El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del momento de adición del glicerol durante la curva de enfriamiento sobre la calidad espermática del semen canino. Para esto se utilizaron 15 eyaculados de 4 perros adultos. Se evaluó la motilidad, volumen, concentración espermática e integridad funcional de membrana de cada eyaculado. Cada muestra de semen fue sometida a 3 métodos de adición del glicerol (Tratamiento 1, Tratamiento 2 y Tratamiento 3) los cuales se diferenciaron por la concentración de glicerol presente en el dilutor durante la curva de enfriamiento. En el Tratamiento 1 el total del glicerol se adicionó al inicio de la curva de enfriamiento, en el Tratamiento 2 se adicionó una fracción del glicerol total al inicio de la curva de enfriamiento y la fracción restante al final de la curva, finalmente en el Tratamiento 3 el glicerol se añadió al final de la curva de enfriamiento. Finalizada la curva de enfriamiento el semen se envaso en pajillas de 0.5 mL para proceder al congelamiento en nitrógeno liquido. La motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana fueron los parámetros utilizados para evaluar la calidad seminal al descongelamiento. No se encontró diferencia estadística entre ninguno de los 3 métodos de adición del glicerol, a pesar de esto el Tratamiento 1 mantenía ligeramente mejor la motilidad y la integridad funcional de membrana (44% y 46%) en comparación con el Tratamiento 2 (37% y 36%) y el Tratamiento 3 (38% y 37%). Esto nos demuestra que el momento de adición del glicerol no influye de manera diferencial sobre la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana pudiéndose gracias a esto simplificar el proceso de criopreservación al añadir el glicerol al inicio de la curva de enfriamiento pues ya no se manipularía el semen hasta el envasado. / The objetive of this experiment was to evaluate the effect of the moment of addition of the glycerol during the curve of cooling on the spermatic quality of the canine semen. For this there were used 15 ejaculated of 4 adult dogs. There was evaluated the motility, volume, spermatic concentration and functional integrity of membrane of every ejaculated. Every sample of semen was submitted to 3 methods of addition of the glycerol (Treatment 1, Treatment 2 and Treatment 3) which differentiated for the concentration of glicerol present in the dilutor during the curve of cooling. In the Treatment 1 the whole of the glycerol was added to the beginning of the curve of cooling, in the Treatment 2 added to himself a fraction of the entire glycerol to the beginning of the curve of cooling and the remaining fraction at the end of the curve, finally in the Treatment 3 the glycerol was added at the end of the curve of cooling. Finished the curve of cooling the semen was packed in straw hats of 0.5 ml to proceed to the freezing in liquid nitrogen. The progressive motility and the functional integrity of membrane were the parameters used to evaluate the seminal quality to the post-thawing. There was not statistical difference between any of 3 methods of addition of the glicerol, in spite of this the Treatment 1 was keeping lightly better the motility and the functional integrity of membrane (44 % and 46 %) compared to the Treatment 2 (37 % and 36 %) and the Treatment 3 (38 % and 37 %). This demonstrates us that the moment of addition of the glycerol does not influence in a distinguishing way the progressive motility and the functional integrity of membrane being able thanks to this to simplify the process of criopreservación after the glycerol to add to the beginning of the curve of cooling since the semen would not be already manipulated up to the stiff one.

