La reacción del acrosoma (RA), es un evento previo a la penetración de la zona pelúcida (ZP) y fusión de membranas durante la fecundación, está gobernado por la activación de proteasas, en especial por el sistema proacrosina/acrosina en mamíferos. La presencia de este sistema ya ha sido previamente descrito en espermatozoides de alpaca por Valdivia et al. (2000); sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué sistema de proteasas gobierna la RA en espermatozoides de alpaca ya que recientes estudios en espermatozoides humanos, caninos y bovinos han demostrado que enzimas con actividad tipo tripsina y quimotripsina gobiernan la RA. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diferentes inhibidores de enzimas tipo tripsina y quimotripsina sobre la RA y la actividad proteolítica en espermatozoides de alpaca, con la finalidad de conocer qué sistema enzimático gobierna al espermatozoide de alpaca. Se evaluó el efecto de tres inhibidores de enzimas semejantes a tripsina: Benzamidina (2, 4 y 6mM), Inhibidor de tripsina de frejol de soya (SBTI) (20, 40 y 60µM), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); y de un inhibidor de enzimas semejantes a quimotripsina: tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM). Se encontró que la RA y la actividad proteolítica fue más eficientemente inhibida por benzamidina (4mM) y PMSF (0.6mM), cuando estos fueron añadidos 10 minutos antes de la inducción de la reacción del acrosoma por lisofosfatidilcolina. TPCK no tuvo efecto alguno sobre la RA o la actividad proteolítica individual. Al evaluar los extractos ácidos (EAs) de espermatozoides de alpaca a pH3 en geles de actividad, se observó una gran banda de digestión de 55KDa, que corresponde a proacrosina. Los EAs fueron posteriormente activados con el incremento del pH 3 a pH 8. La activación del sistema proacrosina/acrosina fue evaluada a los 15, 30 minutos, 1, 1.5 y 2 horas de activación en geles de actividad. Se observaron tres bandas de digestión: de 55 KDa que corresponde a la proenzima proacrosina, una banda de 47 KDa que corresponde a α- acrosina y una banda de 39 KDa que corresponde a β-acrosina. Este ensayo reveló que a los 15 minutos el sistema proacrosina/acrosina está activo y que a la hora y media de activación la proenzima está completamente activada. La fusión de membranas acrosomales, la dispersión del contenido acrosomal y la actividad proteolítica de espermatozoide de alpaca está gobernada por el sistema enzimático tipo trispina proacrosina/acrosina. Palabras clave: actividad proteolítica, reacción del acrosoma, inhibidores tipo tripsina, inhibidores tipo quimotripsina, acrosina. / --- The acrosome reaction (AR), is an event needed to zona pellucida (ZP) penetration and membrane fusion during fertilization, is controlled by the activation of proteases, especially by the proacrosin/acrosin system in mammals. The presence of that system has been already described by Valdivia et al. (2000); however, to date it is unknown under which system the AR is controlled in alpaca’s sperm even though recent studies in human, canine and bovine sperm have demonstrated that trypsin-like and chymotrypsin-like enzymes controlled the AR. The aim of the present study is to evaluate the effect of different trypsin-like and chymotrypsin-like enzyme inhibitors on AR and individual proteolytic activity on alpaca’s spermatozoa in order to know under which system are the alpaca’s sperm controlled. The effect of three trypsin-like inhibitors: Benzamidine (2, 4 y 6mM), soybean trypsin inhibitor (SBTI) (20, 40 y 60µM), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); and one chymotrypsin-like inhibitor, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM) were tested. The AR and the individual proteolytic activity were more efficiently inhibited by benzamidine (4mM) and PMSF (0.6mM), when they were added 10 minutes before AR induction by Lysophosphatidilcoline. TPCK showed no effect on AR and proteolytic activity. Alpaca’s sperm acid extracts (AE) at pH3 were also evaluated on digestion gels, a 55KDa digestion band was observed, it would correspond to proacrosin. AEs were activated by increasing the pH from 3 to 8. The proacrosin/acrosin system activated was evaluated at 15, 30 minutes, 1, 1.5 and 2 hours on digestion gels. Three digestion bands were observed: 55KDa, corresponding to proacrosin, 47KDa corresponding to acrosin-α and 39KDa, corresponding to acrosin-β. This assay reveals that after 15 minutes, the proacrosin/acrosin system is activated and after one hour and a half proacrosin is fully activated. Acrosomal membrane fusion, acrosomal content dispersion and proteolytic activity from alpaca’s sperm are gobernated by an enzymatic trypsin-like proacrosin/acrosin system. Keywords: proteolytic activity, acrosome reaction, trypsin-like inhibitors, chymotrypsin-like inhibitors, acrosin.

