteolítica de espermatozoide de alpaca está gobernada por el sistema enzimático tipo trispina proacrosina/acrosina. Palabras clave: actividad proteolítica, reacción del acrosoma, inhibidores tipo tripsina, inhibidores tipo quimotripsina, acrosina. / --- The acrosome reaction (AR), is an event needed to zona pellucida (ZP) penetration and membrane fusion during fertilization, is controlled by the activation of proteases, especially by the proacrosin/acrosin system in mammals. The presence of that system has been already described by Valdivia et al. (2000); however, to date it is unknown under which system the AR is controlled in alpaca’s sperm even though recent studies in human, canine and bovine sperm have demonstrated that trypsin-like and chymotrypsin-like enzymes controlled the AR. The aim of the present study is to evaluate the effect of different trypsin-like and chymotrypsin-like enzyme inhibitors on AR and individual proteolytic activity on alpaca’s spermatozoa in order to know under which system are the alpaca’s sperm controlled. The effect of three trypsin-like inhibitors: Benzamidine (2, 4 y 6mM), soybean trypsin inhibitor (SBTI) (20, 40 y 60µM), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); and one chymotrypsin-like inhibitor, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM) were tested. The AR and the individual proteolytic activity were more efficiently inhibited by benzamidine (4mM) and PMSF (0.6mM), when they were added 10 minutes before AR induction by Lysophosphatidilcoline. TPCK showed no effect on AR and proteolytic activity. Alpaca’s sperm acid extracts (AE) at pH3 were also evaluated on digestion gels, a 55KDa digestion band was observed, it would correspond to proacrosin. AEs were activated by increasing the pH from 3 to 8. The proacrosin/acrosin system activated was evaluated at 15, 30 minutes, 1, 1.5 and 2 hours on digestion gels. Three digestion bands were observed: 55KDa, corresponding to proacrosin, 47KDa corresponding to acrosin-α and 39KDa, corresponding to acrosin-β. This assay reveals that after 15 minutes, the proacrosin/acrosin system is activated and after one hour and a half proacrosin is fully activated. Acrosomal membrane fusion, acrosomal content dispersion and proteolytic activity from alpaca’s sperm are gobernated by an enzymatic trypsin-like proacrosin/acrosin system. Keywords: proteolytic activity, acrosome reaction, trypsin-like inhibitors, chymotrypsin-like inhibitors, acrosin.

El presente trabajo de tesis tiene como objetivo identificar y cuantificar las diferentes alteraciones morfológicas de espermatozoides de Argopecten purpuratus, ocasionadas por el proceso de criopreservación, y relacionarlas con su motilidad y capacidad de fecundación post-descongelamiento. Se utilizaron conchas de abanico maduras obtenidas de cultivos suspendidos de la Bahía la Herradura de Guayacán, Coquimbo-Chile. Se disectó la gónada y la porción masculina se cortó en trozos para liberar los espermatozoides en AMFE. Estos, fueron incubados en una solución crioprotectora compuesta por ME2SO al 10%, 125 mM de sacarosa y 10% de vitelo del huevo de gallina. Se congeló los espermatozoides a una tasa de 8,8 ºC/min. El descongelamiento se realizó 24 horas después mediante inmersión en un recipiente con agua a 50º C durante 20 seg y luego en otro a temperatura ambiente. Posteriormente se cuantificó el número de espermatozoides móviles en un microscopio de luz; también se cuantificó la cantidad de espermatozoides lesionados en la cabeza, acrosoma, pieza media y flagelo en un microscopio electrónico de barrido. Finalmente, se determinó la capacidad fecundante de los espermatozoides inseminando ovocitos frescos. La motilidad varió significativamente entre los tratamientos (C, PRE y POST) en cuanto a porcentaje de espermatozoides móviles y tiempo de actividad. Se observó distintas alteraciones en la morfología del espermatozoide congelado-descongelado. Algunas tuvieron la cabeza deforme, hinchada o lisada y la membrana celular plegada o rota. También fue observada, reacción acrosómica y mitocondrias fuera de su posición normal o ausentes. Pero las alteraciones más comunes se encontraron en el flagelo, el cual sufrió ruptura, rigidez y pérdida de su estructura lineal. En C y PRE el porcentaje de espermatozoides ilesos fue mayor (87,7 ± 3,4 % y 79,0 ± 3,0 % respectivamente), mientras que en POST fue 14,2 ± 2,8 %. La estructura lesionada en la mayor cantidad de espermatozoides POST, fue el flagelo (77,0 ± 3,0 %); el porcentaje de espermatozoides con lesión en la cabeza fue 55,1 ± 7,4 % y los que tuvieron el acrosoma reaccionado fueron 28,7 ± 3,3 %. La pieza media fue afectada en el 23,9 ± 4,1 % de espermatozoides. Los porcentajes de fecundación fueron 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % y 58,2 ± 7,3 % para C, PRE y POST respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre ellos. Se correlacionó la motilidad total cuantificada a los 5 y a los 30 minutos, las lesiones ocurridas en las diferentes estructuras espermáticas y los porcentajes de fecundación; encontrándose mayor correlación entre las alteraciones y la motilidad que entre las alteraciones y los porcentajes de fecundación. La correlación entre la motilidad y fecundación fue baja (0,650 y 0,668 con la motilidad a los 5 y 30 min respectivamente). La incubación durante el tiempo de equilibrio en la solución crioprotectora utilizada, no tiene un efecto tóxico que altere la motilidad o la morfología de los espermatozoides, sino más bien, tiene un efecto activador de la motilidad. Esta propiedad de la solución crioprotectora, se suma a la de protección, que les daría a los espermatozoides durante el congelamiento-descongelamiento, que es la etapa del proceso de criopreservación durante la cual los espermatozoide son afectado negativamente.. Las cabezas destrozadas de los espermatozoides sería consecuencia de la lisis celular o del crecimiento de cristales de hielo, todo esto como consecuencia de desórdenes osmóticos. La rigidez de los flagelos podría ser por alteraciones en la estructura del axonema. Posiblemente, la reacción acrosomal sería ocasionada por los cambios de polaridad ocurridos por el congelamiento-descongelamiento. En general, las lesiones en cualquiera de las estructuras espermáticas están relacionadas finalmente con la membrana celular. / The present work identifies and quantifies the morphological external alterations of spermatozoa of the scallop A. purpuratus due to long-term cryopreservation. Moreover, it relates the injuries to motility and fertilization capacity. Sexually mature scallops were collected from scallops farmed in La Herradura Bay, Coquimbo - Chile. The male portion of the gonad was cut in pieces (5 mm), which were after placed in a petri dish containing filtered sea water. Liberation of sperm was induced, which made it possible to obtain a spermatic solution. The sperm was equilibrated for 5 min in a crioprotective solution containing 10% ME2SO, 125 mM sucrose and 10% yolk of hen eggs diluted in sea water. Subsequently, the amples were frozen at a rate of 8,8 ºC/min. After 24 hours, the samples were firstly thawed while immersed for 20 seconds in water of 50º C, finally they were thawed while immersed in water at room temperature. The percentage of motility, fertilization of fresh oocytes and injured spermatozoa (in head, acrosome, middle piece and tail) were quantified with a light microscopy, stereoscopy and scanned electron microscopy, respectively. Both the freeze-thawing treatment and the post dilution time had significant effects on the spermatic motility. Moreover, it was observed a significant interaction between the post-dilution time and the freeze-thaw treatment (C, PRE o POST). Spermatozoa exposed to the pre-freezing treatment (PRE) remained motile for a longer while than the ones exposed to the control treatment (C). The motility in the spermatozoa in the post-thaw treatment was always much lower than in the PRE and C treatments. The morphology of the spermatozoids was affected in several ways by the freeze-thawing treatment. Some had their head deformed or swollen, others had their cell membrane folded or broken. Acrosome reaction, anomalous positions or absence of mitochondria were also observed. Broken or stiff or lineal structure loosed of tail were the most frequent injuries. The C and PRE had higher percentage of unhurt sperm (87,7 ± 3,4 % and 79,0 ± 3,0 % respectively), while the PRE samples had 14,2 ± 2,8 % of unhurt sperm. The tail was the spermatic structure that most commonly injured during the freezing-thawing process (77,0 ± 3,0 %). The percentage of sperm with head injury was 55,1 ± 7,4 % and with acrosome