Se emplearon 32 muestras de semen procedentes de cuatro ovinos a fin de ser criopreservadas adicionándoles dos antioxidantes:Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil), cada uno en concentración de 0.5, 1.0 y 2.5 mM. La finalidad del trabajo fue evaluar el efecto postdescongelamiento que pudiera tener sobre la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, y la capacitación espermática prematura. Para cada concentración de cada antioxidante y para el grupo control, se utilizó un dilutor en base a Tris, realizándose 8 repeticiones, cada una con 4 muestras de semen. Los resultados obtenidos demuestran que la adición de Tempo a una concentración de 0.5 mM mejora significativamente la calidad del semen criopreservado en comparación con el grupo control, incrementado los porcentajes de motilidad progresiva (79 vs. 67 %), viabilidad e integridad acrosomal (70 vs. 58 %) y reduciendo la capacitación espermática prematura (9 vs. 15 %). Sin embargo, la adición de Tempol disminuyó la calidad seminal post descongelamiento en comparación con el control. Consecuentemente, el efecto de las especies reactivas de oxígeno sobre la calidad seminal puede ser reducido por la adición de Tempo 0.5 mM durante el enfriamiento. En conclusión la adición de Tempo 0.5 mM en un dilutor en base a Tris, al finalizar la fase de enfriamiento, podría constituir una estrategia para mejorar la calidad de semen ovino criopreservado y por lo tanto aumentar los porcentajes de fertilidad en la inseminación artificial en ovejas. / Trirty-two semen samples coming from 4 rams were frozed using 2 antioxidants, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) and Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), each one in concentrations of 0.5, 1.0, and 2.5 mM, with the objective of evaluate their effects on post-thaw motility, viability, acrosomal integrity, and earlier sperm capacitation. It were realized 8 replication for each antioxidant concentrantion and control group, using 4 semen samples in each replication. Semen samples were diluted on a Tris extender. Results show that Tempo 0.5 mM improve frozen semen quality (P is less than 0.05) in comparison with control group, by increasing percentages of progresive motility (79 vs. 67 %), viability and acrosomal integrity (70 vs. 58 %), and decreasing earlier sperm capacitation (9 vs. 15 %). However, when Tempol was used, it was observed a decrease in frozed semen quality in comparison with control group. Consequently, the adverse effect of reactive oxygen species on semen quality could be reduced by the addition of Tempo 0.5 mM during the cooling process. In conclusion, the use of Tempo 0.5 mM on a Tris extender, at the end of the cooling process could be an alternative for improving the quality of frozed ram semen, and in this way, improve the fertility in artificial insemination in ewes.

El presente trabajo consta de 3 experimentos y tuvo como objetivo principal evaluar el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante los procesos de criopreservación y vitrificación de espermatozoides de alpaca sobre parámetros de funcionalidad espermática. En el Experimento 1, 15 muestras espermáticas obtenidas de la cola del epidídimo y 5 muestras de semen de alpaca fueron vitrificadas en medios Tris base y HTF utilizando diferentes azúcares (fructosa, sacarosa y trehalosa) en 3 concentraciones diferentes (0.25, 0.5 y 1.0 M). Se obtuvo menos de 1% de motilidad y menos de 5% de viabilidad utilizando el medio HTF. En el Experimento 2, 6 muestras de espermatozoides frescos de alpaca fueron incubados durante 3 horas a 37 °C en un medio Tris-base junto con polimorfos nucleares (PMN) activados con 100 nM de PMA (Phorbol myristate acetate) para inducir la formación de ROS. Se demostró que la motilidad espermática se reduce significativamente (p< 0.05) en el grupo con polimorfos activados (13.67%) en comparación con el grupo control (22.42%). En el Experimento 3, se evaluó el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante el proceso de criopreservación en un medio en base a leche descremada y etilenglicol, encontrando que con la adición de Tempo y Tempol se obtiene una mayor (p<0.05) motilidad espermática en comparación al grupo control (19.63% y 22.57% vs. 10.62%), mayores porcentajes (p<0.05) de integridad de membrana (14.31% y 13.08% vs. 