El proceso de criopreservación de espermatozoides es ampliamente usado en los programas de reproducción asistida y de mejora genética de diversas especies. La alpaca es una especie doméstica de importancia económica en nuestro país. Existen diversas técnicas para el manejo de esta especie con la finalidad de realizar un programa de mejora genética. En el caso de la criopreservación de espermatozoides, se ha trabajado tanto con espermatozoides de semen y de epidídimo, siendo más factible para el presente trabajo el uso de espermatozoides del epidídimo. Una característica que presentan los espermatozoides criopreservados en la mayoría de especies es una alteración a nivel de la membrana plasmática la cual conlleva a una reacción del acrosoma prematura, así como el descenso de la movilidad, provocando que el tiempo de vitalidad de estos espermatozoides sea muy reducido, todas estas alteraciones son producto de un tipo especial de capacitación llamada “Criocapacitación” que hasta la fecha, la posible causa, no ha sido definida. El objetivo de este estudio fue demostrar la presencia de un estado de Criocapacitación en espermatozoides criopreservados de alpaca, estudiando principalmente la movilidad, viabilidad, estabilidad de la membrana plasmática, el patrón de proteínas fosforiladas en residuos de tirosina, el estado del sistema Proacrosina-Acrosina y la capacidad de unión a zona pelúcida que tienen estos espermatozoides a diferencia de lo que presentan espermatozoides capacitados in vitro. Los resultados indican que la criopreservación afecta directamente la movilidad, viabilidad e integridad de membrana acrosomal, mostrando que tanto espermatozoides capacitados y criopreservados ofrecen un mismo patrón de proteínas fosforiladas, y que los espermatozoides criopreservados presentan una mayor cantidad de enzima activa (Acrosina) en la región del acrosoma. / The process of sperm cryopreservation is widely used in the programs of assisted reproduction and genetic improvement of many species. The alpaca is a domestic species of economic importance in our country. There are many techniques for managing this species in order to carry out a genetic improvement program. For the cryopreservation of sperm, samples of sperm from semen and epididymis have been used, being more feasible for the present study the use of sperm from the epididymis. One feature present in the cryopreserved sperm in most species is a disturbance at the plasma membrane which leads to a premature acrosome reaction, as well as declining mobility, making the lifetime of the sperm very small. All these changes are the result of a special type of process called "Cryocapacitation" that so far, the possible cause, has not been defined. The aim of this study was to demonstrate the presence of a state of cryocapacitation on Alapaca’s cryopreserved spermatozoa, studying mainly mobility, viability and stability of the plasma membrane, the pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues, the state of Proacrosin-Acrosin system and the ability of binding to pellucida zone that have these cryopreserved sperm and compare these results with those from capacitated in vitro sperm. The results indicate that cryopreservation directly affects mobility, viability and integrity of acrosomal membrane, showing that both capacitated in vitro and cryopreserved sperm offered the same pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues and that cryopreserved sperm has an increment of active enzyme (Acrosin) in the acrosome region.