reaction was 28,7 ± 3,3 %. The middle piece was affected in 23,9 ± 4,1 % of the spermatozoa. The percentage of fertilization was 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % and 58,2 ± 7,3 % for C, PRE and POST respectively, which were not significantly different. The injuries were correlated with motility (at 5 and 30 min) and with fertilization success. There was a better correlation between injuries and motility than between injuries and fertilization success. The correlation between motility and fertilization was low (0,605 and 0,668 with motility at 5 min and 30 min respectively). The crioprotective solution did not have any toxic effects on the spermatozoa, on the contrary, it rather had an activating effect on motility. Moreover, the crioprotective solution provided protection during the freezing thawing process, which is a critical process in cryopreservation in which spermatozoa suffer of decreased motility. The crioprotective solution did not have a significant effect on the external morphology of the spermatozoa. Hence, again the freezing thawing process is causing the injuries. The heads destroyed of the spermatozoa would be consequence of the accumulation of ice crystals. The tails could be rigid due to alterations in the axonomic structure. Possibly the acrosome reaction could be by the bipolarity changes due to the process of freezing-thawing. As a rule, the injury in any structure of the spermatozoa is related to the cell membrane.

El proceso de criopreservación de espermatozoides es ampliamente usado en los programas de reproducción asistida y de mejora genética de diversas especies. La alpaca es una especie doméstica de importancia económica en nuestro país. Existen diversas técnicas para el manejo de esta especie con la finalidad de realizar un programa de mejora genética. En el caso de la criopreservación de espermatozoides, se ha trabajado tanto con espermatozoides de semen y de epidídimo, siendo más factible para el presente trabajo el uso de espermatozoides del epidídimo. Una característica que presentan los espermatozoides criopreservados en la mayoría de especies es una alteración a nivel de la membrana plasmática la cual conlleva a una reacción del acrosoma prematura, así como el descenso de la movilidad, provocando que el tiempo de vitalidad de estos espermatozoides sea muy reducido, todas estas alteraciones son producto de un tipo especial de capacitación llamada “Criocapacitación” que hasta la fecha, la posible causa, no ha sido definida. El objetivo de este estudio fue demostrar la presencia de un estado de Criocapacitación en espermatozoides criopreservados de alpaca, estudiando principalmente la movilidad, viabilidad, estabilidad de la membrana plasmática, el patrón de proteínas fosforiladas en residuos de tirosina, el estado del sistema Proacrosina-Acrosina y la capacidad de unión a zona pelúcida que tienen estos espermatozoides a diferencia de lo que presentan espermatozoides capacitados in vitro. Los resultados indican que la criopreservación afecta directamente la movilidad, viabilidad e integridad de membrana acrosomal, mostrando que tanto espermatozoides capacitados y criopreservados ofrecen un mismo patrón de proteínas fosforiladas, y que los espermatozoides criopreservados presentan una mayor cantidad de enzima activa (Acrosina) en la región del acrosoma. / The process of sperm cryopreservation is widely used in the programs of assisted reproduction and genetic improvement of many species. The alpaca is a domestic species of economic importance in our country. There are many techniques for managing this species in order to carry out a genetic improvement program. For the cryopreservation of sperm, samples of sperm from semen and epididymis have been used, being more feasible for the present study the use of sperm from the epididymis. One feature present in the cryopreserved sperm in most species is a disturbance at the plasma membrane which leads to a premature acrosome reaction, as well as declining mobility, making the lifetime of the sperm very small. All these changes are the result of a special type of process called "Cryocapacitation" that so far, the possible cause, has not been defined. The aim of this study was to demonstrate the presence of a state of cryocapacitation on Alapaca’s cryopreserved spermatozoa, studying mainly