10.38%) y se obtiene (p<0.05) mayores porcentajes de espermatozoides con ADN no fragmentado (74.20% y 83.76% vs. 63.68%). La variable espermática de vitalidad/integridad acrosomal no fue afectada significativamente por la adición de los antioxidantes Tempo y Tempol. Se concluye que la incubación de espermatozoides de alpaca incubados con PMN activados con PMA tienen un efecto nocivo en la motilidad espermática, y que durante la criopreservación de semen la pérdida de motilidad espermática, pérdida de integridad funcional de membrana y aumento de la fragmentación de ADN espermático pueden ser prevenidos parcialmente mediante la utilización delos antioxidantes Tempo ó Tempol como parte del dilutor de semen. -- Palabras clave: Espermatozoides, alpaca, criopreservación, ROS, antioxidante, tempo, tempol. / -- The present study had 3 experiments and the main objective were to evaluate the effect of two superoxide dismutase mimics (Tempo and Tempol) during semen sperm cryopreservation and vitrification on alpaca sperm function. In Experiment 1, vitrification of alpaca sperm was evaluated using extenders based on Tris solution and HTF, with different sugars as cryoprotectants (fructose, sucrose, and trehalose) in different concentrations (0.25, 0.5 y 1.0 M). Only few spermatozoa motile (<1%) and viable (<5%) were found in group HTF.In Experimental 2, six samples of fresh alpaca sperm were incubated during 3 hours at 37 °C on a medium based on Tris with polymorphonuclear activated by 100 mM PMA (phorbol myristate acetate) to induce ROS production. Sperm motility was significantly reduced (p< 0.05) when sperm were incubated on a medium con high levels of ROS (13.67%) in comparison with control group (22.42%). In Experiment 3, two superoxide dismutaseanalogues (antioxidants Tempo and Tempol) were evaluated during cryopreservation process on an extender based on skim milk and ethylene glycol. Addition of Tempo or Tempol result in higher (p< 0.05) sperm motility in comparison than control group (19.63% and 22.57% vs. 10.62%). Functional sperm membrane integrity were also higher (p<0.05) in groups Tempo (14.31%) and Tempol (13.08) than control group (10.38%). In the same way, DNA integrity washigher (p< 0.05) in groups Tempo (74.20%) and Tempol (83.76%) than control group (63.68%). Viability and acrosomal integrity were not affected by cryopreservation with superoxide dismutase analogues. We conclude that alpaca sperm incubation on PMN activated by PMA had a detrimental effect on alpaca sperm motility, and that motility, functional sperm membrane integrity and DNA integrity could be partially protected by administration of Tempo or Tempol as components of extender for cryopreservation alpaca semen. -- Key words: Sperm, alpaca, cryopreservation, ROS, antioxidant, tempo, tempol / Tesis

Se emplearon 32 muestras de semen procedentes de cuatro ovinos a fin de ser criopreservadas adicionándoles dos antioxidantes:Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) y Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil), cada uno en concentración de 0.5, 1.0 y 2.5 mM. La finalidad del trabajo fue evaluar el efecto postdescongelamiento que pudiera tener sobre la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, y la capacitación espermática prematura. Para cada concentración de cada antioxidante y para el grupo control, se utilizó un dilutor en base a Tris, realizándose 8 repeticiones, cada una con 4 muestras de semen. Los resultados obtenidos demuestran que la adición de Tempo a una concentración de 0.5 mM mejora significativamente la calidad del semen criopreservado en comparación con el grupo control, incrementado los porcentajes de motilidad progresiva (79 vs. 67 %), viabilidad e integridad acrosomal (70 vs. 58 %) y reduciendo la capacitación espermática prematura (9 vs. 15 %). Sin embargo, la adición de Tempol disminuyó la calidad seminal post descongelamiento en comparación con el control. Consecuentemente, el efecto de las especies reactivas de oxígeno sobre la calidad seminal puede ser reducido por la adición de Tempo 0.5 mM durante el enfriamiento. En conclusión la adición de Tempo 0.5 mM en un dilutor en base a Tris, al finalizar la fase de enfriamiento, podría constituir una estrategia para mejorar la calidad de semen ovino criopreservado y por lo tanto aumentar los porcentajes de