En las zonas alto-andinas del Perú, donde la agricultura y ganadería común no son viables, la crianza de camélidos, como la alpaca, constituye el único medio de subsistencia y principal actividad económica de las familias campesinas. Por tanto, el estudio de la fisiología reproductiva de la alpaca es indispensable para el establecimiento de proyectos de mejoramiento genético y reproducción asistida. Las proteínas que participan en la interacción de los gametos de las alpacas son desconocidas, es por ello que el presente trabajo planteó determinar la expresión proteica y la caracterización de una proteína de Zona Pelúcida (ZP) que induzca espontáneamente la reacción acrosómica (RA) en ovocitos de alpacas. En la mayoría de mamíferos la ZP está conformada por tres glicoproteínas ZP1, ZP2 y ZP3. En el presente trabajo se demostró que en las alpacas existen también 3 glicoproteínas con pesos moleculares de 110 kDa, 75 kDa y 65 kDa correspondientes a ZP1a, ZP2a y ZP3a, respectivamente. La ZP3 es el agonista natural de la RA en espermatozoides de la misma especie, sin embargo, los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que ZP3a es capaz de inducir la RA tanto en espermatozoides de ratón como en los de su propia especie. De esta manera, este estudio ayuda al mejor entendimiento de la naturaleza de las glicoproteínas de ZP en alpacas. / In areas of high-Andean Peru, where agriculture and livestock are not viable, the breeding of camels, such as alpaca is the only means of livelihood and main economic activity of farm households. Therefore, the study of the reproductive physiology of alpacas is essential to the establishment of projects in assisted reproduction and genetic improvement. The proteins involved in the interaction of the alpaca’s gametes are unknown; therefore the present determined the protein expression and characterization of a zona pellucida (ZP), which induce the spontaneous acrosome reaction (AR) in oocytes of alpacas. In most mammals, the zona pellucida (ZP) is composed by three glycoproteins ZP1, ZP2 and ZP3. In this research demonstrated that in Alpacas there are also 3 glycoproteins with molecular weights of 110 kDa, 75 kDa and 65 kDa corresponding to aZP1, aZP2 and aZP3, respectively. ZP3 is the natural agonist of the acrosome reaction (AR) in spermatozoa of the same species, however, our results obtained in this research showed that aZP3 can also induce RA in mouse sperm and in their own species. Therefore, this study helps to better understand the nature of the zona pellucida glycoproteins in alpacas.

El presente trabajo consta de 3 experimentos y tuvo como objetivo principal evaluar el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante los procesos de criopreservación y vitrificación de espermatozoides de alpaca sobre parámetros de funcionalidad espermática. En el Experimento 1, 15 muestras espermáticas obtenidas de la cola del epidídimo y 5 muestras de semen de alpaca fueron vitrificadas en medios Tris base y HTF utilizando diferentes azúcares (fructosa, sacarosa y trehalosa) en 3 concentraciones diferentes (0.25, 0.5 y 1.0 M). Se obtuvo menos de 1% de motilidad y menos de 5% de viabilidad utilizando el medio HTF. En el Experimento 2, 6 muestras de espermatozoides frescos de alpaca fueron incubados durante 3 horas a 37 °C en un medio Tris-base junto con polimorfos nucleares (PMN) activados con 100 nM de PMA (Phorbol myristate acetate) para inducir la formación de ROS. Se demostró que la motilidad espermática se reduce significativamente (p< 0.05) en el grupo con polimorfos activados (13.67%) en comparación con el grupo control (22.42%). En el Experimento 3, se evaluó el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante el proceso de criopreservación en un medio en base a leche descremada y etilenglicol, encontrando que con la adición de Tempo y Tempol se obtiene una mayor (p<0.05) motilidad espermática en comparación al grupo control (19.63% y 22.57% vs. 10.62%), mayores porcentajes (p<0.05) de integridad de membrana (14.31% y 13.08% vs. 10.38%) y se obtiene (p<0.05) mayores porcentajes de espermatozoides con ADN no fragmentado (74.20% y 83.76% vs. 63.68%). La variable espermática de vitalidad/integridad acrosomal no fue afectada significativamente por la adición de los antioxidantes Tempo y Tempol. Se concluye que la incubación de espermatozoides de alpaca incubados con PMN activados con PMA tienen un efecto nocivo en la motilidad espermática, y que durante la criopreservación de semen la pérdida de motilidad espermática, pérdida de integridad funcional de membrana y aumento de la fragmentación de ADN espermático pueden ser prevenidos parcialmente mediante la