mobility, viability and stability of the plasma membrane, the pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues, the state of Proacrosin-Acrosin system and the ability of binding to pellucida zone that have these cryopreserved sperm and compare these results with those from capacitated in vitro sperm. The results indicate that cryopreservation directly affects mobility, viability and integrity of acrosomal membrane, showing that both capacitated in vitro and cryopreserved sperm offered the same pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues and that cryopreserved sperm has an increment of active enzyme (Acrosin) in the acrosome region.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del momento de adición del glicerol durante la curva de enfriamiento sobre la calidad espermática del semen canino. Para esto se utilizaron 15 eyaculados de 4 perros adultos. Se evaluó la motilidad, volumen, concentración espermática e integridad funcional de membrana de cada eyaculado. Cada muestra de semen fue sometida a 3 métodos de adición del glicerol (Tratamiento 1, Tratamiento 2 y Tratamiento 3) los cuales se diferenciaron por la concentración de glicerol presente en el dilutor durante la curva de enfriamiento. En el Tratamiento 1 el total del glicerol se adicionó al inicio de la curva de enfriamiento, en el Tratamiento 2 se adicionó una fracción del glicerol total al inicio de la curva de enfriamiento y la fracción restante al final de la curva, finalmente en el Tratamiento 3 el glicerol se añadió al final de la curva de enfriamiento. Finalizada la curva de enfriamiento el semen se envaso en pajillas de 0.5 mL para proceder al congelamiento en nitrógeno liquido. La motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana fueron los parámetros utilizados para evaluar la calidad seminal al descongelamiento. No se encontró diferencia estadística entre ninguno de los 3 métodos de adición del glicerol, a pesar de esto el Tratamiento 1 mantenía ligeramente mejor la motilidad y la integridad funcional de membrana (44% y 46%) en comparación con el Tratamiento 2 (37% y 36%) y el Tratamiento 3 (38% y 37%). Esto nos demuestra que el momento de adición del glicerol no influye de manera diferencial sobre la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana pudiéndose gracias a esto simplificar el proceso de criopreservación al añadir el glicerol al inicio de la curva de enfriamiento pues ya no se manipularía el semen hasta el envasado. / The objetive of this experiment was to evaluate the effect of the moment of addition of the glycerol during the curve of cooling on the spermatic quality of the canine semen. For this there were used 15 ejaculated of 4 adult dogs. There was evaluated the motility, volume, spermatic concentration and functional integrity of membrane of every ejaculated. Every sample of semen was submitted to 3 methods of addition of the glycerol (Treatment 1, Treatment 2 and Treatment 3) which differentiated for the concentration of glicerol present in the dilutor during the curve of cooling. In the Treatment 1 the whole of the glycerol was added to the beginning of the curve of cooling, in the Treatment 2 added to himself a fraction of the entire glycerol to the beginning of the curve of cooling and the remaining fraction at the end of the curve, finally in the Treatment 3 the glycerol was added at the end of the curve of cooling. Finished the curve of cooling the semen was packed in straw hats of 0.5 ml to proceed to the freezing in liquid nitrogen. The progressive motility and the functional integrity of membrane were the parameters used to evaluate the seminal quality to the post-thawing. There was not statistical difference between any of 3 methods of addition of the glicerol, in spite of this the Treatment 1 was keeping lightly better the motility and the functional integrity of membrane (44 % and 46 %) compared to the Treatment 2 (37 % and 36 %) and the Treatment 3 (38 % and 37 %). This demonstrates us that the moment of addition of the glycerol does not influence in a distinguishing way the progressive motility and the functional integrity of membrane being able thanks to this to simplify the process of criopreservación after the glycerol to add to the beginning of the curve of cooling since the semen would not be already manipulated up to the stiff one.