fertilidad en la inseminación artificial en ovejas. / --- Trirty-two semen samples coming from 4 rams were frozed using 2 antioxidants, Tempo (2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl) and Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetramethyl-1-piperidinyloxyl), each one in concentrations of 0.5, 1.0, and 2.5 mM, with the objective of evaluate their effects on post-thaw motility, viability, acrosomal integrity, and earlier sperm capacitation. It were realized 8 replication for each antioxidant concentrantion and control group, using 4 semen samples in each replication. Semen samples were diluted on a Tris extender. Results show that Tempo 0.5 mM improve frozen semen quality (P is less than 0.05) in comparison with control group, by increasing percentages of progresive motility (79 vs. 67 %), viability and acrosomal integrity (70 vs. 58 %), and decreasing earlier sperm capacitation (9 vs. 15 %). However, when Tempol was used, it was observed a decrease in frozed semen quality in comparison with control group. Consequently, the adverse effect of reactive oxygen species on semen quality could be reduced by the addition of Tempo 0.5 mM during the cooling process. In conclusion, the use of Tempo 0.5 mM on a Tris extender, at the end of the cooling process could be an alternative for improving the quality of frozed ram semen, and in this way, improve the fertility in artificial insemination in ewes. / Tesis

Determina la concentración óptima del glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido en la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca. El análisis estadístico de los tres primeros experimentos se realiza mediante un modelo de regresión polinomial quíntuple, se obtiene la concentración óptima de 1.16, 1.02 y 0.9 M para el glicerol, etilenglicol y dimetil sulfóxido respectivamente. El cuarto experimento determina cuál de los crioprotectores criopreservaba mejor la motilidad, integridad de membrana plasmática y viabilidad e integridad acrosomal de los espermatozoides epididimarios. Está conformado por las concentraciones óptimas de los tres crioprotectores y en este se utiliza un análisis de varianza, además de la Prueba de Tukey. Concluye que las concentraciones de 0.9 M de DMSO y 1.16 M de glicerol conservan mejor las características espermáticas antes mencionadas a diferencia de la concentración de 1.02 M de etilenglicol. / Tesis

Espermatozoides criopreservados de Vicugna pacos “alpaca” fueron sometidos a condiciones estresantes que estarían asociadas con una sobreproducción de especies reactivas de oxigeno (ROS) y una disminución de su capacidad antioxidante lo que conlleva a la peroxidación lipídica de sus membranas reduciendo su viabilidad celular. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto del suplemento α–Tocoferol en la movilidad, vitalidad, integridad funcional de membrana (HOST) e integridad acrosomal de espermatozoides de alpaca congelados/descongelados. Espermatozoides epididimarios obtenidos de 16 alpacas fueron criopreservados en medio TES-Tris-yema suplementado con distintas concentraciones de α–Tocoferol (0, 200, 500 y 1000 μg/mL usando el procedimiento de congelamiento lento en pajillas y almacenados a -196 ºC por un periodo mínimo de 30 días. Los resultados mostraron que los valores de motilidad espermática en los grupos suplementados fueron significativamente (p<0.05) mayores que el grupo no suplementado. El diluyente suplementado con 200 μg/mL de α–Tocoferol tuvo un valor de vitalidad significativamente más alto que con las otras concentraciones (p<0.05). Los porcentajes de HOST y acrosoma intacto fueron significativamente mejorados (p<0.05) por la suplementación con 200 μg/mL de α–Tocoferol comparado con el grupo control. En conclusión, α–Tocoferol, como suplemento, a una concentración de 200 μg/mL en el diluyente TES-Tris-yema durante la criopreservación tuvo un efecto positivo en la calidad espermática post-descongelamiento. / -- Cryopreserved sperm of Vicugna pacos “alpaca” were subjected to stressful conditions that would be associated with an overproduction of reactive oxygen species (ROS) and a decrease in antioxidant capacity which leads to lipid peroxidation of the membrane reducing cell viability. The aim of this study was to investigate the effect of α–Tocopherol supplementation on