utilización delos antioxidantes Tempo ó Tempol como parte del dilutor de semen. -- Palabras clave: Espermatozoides, alpaca, criopreservación, ROS, antioxidante, tempo, tempol. / -- The present study had 3 experiments and the main objective were to evaluate the effect of two superoxide dismutase mimics (Tempo and Tempol) during semen sperm cryopreservation and vitrification on alpaca sperm function. In Experiment 1, vitrification of alpaca sperm was evaluated using extenders based on Tris solution and HTF, with different sugars as cryoprotectants (fructose, sucrose, and trehalose) in different concentrations (0.25, 0.5 y 1.0 M). Only few spermatozoa motile (<1%) and viable (<5%) were found in group HTF.In Experimental 2, six samples of fresh alpaca sperm were incubated during 3 hours at 37 °C on a medium based on Tris with polymorphonuclear activated by 100 mM PMA (phorbol myristate acetate) to induce ROS production. Sperm motility was significantly reduced (p< 0.05) when sperm were incubated on a medium con high levels of ROS (13.67%) in comparison with control group (22.42%). In Experiment 3, two superoxide dismutaseanalogues (antioxidants Tempo and Tempol) were evaluated during cryopreservation process on an extender based on skim milk and ethylene glycol. Addition of Tempo or Tempol result in higher (p< 0.05) sperm motility in comparison than control group (19.63% and 22.57% vs. 10.62%). Functional sperm membrane integrity were also higher (p<0.05) in groups Tempo (14.31%) and Tempol (13.08) than control group (10.38%). In the same way, DNA integrity washigher (p< 0.05) in groups Tempo (74.20%) and Tempol (83.76%) than control group (63.68%). Viability and acrosomal integrity were not affected by cryopreservation with superoxide dismutase analogues. We conclude that alpaca sperm incubation on PMN activated by PMA had a detrimental effect on alpaca sperm motility, and that motility, functional sperm membrane integrity and DNA integrity could be partially protected by administration of Tempo or Tempol as components of extender for cryopreservation alpaca semen. -- Key words: Sperm, alpaca, cryopreservation, ROS, antioxidant, tempo, tempol / Tesis

El proceso de criopreservación de espermatozoides es ampliamente usado en los programas de reproducción asistida y de mejora genética de diversas especies. La alpaca es una especie doméstica de importancia económica en nuestro país. Existen diversas técnicas para el manejo de esta especie con la finalidad de realizar un programa de mejora genética. En el caso de la criopreservación de espermatozoides, se ha trabajado tanto con espermatozoides de semen y de epidídimo, siendo más factible para el presente trabajo el uso de espermatozoides del epidídimo. Una característica que presentan los espermatozoides criopreservados en la mayoría de especies es una alteración a nivel de la membrana plasmática la cual conlleva a una reacción del acrosoma prematura, así como el descenso de la movilidad, provocando que el tiempo de vitalidad de estos espermatozoides sea muy reducido, todas estas alteraciones son producto de un tipo especial de capacitación llamada “Criocapacitación” que hasta la fecha, la posible causa, no ha sido definida. El objetivo de este estudio fue demostrar la presencia de un estado de Criocapacitación en espermatozoides criopreservados de alpaca, estudiando principalmente la movilidad, viabilidad, estabilidad de la membrana plasmática, el patrón de proteínas fosforiladas en residuos de tirosina, el estado del sistema Proacrosina-Acrosina y la capacidad de unión a zona pelúcida que tienen estos espermatozoides a diferencia de lo que presentan espermatozoides capacitados in vitro. Los resultados indican que la criopreservación afecta directamente la movilidad, viabilidad e integridad de membrana acrosomal, mostrando que tanto espermatozoides capacitados y criopreservados ofrecen un mismo patrón de proteínas fosforiladas, y que los espermatozoides criopreservados presentan una mayor cantidad de enzima activa (Acrosina) en la región del acrosoma. / -- The process of sperm cryopreservation is widely used in the programs of assisted reproduction and genetic improvement of many species. The alpaca is a domestic species of economic importance in our country. There are many techniques for managing this species in order to carry out a genetic improvement program. For the cryopreservation of sperm, samples of sperm from semen and epididymis have been used, being more feasible for the present study the use of sperm from the epididymis. One feature present in the cryopreserved sperm in most species is a disturbance at the plasma membrane which leads to a premature