El proceso de criopreservación de espermatozoides es ampliamente usado en los programas de reproducción asistida y de mejora genética de diversas especies. La alpaca es una especie doméstica de importancia económica en nuestro país. Existen diversas técnicas para el manejo de esta especie con la finalidad de realizar un programa de mejora genética. En el caso de la criopreservación de espermatozoides, se ha trabajado tanto con espermatozoides de semen y de epidídimo, siendo más factible para el presente trabajo el uso de espermatozoides del epidídimo. Una característica que presentan los espermatozoides criopreservados en la mayoría de especies es una alteración a nivel de la membrana plasmática la cual conlleva a una reacción del acrosoma prematura, así como el descenso de la movilidad, provocando que el tiempo de vitalidad de estos espermatozoides sea muy reducido, todas estas alteraciones son producto de un tipo especial de capacitación llamada “Criocapacitación” que hasta la fecha, la posible causa, no ha sido definida. El objetivo de este estudio fue demostrar la presencia de un estado de Criocapacitación en espermatozoides criopreservados de alpaca, estudiando principalmente la movilidad, viabilidad, estabilidad de la membrana plasmática, el patrón de proteínas fosforiladas en residuos de tirosina, el estado del sistema Proacrosina-Acrosina y la capacidad de unión a zona pelúcida que tienen estos espermatozoides a diferencia de lo que presentan espermatozoides capacitados in vitro. Los resultados indican que la criopreservación afecta directamente la movilidad, viabilidad e integridad de membrana acrosomal, mostrando que tanto espermatozoides capacitados y criopreservados ofrecen un mismo patrón de proteínas fosforiladas, y que los espermatozoides criopreservados presentan una mayor cantidad de enzima activa (Acrosina) en la región del acrosoma. / -- The process of sperm cryopreservation is widely used in the programs of assisted reproduction and genetic improvement of many species. The alpaca is a domestic species of economic importance in our country. There are many techniques for managing this species in order to carry out a genetic improvement program. For the cryopreservation of sperm, samples of sperm from semen and epididymis have been used, being more feasible for the present study the use of sperm from the epididymis. One feature present in the cryopreserved sperm in most species is a disturbance at the plasma membrane which leads to a premature acrosome reaction, as well as declining mobility, making the lifetime of the sperm very small. All these changes are the result of a special type of process called "Cryocapacitation" that so far, the possible cause, has not been defined. The aim of this study was to demonstrate the presence of a state of cryocapacitation on Alapaca’s cryopreserved spermatozoa, studying mainly mobility, viability and stability of the plasma membrane, the pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues, the state of Proacrosin-Acrosin system and the ability of binding to pellucida zone that have these cryopreserved sperm and compare these results with those from capacitated in vitro sperm. The results indicate that cryopreservation directly affects mobility, viability and integrity of acrosomal membrane, showing that both capacitated in vitro and cryopreserved sperm offered the same pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues and that cryopreserved sperm has an increment of active enzyme (Acrosin) in the acrosome region. / Tesis

Determina la concentración óptima del glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido en la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. El análisis estadístico de los tres primeros experimentos se realiza mediante un modelo de regresión polinomial quíntuple, se obtiene la concentración óptima de 1.16, 1.02 y 0.9 M para el glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido respectivamente. El cuarto experimento determina cuál de los crioprotectores criopreservaba mejor la motilidad, integridad de membrana plasmática y viabilidad e integridad acrosomal de los espermatozoides epididimarios. Está conformado por las concentraciones óptimas de los tres crioprotectores y en este se utiliza un análisis de varianza, además de la Prueba de Tukey. Concluye que las concentraciones de 0.9 M de DMSO y 1.16 M de glicerol conservan mejor las características espermáticas antes mencionadas a diferencia de la concentración de 1.02 M de etilenglicol. / Tesis

