Los crioprotectores del grupo amida han demostrado ser eficaces en la criopreservación espermática de distintas especies; sin embargo, su empleo en camélidos sudamericanos es aún escaso. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de los tipos (dimetilacetamida y dimetilformamida) y concentraciones (1%, 3.5% y 7%) de agentes crioprotectores sobre tres parámetros espermáticos durante el proceso de criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. Se trabajaron con 40 epidídimos empleando el dilutor leche descremada-fructosa-yema de huevo y se empleó un diseño factorial 2x3 formado por dos crioprotectores y tres concentraciones (Dimetilacetamida 1%, dimetilacetamida 3.5%, dimetilacetamida 7%, dimetilformamida 1%, dimetilformamida 3.5% y dimetilformamida 7%). Se evaluaron los parámetros de viabilidad espermática (SYBR-14/PI) y potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker Deep Red FM) mediante citometría de flujo y motilidad post descongelamiento por microscopía. Para el análisis estadístico se utilizó análisis de varianza para el diseño factorial y para determinar diferencias estadísticas entre medias de los tratamientos se usó la prueba de Tukey. Los resultados mostraron efecto significativo del tipo de crioprotector (p=0.001) obteniendo mejores efectos con DMA que con DMF, respecto al porcentaje de motilidad post descongelamiento (14% vs. 10%). Asimismo, hubo efecto significativo de la concentración en todos los parámetros evaluados (p<0.001), obteniendo mayores porcentajes de motilidad post descongelamiento, viabilidad espermática y potencial de membrana mitocondrial con concentraciones de 1% y 3.5% que 7%. Sin embargo, no se halló efecto significativo de la interacción crioprotector-concentración en ninguno de los parámetros. En conclusión, dimetilacetamida tuvo un mejor efecto que dimetilformamida respecto a la motilidad post descongelamiento. Además, las concentraciones de 1% y 3.5% mostraron mejores resultados de los parámetros espermáticos antes mencionados que concentraciones de 7%, independientemente del tipo de crioprotector. / Tesis

El estudio de la viabilidad espermática se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática del espermatozoide y se desconoce el efecto de la criopreservación en este parámetro. Por lo tanto, el objetivo fue determinar el porcentaje de viabilidad en espermatozoides epididimarios de alpaca antes y después del proceso de criopreservación mediante citometría de flujo. Se recolectaron 46 testículos de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Ninacaca, Pasco. Solo se trabajaron 41 muestras con motilidad ≥ 30% y una concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL. Los espermatozoides fueron recuperados de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, separándose luego en 2 alícuotas de 500µL. La primera alícuota se utilizó para la lectura inmediata en el citómetro y la segunda alícuota se congeló utilizando un sistema automático de congelamiento Cryobath, manteniéndose en nitrógeno líquido hasta su evaluación. Para la evaluación de viabilidad espermática se utilizaron los fluorocromos SYBR–14 y Ioduro de Propidio. Se tomaron 100µL del alícuota luego se agregó 0.5µL de SYBR–14 (100nM) y 0.5µL de Ioduro de Propidio (12µM), incubándose por 10 minutos a 38°C. La evaluación de viabilidad espermática se realizó mediante citometría de flujo con analizador de imágenes. Los espermatozoides viables con membrana intacta emitieron fluorescencia verde (SYBR– 14) y los espermatozoides no viables con membrana dañada emitieron fluorescencia roja (Ioduro de Propidio). Mediante un análisis de T–student pareado se encontró que la viabilidad espermática inicial (48.97 ± 11.47%) fue significativamente mayor (p<0.05) que la viabilidad espermática luego del descongelamiento (32.30 ± 9.57%); adicionalmente también se encontró que la correlación entre viabilidad y motilidad espermática fue r = 0.6737. Por lo tanto, el proceso de criopreservación disminuye significativamente la viabilidad en espermatozoides epididimarios de alpaca estando este parámetro relacionado con la motilidad. / Tesis

El potencial de membrana mitocondrial (PMM) es uno de los parámetros espermáticos más importantes debido a que las mitocondrias son la principal fuente de ATP necesaria para la movilidad espermática en el tracto reproductivo de la hembra para lograr la fecundación. La criopreservación de espermatozoides es una técnica que permite y facilita el uso de material genético de alto valor. El objetivo es demostrar mediante la citometría de flujo que el porcentaje de espermatozoides de alpaca con alto PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación. Se trabajaron con 41 testículos de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Ninacaca. Provincia de Pasco. Se recuperaron los espermatozoides de la cola del epidídimo con 1 mL de dilutor en base a leche descremada y se congelaron. Sólo fueron congeladas las muestras con mínimo 30% de motilidad y concentración de 50x106 espermatozoides/mL. La evaluación de PMM se realizó antes y después del proceso de criopreservación. Cada muestra se incubó durante 10 minutos a 38 °C con MitoTracker Deep Red (100 nM) para determinar el porcentaje de alto PMM, mediante citometría de flujo con imágenes. El efecto de la criopreservación en el porcentaje de espermatozoides con alto PMM fue evaluado mediante la prueba de T-student pareada. Asimismo, se correlacionaron los porcentajes de motilidad y espermatozoides con alto PMM. Se obtuvo un 49.82 ± 12.41% de alto PMM en muestras antes del proceso de criopreservación, el cual fue significativamente (p<0.05) mayor al porcentaje de alto PMM de las muestras descongeladas (34.97 ± 9.96%). También se encontró una correlación positiva (r: 0.62; p<0.0001) entre motilidad y PMM. Se concluye que el PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación, parámetro relacionado a la motilidad espermática. / Tesis