acrosome reaction, as well as declining mobility, making the lifetime of the sperm very small. All these changes are the result of a special type of process called "Cryocapacitation" that so far, the possible cause, has not been defined. The aim of this study was to demonstrate the presence of a state of cryocapacitation on Alapaca’s cryopreserved spermatozoa, studying mainly mobility, viability and stability of the plasma membrane, the pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues, the state of Proacrosin-Acrosin system and the ability of binding to pellucida zone that have these cryopreserved sperm and compare these results with those from capacitated in vitro sperm. The results indicate that cryopreservation directly affects mobility, viability and integrity of acrosomal membrane, showing that both capacitated in vitro and cryopreserved sperm offered the same pattern of proteins phosphorylated in tyrosine residues and that cryopreserved sperm has an increment of active enzyme (Acrosin) in the acrosome region. / Tesis

Determina la concentración óptima del glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido en la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. El análisis estadístico de los tres primeros experimentos se realiza mediante un modelo de regresión polinomial quíntuple, se obtiene la concentración óptima de 1.16, 1.02 y 0.9 M para el glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido respectivamente. El cuarto experimento determina cuál de los crioprotectores criopreservaba mejor la motilidad, integridad de membrana plasmática y viabilidad e integridad acrosomal de los espermatozoides epididimarios. Está conformado por las concentraciones óptimas de los tres crioprotectores y en este se utiliza un análisis de varianza, además de la Prueba de Tukey. Concluye que las concentraciones de 0.9 M de DMSO y 1.16 M de glicerol conservan mejor las características espermáticas antes mencionadas a diferencia de la concentración de 1.02 M de etilenglicol. / Tesis

Espermatozoides criopreservados de Vicugna pacos “alpaca” fueron sometidos a condiciones estresantes que estarían asociadas con una sobreproducción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y una disminución de su capacidad antioxidante lo que conlleva a la peroxidación lipídica de sus membranas reduciendo su viabilidad celular. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del suplemento α–Tocoferol en la movilidad, vitalidad, integridad funcional de membrana (HOST) e integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca congelados/descongelados. Espermatozoides epididimarios obtenidos de 16 alpacas fueron criopreservados en medio TES-Tris-yema suplementado con distintas concentraciones de α–Tocoferol (0, 200, 500 y 1000 μg/mL usando el procedimiento de congelamiento lento en pajillas y almacenados a -196 ºC por un periodo mínimo de 30 días. Los resultados mostraron que los valores de motilidad espermática en los grupos suplementados fueron significativamente (p<0.05) mayores que el grupo no suplementado. El diluyente suplementado con 200 μg/mL de α–Tocoferol tuvo un valor de vitalidad significativamente más alto que con las otras concentraciones (p<0.05). Los porcentajes de HOST y acrosoma intacto fueron significativamente mejorados (p<0.05) por la suplementación con 200 μg/mL de α–Tocoferol comparado con el grupo control. En conclusión, α–Tocoferol, como suplemento, a una concentración de 200 μg/mL en el diluyente TES-Tris-yema durante la criopreservación tuvo un efecto positivo en la calidad espermática post-descongelamiento. / -- Cryopreserved sperm of Vicugna pacos “alpaca” were subjected to stressful conditions that would be associated with an overproduction of reactive oxygen species (ROS) and a decrease in antioxidant capacity which leads to lipid peroxidation of the membrane reducing cell viability. The aim of this study was to investigate the effect of α–Tocopherol supplementation on movility, viability, functional integrity of the membrane and acrosomal integrity of frozen/thawed alpaca sperm. Epididymal sperm collected from 16 alpacas were cryopreserved in TES-Tris-yolk medium supplemented with different concentrations of α–Tocopherol (0, 200, 500 and 1000 μg/mL, using the slow freezing procedure in straws and stored at -196 °C for a minimum period of 30 days. The results showed that the sperm motility values in the supplemented groups were significantly (p<0.05) higher than that unsupplemented group. The extender supplemented with 200μg/mL of α–Tocopherol had a vitality value significantly higher than that of other concentrations (p<0.05). The percentages of HOST and acrosome intact were significantly improved by supplementing with 200 μg/mL of α–Tocopherol compared with control group. In conclusion, α-Tocopherol, supplemented at 200 μg/mL concentration in TES-Tris-yema extender during cryopreservation had a positive effect on post-thawed sperm quality. / Tesis