Espermatozoides criopreservados de Vicugna pacos “alpaca” fueron sometidos a condiciones estresantes que estarían asociadas con una sobreproducción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y una disminución de su capacidad antioxidante lo que conlleva a la peroxidación lipídica de sus membranas reduciendo su viabilidad celular. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del suplemento α–Tocoferol en la movilidad, vitalidad, integridad funcional de membrana (HOST) e integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca congelados/descongelados. Espermatozoides epididimarios obtenidos de 16 alpacas fueron criopreservados en medio TES-Tris-yema suplementado con distintas concentraciones de α–Tocoferol (0, 200, 500 y 1000 μg/mL usando el procedimiento de congelamiento lento en pajillas y almacenados a -196 ºC por un periodo mínimo de 30 días. Los resultados mostraron que los valores de motilidad espermática en los grupos suplementados fueron significativamente (p<0.05) mayores que el grupo no suplementado. El diluyente suplementado con 200 μg/mL de α–Tocoferol tuvo un valor de vitalidad significativamente más alto que con las otras concentraciones (p<0.05). Los porcentajes de HOST y acrosoma intacto fueron significativamente mejorados (p<0.05) por la suplementación con 200 μg/mL de α–Tocoferol comparado con el grupo control. En conclusión, α–Tocoferol, como suplemento, a una concentración de 200 μg/mL en el diluyente TES-Tris-yema durante la criopreservación tuvo un efecto positivo en la calidad espermática post-descongelamiento. / -- Cryopreserved sperm of Vicugna pacos “alpaca” were subjected to stressful conditions that would be associated with an overproduction of reactive oxygen species (ROS) and a decrease in antioxidant capacity which leads to lipid peroxidation of the membrane reducing cell viability. The aim of this study was to investigate the effect of α–Tocopherol supplementation on movility, viability, functional integrity of the membrane and acrosomal integrity of frozen/thawed alpaca sperm. Epididymal sperm collected from 16 alpacas were cryopreserved in TES-Tris-yolk medium supplemented with different concentrations of α–Tocopherol (0, 200, 500 and 1000 μg/mL, using the slow freezing procedure in straws and stored at -196 °C for a minimum period of 30 days. The results showed that the sperm motility values in the supplemented groups were significantly (p<0.05) higher than that unsupplemented group. The extender supplemented with 200μg/mL of α–Tocopherol had a vitality value significantly higher than that of other concentrations (p<0.05). The percentages of HOST and acrosome intact were significantly improved by supplementing with 200 μg/mL of α–Tocopherol compared with control group. In conclusion, α-Tocopherol, supplemented at 200 μg/mL concentration in TES-Tris-yema extender during cryopreservation had a positive effect on post-thawed sperm quality. / Tesis

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del momento de adición del glicerol durante la curva de enfriamiento sobre la calidad espermática del semen canino. Para esto se utilizaron 15 eyaculados de 4 perros adultos. Se evaluó la motilidad, volumen, concentración espermática e integridad funcional de membrana de cada eyaculado. Cada muestra de semen fue sometida a 3 métodos de adición del glicerol (Tratamiento 1, Tratamiento 2 y Tratamiento 3) los cuales se diferenciaron por la concentración de glicerol presente en el dilutor durante la curva de enfriamiento. En el Tratamiento 1 el total del glicerol se adicionó al inicio de la curva de enfriamiento, en el Tratamiento 2 se adicionó una fracción del glicerol total al inicio de la curva de enfriamiento y la fracción restante al final de la curva, finalmente en el Tratamiento 3 el glicerol se añadió al final de la curva de enfriamiento. Finalizada la curva de enfriamiento el semen se envaso en pajillas de 0.5 mL para proceder al congelamiento en nitrógeno liquido. La motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana fueron los parámetros utilizados para evaluar la calidad seminal al descongelamiento. No se encontró diferencia estadística entre ninguno de los 3 métodos de adición del glicerol, a pesar de esto el Tratamiento 1 mantenía ligeramente mejor la motilidad y la integridad funcional de membrana (44% y 46%) en comparación con el Tratamiento 2 (37% y 36%) y el Tratamiento 3 (38% y 37%). Esto nos demuestra que el momento de adición del glicerol no influye de manera diferencial sobre la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana pudiéndose gracias a esto simplificar el proceso de criopreservación al añadir el glicerol al inicio de la curva de enfriamiento pues ya no se manipularía el semen hasta el envasado. / --- The objetive of this experiment was to evaluate the effect of the moment of addition of the glycerol during the curve of cooling on the