Determina el efecto de la criopreservación sobre la integridad acrosomal de los espermatozoides viables de alpaca recuperados del epidídimo, determinado mediante citometría de flujo. Se procesaron muestras de 46 testículos de alpaca obtenidos de Camal Municipal de Ninacaca, Pasco, que presentaron una motilidad ≥ 30% y concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL, en promedio 46.6% y 61x106 espermatozoides/mL, respectivamente del total de las muestras obtenidas. Los espermatozoides se recuperaron de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, yema de huevo, fructuosa y DMA; separándose luego en 2 alícuotas de 500 μL. La primera alícuota se utilizó para la evaluación de la viabilidad e integridad acrosomal inicial y la segunda alícuota se congeló en pajillas mediante un sistema automático de criopreservación, para luego almacenarse en nitrógeno líquido hasta el día de su evaluación. Todas las muestras, frescas y descongeladas fueron lavadas 2 veces por centrifugación con solución PBS para retirar el dilutor. Para la evaluación de viabilidad e integridad acrosomal, 100μL de cada muestra fue incubada con 2.5μL de FITC-PSA (100 μg/mL) y 0.5μL de Ioduro de Propidio (PI, 2.4 nM) por 10 minutos a 38°C, obteniendo finalmente una concentración de 2.5 μg/mL y 12 μM, respectivamente. Inmediatamente después las muestras se evaluaron por citometría de flujo con analizador de imágenes, adquiriéndose diez mil eventos compatibles con espermatozoides por muestra. FITC-PSA y PI fueron excitados con el láser de 488 nm, mientras que la emisión de fluorescencia fue detectada utilizando los canales Ch02 (505-560 nm) para FITC-PSA y Ch05 (642-740nm) para PI. Se seleccionó la población de espermatozoides viables (PI negativos), que en promedio fue el 75% del semen fresco y un 42% del semen descongelado, para de ellos determinar el porcentaje de integridad acrosomal (FITC-PSA negativos) y de reacción acrosomal (FITC-PSA positivos). Se realizó un análisis de T-student pareado para determinar como la criopreservación afecta la integridad acrosomal en los espermatozoides viables. Se encontró que la integridad acrosomal de los espermatozoides viables inicial (98.25 ± 5.40%) fue similar (p>0.05) a la integridad acrosomal de los espermatozoides viables post descongelamiento (98.75 ± 2.17%). Se concluye que si bien la criopreservación disminuye la cantidad de espermatozoides viables, la estructura acrosomal no se altera en los espermatozoides de alpaca que sobreviven a este proceso. / Trabajo de suficiencia profesional

Compara el porcentaje y calidad postdescongelamiento de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca proliferadas y no proliferadas in vitro. Para ello se emplearon biopsias testiculares de 22 animales provenientes del camal municipal de Huancavelica (aproximadamente 22 horas post mortem). Los parámetros espermáticos iniciales (movilidad y concentración) fueron evaluados en cada muestra a partir de espermatozoides epididimarios. Se obtuvieron suspensiones de células testiculares mediante digestiones enzimáticas y se evaluó la concentración y vitalidad de las células, luego, las células testiculares fueron cultivadas in vitro (FP), criopreservadas mediante un protocolo termocontrolado lento, descongeladas y proliferadas (CP), o proliferadas y luego criopreservadas (PC). La evaluación de las células fue realizada mediante citometría de flujo con marcadores específicos para SSC (DBA-FITC) y Flow Cellect mitopotential Red Kit para la calidad celular (Potencial mitocondrial activo y apoptosis). El porcentaje de SSC en las muestras PC fue de 6.3% ± 1.2, el cual fue mayor que el porcentaje de SSC en las muestras CP, que fue de solo 1.5% ± 0.3 (p< 0.05). La calidad de las SSC fue mejor preservada en las PC, que mostró un 72.6% de células con potencial mitocondrial activo (PMA), 7.8 % de células apoptóticas (A) y 8.1% de células en apoptosis temprana (EA), mientras que en las CP el porcentaje de PMA fue de 59.7%, y valores de 21.3% de apoptosis y 11.5 de apoptosis temprana, que difieren significativamente de las PC y las FP. Se concluye que el cultivo de células testiculares de alpaca previo a la criopreservación permite conservar un mayor porcentaje (6,3%± 1.2) de SSC que la criopreservación sin cultivo previo (1.5% ± 0.3); asimismo conserva la calidad de las SSC a diferencia de las células criopreservadas sin cultivo. De esta forma, el presente trabajo constituye un primer reporte en el cual las técnicas de cultivo celular y criopreservación permiten el mantenimiento del porcentaje y la calidad de las SSC de alpaca. / Tesis