En las zonas alto-andinas del Perú, donde la agricultura y ganadería común no son viables, la crianza de camélidos, como la alpaca, constituye el único medio de subsistencia y principal actividad económica de las familias campesinas. Por tanto, el estudio de la fisiología reproductiva de la alpaca es indispensable para el establecimiento de proyectos de mejoramiento genético y reproducción asistida. Las proteínas que participan en la interacción de los gametos de las alpacas son desconocidas, es por ello que el presente trabajo planteó determinar la expresión proteica y la caracterización de una proteína de Zona Pelúcida (ZP) que induzca espontáneamente la reacción acrosómica (RA) en ovocitos de alpacas. En la mayoría de mamíferos la ZP está conformada por tres glicoproteínas ZP1, ZP2 y ZP3. En el presente trabajo se demostró que en las alpacas existen también 3 glicoproteínas con pesos moleculares de 110 kDa, 75 kDa y 65 kDa correspondientes a ZP1a, ZP2a y ZP3a, respectivamente. La ZP3 es el agonista natural de la RA en espermatozoides de la misma especie, sin embargo, los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que ZP3a es capaz de inducir la RA tanto en espermatozoides de ratón como en los de su propia especie. De esta manera, este estudio ayuda al mejor entendimiento de la naturaleza de las glicoproteínas de ZP en alpacas. / --- In areas of high-Andean Peru, where agriculture and livestock are not viable, the breeding of camels, such as alpaca is the only means of livelihood and main economic activity of farm households. Therefore, the study of the reproductive physiology of alpacas is essential to the establishment of projects in assisted reproduction and genetic improvement. The proteins involved in the interaction of the alpaca’s gametes are unknown; therefore the present determined the protein expression and characterization of a zona pellucida (ZP), which induce the spontaneous acrosome reaction (AR) in oocytes of alpacas. In most mammals, the zona pellucida (ZP) is composed by three glycoproteins ZP1, ZP2 and ZP3. In this research demonstrated that in Alpacas there are also 3 glycoproteins with molecular weights of 110 kDa, 75 kDa and 65 kDa corresponding to aZP1, aZP2 and aZP3, respectively. ZP3 is the natural agonist of the acrosome reaction (AR) in spermatozoa of the same species, however, our results obtained in this research showed that aZP3 can also induce RA in mouse sperm and in their own species. Therefore, this study helps to better understand the nature of the zona pellucida glycoproteins in alpacas. / Tesis

El estudio evaluó el efecto de la suplementación de L- cisteína al dilutor tes-tris-yema sobre la calidad post descongelación de espermatozoides de Vicugna pacos “alpaca”. Con este propósito, dieciséis muestras de espermatozoides epididimarios fueron colectados de alpacas en el Camal Municipal de Huancavelica - Perú, durante un período de cuatro semanas. Cada muestra se diluyó en el dilutor Tes-Tris-Yema de huevo y se dividió en cuatro alícuotas, conteniendo diferentes concentraciones del antioxidante: L-cisteína 0 mM (tratamiento control), L- cisteína 2.5 mM (tratamiento 1), L-cisteína 5 mM (tratamiento 2) y L-cisteína 10 mM (tratamiento 3). Luego las suspensiones espermáticas fueron cargadas en pajillas (0,25 mL) y criopreservadas mediante la metodología de congelamiento lento programado en un congelador de velocidad controlada, finalmente las pajillas se almacenaron en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 50 ° C durante 7 seg, la movilidad, vitalidad, integridad de membrana plasmática y acrosómica de los espermatozoides; fueron evaluados post descongelación. Los resultados de este estudio mostraron que la suplementación de 2.5 mM de L- cisteína en el medio dilutor de criopreservación mejora significativamente la movilidad y la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides después de la descongelación, en comparación con los demás tratamientos y el grupo control (p < 0.05). Se concluye que la adición de L- cisteína a bajas concentraciones (2.5 mM) en el dilutor proporciona un efecto crioprotector sobre los parámetros espermáticos post descongelación en alpaca. / The present study evaluated the effect of L-cysteine supplementation to tes-tris-yolk extender on the post-thaw quality of Vicugna pacos “alpaca” sperm. For this purpose, sixteen epididymal sperm