spermatic quality of the canine semen. For this there were used 15 ejaculated of 4 adult dogs. There was evaluated the motility, volume, spermatic concentration and functional integrity of membrane of every ejaculated. Every sample of semen was submitted to 3 methods of addition of the glycerol (Treatment 1, Treatment 2 and Treatment 3) which differentiated for the concentration of glicerol present in the dilutor during the curve of cooling. In the Treatment 1 the whole of the glycerol was added to the beginning of the curve of cooling, in the Treatment 2 added to himself a fraction of the entire glycerol to the beginning of the curve of cooling and the remaining fraction at the end of the curve, finally in the Treatment 3 the glycerol was added at the end of the curve of cooling. Finished the curve of cooling the semen was packed in straw hats of 0.5 ml to proceed to the freezing in liquid nitrogen. The progressive motility and the functional integrity of membrane were the parameters used to evaluate the seminal quality to the post-thawing. There was not statistical difference between any of 3 methods of addition of the glicerol, in spite of this the Treatment 1 was keeping lightly better the motility and the functional integrity of membrane (44 % and 46 %) compared to the Treatment 2 (37 % and 36 %) and the Treatment 3 (38 % and 37 %). This demonstrates us that the moment of addition of the glycerol does not influence in a distinguishing way the progressive motility and the functional integrity of membrane being able thanks to this to simplify the process of criopreservación after the glycerol to add to the beginning of the curve of cooling since the semen would not be already manipulated up to the stiff one. / Tesis

El presente trabajo de tesis tiene como objetivo identificar y cuantificar las diferentes alteraciones morfológicas de espermatozoides de Argopecten purpuratus, ocasionadas por el proceso de criopreservación, y relacionarlas con su motilidad y capacidad de fecundación post-descongelamiento. Se utilizaron conchas de abanico maduras obtenidas de cultivos suspendidos de la Bahía la Herradura de Guayacán, Coquimbo-Chile. Se disectó la gónada y la porción masculina se cortó en trozos para liberar los espermatozoides en AMFE. Estos, fueron incubados en una solución crioprotectora compuesta por ME2SO al 10%, 125 mM de sacarosa y 10% de vitelo del huevo de gallina. Se congeló los espermatozoides a una tasa de 8,8 ºC/min. El descongelamiento se realizó 24 horas después mediante inmersión en un recipiente con agua a 50º C durante 20 seg y luego en otro a temperatura ambiente. Posteriormente se cuantificó el número de espermatozoides móviles en un microscopio de luz; también se cuantificó la cantidad de espermatozoides lesionados en la cabeza, acrosoma, pieza media y flagelo en un microscopio electrónico de barrido. Finalmente, se determinó la capacidad fecundante de los espermatozoides inseminando ovocitos frescos. La motilidad varió significativamente entre los tratamientos (C, PRE y POST) en cuanto a porcentaje de espermatozoides móviles y tiempo de actividad. Se observó distintas alteraciones en la morfología del espermatozoide congelado-descongelado. Algunas tuvieron la cabeza deforme, hinchada o lisada y la membrana celular plegada o rota. También fue observada, reacción acrosómica y mitocondrias fuera de su posición normal o ausentes. Pero las alteraciones más comunes se encontraron en el flagelo, el cual sufrió ruptura, rigidez y pérdida de su estructura lineal. En C y PRE el porcentaje de espermatozoides ilesos fue mayor (87,7 ± 3,4 % y 79,0 ± 3,0 % respectivamente), mientras que en POST fue 14,2 ± 2,8 %. La estructura lesionada en la mayor cantidad de espermatozoides POST, fue el flagelo (77,0 ± 3,0 %); el porcentaje de espermatozoides con lesión en la cabeza fue 55,1 ± 7,4 % y los que tuvieron el acrosoma reaccionado fueron 28,7 ± 3,3 %. La pieza media fue afectada en el 23,9 ± 4,1 % de espermatozoides. Los porcentajes de fecundación fueron 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % y 58,2 ± 7,3 % para C, PRE y POST respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre ellos. Se correlacionó la motilidad total cuantificada a los 5 y a los 30 minutos, las lesiones ocurridas en las diferentes estructuras espermáticas y los porcentajes de fecundación; encontrándose mayor correlación entre las alteraciones y la motilidad que entre las alteraciones y los porcentajes de fecundación. La correlación entre la motilidad y fecundación fue baja (0,650 y 0,668 con la motilidad a los 5 y 30 min respectivamente). La incubación durante el tiempo de equilibrio en la solución crioprotectora utilizada, no tiene un efecto tóxico que