movility, viability, functional integrity of the membrane and acrosomal integrity of frozen/thawed alpaca sperm. Epididymal sperm collected from 16 alpacas were cryopreserved in TES-Tris-yolk medium supplemented with different concentrations of α–Tocopherol (0, 200, 500 and 1000 μg/mL, using the slow freezing procedure in straws and stored at -196 °C for a minimum period of 30 days. The results showed that the sperm motility values in the supplemented groups were significantly (p<0.05) higher than that unsupplemented group. The extender supplemented with 200μg/mL of α–Tocopherol had a vitality value significantly higher than that of other concentrations (p<0.05). The percentages of HOST and acrosome intact were significantly improved by supplementing with 200 μg/mL of α–Tocopherol compared with control group. In conclusion, α-Tocopherol, supplemented at 200 μg/mL concentration in TES-Tris-yema extender during cryopreservation had a positive effect on post-thawed sperm quality. / Tesis

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del momento de adición del glicerol durante la curva de enfriamiento sobre la calidad espermática del semen canino. Para esto se utilizaron 15 eyaculados de 4 perros adultos. Se evaluó la motilidad, volumen, concentración espermática e integridad funcional de membrana de cada eyaculado. Cada muestra de semen fue sometida a 3 métodos de adición del glicerol (Tratamiento 1, Tratamiento 2 y Tratamiento 3) los cuales se diferenciaron por la concentración de glicerol presente en el dilutor durante la curva de enfriamiento. En el Tratamiento 1 el total del glicerol se adicionó al inicio de la curva de enfriamiento, en el Tratamiento 2 se adicionó una fracción del glicerol total al inicio de la curva de enfriamiento y la fracción restante al final de la curva, finalmente en el Tratamiento 3 el glicerol se añadió al final de la curva de enfriamiento. Finalizada la curva de enfriamiento el semen se envaso en pajillas de 0.5 mL para proceder al congelamiento en nitrógeno liquido. La motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana fueron los parámetros utilizados para evaluar la calidad seminal al descongelamiento. No se encontró diferencia estadística entre ninguno de los 3 métodos de adición del glicerol, a pesar de esto el Tratamiento 1 mantenía ligeramente mejor la motilidad y la integridad funcional de membrana (44% y 46%) en comparación con el Tratamiento 2 (37% y 36%) y el Tratamiento 3 (38% y 37%). Esto nos demuestra que el momento de adición del glicerol no influye de manera diferencial sobre la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana pudiéndose gracias a esto simplificar el proceso de criopreservación al añadir el glicerol al inicio de la curva de enfriamiento pues ya no se manipularía el semen hasta el envasado. / --- The objetive of this experiment was to evaluate the effect of the moment of addition of the glycerol during the curve of cooling on the spermatic quality of the canine semen. For this there were used 15 ejaculated of 4 adult dogs. There was evaluated the motility, volume, spermatic concentration and functional integrity of membrane of every ejaculated. Every sample of semen was submitted to 3 methods of addition of the glycerol (Treatment 1, Treatment 2 and Treatment 3) which differentiated for the concentration of glicerol present in the dilutor during the curve of cooling. In the Treatment 1 the whole of the glycerol was added to the beginning of the curve of cooling, in the Treatment 2 added to himself a fraction of the entire glycerol to the beginning of the curve of cooling and the remaining fraction at the end of the curve, finally in the Treatment 3 the glycerol was added at the end of the curve of cooling. Finished the curve of cooling the semen was packed in straw hats of 0.5 ml to proceed to the freezing in liquid nitrogen. The progressive motility and the functional integrity of membrane were the parameters used to evaluate the seminal quality to the post-thawing. There was not statistical difference between any of 3 methods of addition of the glicerol, in spite of this the Treatment 1 was keeping lightly better the motility and the functional integrity of membrane (44 % and 46 %) compared to the Treatment 2 (37 % and 36 %) and the Treatment 3 (38 % and 37 %). This demonstrates us that the moment of addition of the glycerol does not influence in a distinguishing way the progressive motility and the functional integrity of membrane being able thanks to this to simplify the process of criopreservación after the glycerol to add to the beginning of the curve of cooling since the semen would not be already manipulated up to the stiff one. / Tesis