samples were collected from male alpaca in the Camal Municipal of Huancavelica - Perú, in a period of four weeks (three replicates). Each sample was diluted in tes-tris-yolk extender and divided into four aliquots of different concentrations of antioxidant: 0 mM L-cysteine (Control), 2.5 mM L-cysteine (Treatment 1), 5 mM L-cysteine (Treatment 2) and 10 mM L-cysteine (Treatment 3). Then the sperm suspensions were loaded in straws (0.25 mL) and were cryopreserved using the slow freezing methodology in a controlled-rate freezer. Finally the straws were stored in the liquid nitrogen. Thawing was performed, at 50°C for 7 s and the sperm motility, viability, plasma membrane and acrosomal integrity were assessed post-thaw. The results of this search show that the supplementation of L-cysteine 2.5 mM to tes-tris-yolk extender significantly improved the motility and plasma membrane integrity compared to the other treatments and the control group (P < 0.05). It is concluded that the addition of L-cysteine (2.5 mM) in the extender gave a cryoprotective effect on the alpaca sperm parameters post-thaw.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Evalúa los indicadores fisiológicos más importantes de la capacitación espermática, los cuales son: el aumento de la movilidad espermática, la reacción acrosomal y la capacidad de unión a la zona pelúcida. Se realizaron tres etapas experimentales con el objetivo de evaluar el efecto del fluido folicular sobre la capacitación de espermatozoides epididimarios de alpaca. En la primera etapa, el fluido folicular fue inactivado por calentamiento y el medio fue suplementado con suero bovino fetal, para determinar el efecto sobre la movilidad espermática. Los resultados obtenidos luego de la primera hora fueron los siguentes: fluido folicular inactivado sin FBS, 58,75%; fluido folicular inactivado con FBS, 58,75%; fluido folicular fresco sin FBS, 62,33%; con fluido folicular fresco con FBS, 64,83%; control sin FBS, 37,00% y control con FBS, 39,58%. Luego de la segunda hora de incubación, la movilidad fue la siguiente: fluido folicular inactivado sin FBS, 47,75%; fluido folicular inactivado con FBS, 53,75%; fluido folicular fresco sin FBS, 54,25%; fluido folicular fresco con FBS, 50,58%; control sin FBS, 32,25%; control con FBS, 36,92%. En la segunda etapa experimental, se evaluó el efecto del fluido folicular, en relación al tamaño folicular del cual provenían; para ello se clasificó el fluido folicular de acuerdo al tamaño del folículo proveniente, como sigue: De folículos menores de 3 mm, de folículos de entre 3 y 6 mm, y de folículos mayores de 6 mm. En esta etapa experimental se evaluó el efecto del fluido sobre la movilidad y sobre la reacción acrosomal. Los resultados de la movilidad luego de la primera hora fueron los siguientes: fluido de folículos pequeños, 48,00%; fluido de folículos medianos, 43,33%; fluido de folículos grandes, 34,53%; control sin FBS, 26,00%; control con FBS, 29,20%. Luego de la segunda hora, los resultados fueron como sigue: fluido de folículos pequeños, 46,53%; fluido de folículos medianos, 40,00%; fluido de folículos grandes, 35,60%; control sin FBS, 28,13%; control con FBS, 26,80%. En el análisis de la reacción acrosomal se obtuvieron los siguientes resultados: fluido folicular de folículos pequeños, 66,3%; fluido folicular de folículos medianos, 58,86%; fluido de folículos grandes, 67,63%; control sin FBS, 30,06%; el control con FBS, 44,04%. En la tercera etapa, se evaluó la capacidad de los espermatozoides incubados con fluido folicular para unirse a la zona pelúcida de ovocitos homólogos. En este experimento, se enfrentaron los espermatozoides con zonas pelúcidas en el medio HAM F10 suplementado con fluido folicular y se determinó el número de espermatozoides unidos. Los resultados fueron los siguientes: fluido folicular, 7,90; control sin FBS, 1,68, control con FBS, 2,70. Los resultados permitieron reconocer que el fluido folicular de alpaca no es tóxico para los espermatozoides de alpaca, promueve la movilidad espermática sí solo (α=0,05). Por otro lado, el fluido folicular favorece la movilidad espermática, independientemente del tamaño del folículo (α=0,05); aunque el fluido de folículos medianos y pequeños ejercían un efecto ligeramente mayor. Asimismo, se pudo observar que el fluido folicular promovía la reacción acrosomal de los espermatozoides (α=0,05). Adicionalmente, el fluido folicular favorecía la capacidad de los espermatozoides de alpaca para unirse a la zona pelúcida del ovocito (α=0,05). Ante las evidencias, se concluye que el fluido folicular de alpaca es un inductor de la capacitación espermática para esta especie. / Tesis