altere la motilidad o la morfología de los espermatozoides, sino más bien, tiene un efecto activador de la motilidad. Esta propiedad de la solución crioprotectora, se suma a la de protección, que les daría a los espermatozoides durante el congelamiento-descongelamiento, que es la etapa del proceso de criopreservación durante la cual los espermatozoide son afectado negativamente.. Las cabezas destrozadas de los espermatozoides sería consecuencia de la lisis celular o del crecimiento de cristales de hielo, todo esto como consecuencia de desórdenes osmóticos. La rigidez de los flagelos podría ser por alteraciones en la estructura del axonema. Posiblemente, la reacción acrosomal sería ocasionada por los cambios de polaridad ocurridos por el congelamiento-descongelamiento. En general, las lesiones en cualquiera de las estructuras espermáticas están relacionadas finalmente con la membrana celular. / --- The present work identifies and quantifies the morphological external alterations of spermatozoa of the scallop A. purpuratus due to long-term cryopreservation. Moreover, it relates the injuries to motility and fertilization capacity. Sexually mature scallops were collected from scallops farmed in La Herradura Bay, Coquimbo - Chile. The male portion of the gonad was cut in pieces (5 mm), which were after placed in a petri dish containing filtered sea water. Liberation of sperm was induced, which made it possible to obtain a spermatic solution. The sperm was equilibrated for 5 min in a crioprotective solution containing 10% ME2SO, 125 mM sucrose and 10% yolk of hen eggs diluted in sea water. Subsequently, the amples were frozen at a rate of 8,8 ºC/min. After 24 hours, the samples were firstly thawed while immersed for 20 seconds in water of 50º C, finally they were thawed while immersed in water at room temperature. The percentage of motility, fertilization of fresh oocytes and injured spermatozoa (in head, acrosome, middle piece and tail) were quantified with a light microscopy, stereoscopy and scanned electron microscopy, respectively. Both the freeze-thawing treatment and the post dilution time had significant effects on the spermatic motility. Moreover, it was observed a significant interaction between the post-dilution time and the freeze-thaw treatment (C, PRE o POST). Spermatozoa exposed to the pre-freezing treatment (PRE) remained motile for a longer while than the ones exposed to the control treatment (C). The motility in the spermatozoa in the post-thaw treatment was always much lower than in the PRE and C treatments. The morphology of the spermatozoids was affected in several ways by the freeze-thawing treatment. Some had their head deformed or swollen, others had their cell membrane folded or broken. Acrosome reaction, anomalous positions or absence of mitochondria were also observed. Broken or stiff or lineal structure loosed of tail were the most frequent injuries. The C and PRE had higher percentage of unhurt sperm (87,7 ± 3,4 % and 79,0 ± 3,0 % respectively), while the PRE samples had 14,2 ± 2,8 % of unhurt sperm. The tail was the spermatic structure that most commonly injured during the freezing-thawing process (77,0 ± 3,0 %). The percentage of sperm with head injury was 55,1 ± 7,4 % and with acrosome reaction was 28,7 ± 3,3 %. The middle piece was affected in 23,9 ± 4,1 % of the spermatozoa. The percentage of fertilization was 68,3 ± 6,6 %, 67,9 ± 4,2 % and 58,2 ± 7,3 % for C, PRE and POST respectively, which were not significantly different. The injuries were correlated with motility (at 5 and 30 min) and with fertilization success. There was a better correlation between injuries and motility than between injuries and fertilization success. The correlation between motility and fertilization was low (0,605 and 0,668 with motility at 5 min and 30 min respectively). The crioprotective solution did not have any toxic effects on the spermatozoa, on the contrary, it rather had an activating effect on motility. Moreover, the crioprotective solution provided protection during the freezing thawing process, which is a critical process in cryopreservation in which spermatozoa suffer of decreased motility. The crioprotective solution did not have a significant effect on the external morphology of the spermatozoa. Hence, again the freezing thawing process is causing the injuries. The heads destroyed of the spermatozoa would be consequence of the accumulation of ice crystals. The tails could be rigid due to alterations in the axonomic structure. Possibly the acrosome reaction could be by the bipolarity changes due to the process of freezing-thawing. As a rule, the injury in any structure of the spermatozoa is related to the cell membrane. / Tesis