El semen de alpaca post-descongelación ha sido usado para inseminación artificial sin el éxito esperado, a pesar de usar diversos protocolos de criopreservación y criopreservantes para mantenerlo viable por un tiempo prolongado. Sin embargo, para elaborar un buen criopreservante es necesario conocer que parámetros bioquímicos del plasma seminal se ven afectados tras su descongelación. De allí que el objetivo del estudio fue determinar y comparar las características bioquímicas del plasma seminal de alpacas en fresco y post-descongelado. Se realizó en los laboratorios de Farmacología y Toxicología Veterinaria y Reproducción Animal de la FMV-UNMSM. Se realizó en 4 alpacas adultas, bajo las mismas condiciones de crianza. Se usó un electroeyaculador digital (Electrojac) y se colectó en tubos Falcón de 10 ml, se centrifugó a 3000 rpm por 30 minutos, para la separación del plasma seminal. Una parte se analizó en fresco y la otra parte se almacenó en nitrógeno líquido por 1 mes para su posterior descongelamiento y análisis bioquímico. Se hizo análisis cinético y fotocolorimétrico de niveles de glucosa, colesterol-total, colesterol-HDL, triglicéridos, proteínas-totales, albúmina, calcio, fosfatasa alcalina, ALT y γ-GT, usándose kits específicos (FAR, Italia), y un analizador bioquímico (SINOWA, China). Este procedimiento se realizó 1 vez por semana por 4 semanas. Las diferencias entre los valores bioquímicos en fresco y post-descongelado fueron evaluadas por T-Student pareado con un nivel de confianza del 95%. Sólo los valores de triglicéridos en plasma seminal de alpacas se modificaron debido al proceso de congelación/descongelación lo que se debería a la labilidad de estas moléculas a dichos procesos, los valores de triglicéridos (mg/dL) fueron 44.12±7.38 y 27.31±4.65 en fresco y postdescongelación, respectivamente. Se concluye que tras la descongelación del plasma seminal, únicamente los niveles de triglicéridos en plasma seminal se modifican, lo que supondría tomar en consideración este componente cuando se realice la formulación de criopreservantes.

La acuicultura de peces planos se ha incrementado notablemente en los últimos años, sin embargo existen disfunciones reproductivas que no permiten una reproducción exitosa en cautiverio, por lo tanto, conocer el estado reproductivo de los ejemplares así como la calidad de sus gametos es de vital importancia. La evaluación de la calidad espermática permite incrementar no solo los índices de supervivencia larval sino la aplicación de técnicas como la fecundación in vitro, el monitoreo de las condiciones de cultivo y la criopreservación con el fin de asegurar la reproducción en cautiverio. Los resultados obtenidos en relación a los parámetros de calidad espermática del lenguado Paralichthys adspersus acondicionado al cautiverio fueron el volumen espermático con 758 ± 310 µL, la concentración espermática fue de 2.49 ± 0.26 x 1010 espermatozoides/mL, la clase de motilidad fue 4.00 ± 0.26 con un porcentaje el 50 y 90 % y la viabilidad espermática se evaluó mediante dos técnicas de tinción, se obtuvo 98.31 ± 0.26 % con Eosina-Nigrosina y 87.67 ± 8.28 % con el Kit LIVE/DEAD®. Además, se realizaron ensayos preliminares en criopreservación de espermatozoides, donde se evaluó la motilidad espermática post-incubación en soluciones crioprotectoras, obteniéndose los mejores resultados con DMSO a una concentración de 1.5 M cuya clasede motilidad fue 3.04 ± 0.23 con un 51.79 ± 5.83 %. Por otro lado, la motilidad espermática luego de la criopreservación fue 12.09 ± 2.27 %, con una tasa de congelamiento de – 15 °C/min y de descongelamiento de 50 °C/min. La presente tesis se presenta como el primer reporte de la calidad espermática de Paralichthys adspersus en cautiverio, así como los primeros ensayos para la criopreservación de espermatozoides en esta especie. -- PALABRAS CLAVE: Paralichthys adspersus, espermatozoides, calidad espermática y criopreservación. / -- Flatfish aquaculture has increased markedly in recent years; however there are reproductive dysfunctions that prevent successful reproduction in captivity, therefore, to know the reproductive status of individuals and the quality of their gametes is of great importance. The evaluation of sperm quality can increase not only the larval survival rates but the application of techniques such as artificial insemination, monitoring culture conditions and cryopreservation in order to ensure the reproduction in captivity. The results obtained in relation to semen quality parameters of flounder Paralichthys adspersus conditioned to captivity were sperm volume with 758 ± 310 µl, sperm concentration was 2.49 ± 0.26 x 1010 cells/mL, the class of motility was 4.00 ± 0.26 indicating a range 50 to 90 % and spermatozoa viability was determined using two different staining techniques, with Eosin - Nigrosine techniquewasobtained98.31±0.26 % and with the kit LIVE/DEAD ®was obtained 87.67 ± 8.28 %. In addition, preliminary assays on cryopreservation of spermatozoa were carried out, sperm motility was assessed postincubation in cryoprotectant solutions, obtaining the best results with DMSO at a concentration of 1.5 M, the class of motility was 3.04 ± 0.23 and the percentage of sperm motility was 51.79 ± 5.83 %. On the other hand, sperm motility after thawing was 12.09 ± 2.27%, with a cooling rate -15 ° C/min and thawing rate 50 ° C/min. This thesis is presented as the first study of sperm quality for P. adspersus in captivity, and the first assays for the cryopreservation of sperm in this species. -- KEY WORDS: Paralichthys adspersus, spermatozoa, sperm quality and criopreservation.

El objetivo del presente estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Los testículos/epidídimos fueron obtenidos después de la orquiectomía de 20 caninos adultos aparentemente saludables con edades entre 1 y 8 años. Los testículos/epidídimos fueron colocados en cloruro de sodio al 0.9% y almacenados a 5ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo suspendido en dilutor Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor) se le añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5ml, las cuales fueron sometidas a una curva de enfriamiento para luego ser colocadas en nitrógeno líquido. Los parámetros evaluados fueron: Motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana; parámetros que fueron analizados antes y después de la criopreservación. Adicionalmente se obtuvieron datos sobre morfología y concentración, evaluadas sólo antes de la criopreservación. Todos los parámetros evaluados disminuyeron gradualmente a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, los cuales al ser evaluados a las 48 horas de almacenamiento, antes y después del proceso de criopreservación, no variaron significativamente con respecto a los evaluados a las 0 horas. Sin embargo, cabe resaltar que todos los valores obtenidos después del proceso de criopreservación fueron marcadamente inferiores a los obtenidos antes del proceso. / --- The aim of this study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve sperm from the tail of the epididymis of canine post-orchiectomy. The testes/epididymides were obtained by orchiectomy of 20 apparently healthy adult dogs between 1 to 8 years old. The testes/epididymides were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 ° C for 0, 24, 48 and 72 hours. Sperm were recovered by cutting the tail of the epididymis dilutor suspended in Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, the diluted sample (sperm + dilutor) was added egg yolk (20%) and glycerol (5%). The new dilution was packaged in 0.5ml straws, which were subjected to a cooling curve to be later placed in liquid nitrogen. The parameters evaluated were: Total motility, progressive motility and membrane functional integrity; parameters were analyzed before and after cryopreservation. Additionally, data were obtained on morphology and concentration, evaluated just before the cryopreservation. All evaluated parameters decreased gradually when the storage time increased. Such parameters to be evaluated at 48 hours of storage, before and after the cryopreservation process, did not differ significantly from those evaluated at 0 hours. However, it is noted that all values obtained after the cryopreservation process were markedly lower than those obtained before process.