El objetivo del presente estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Los testículos/epidídimos fueron obtenidos después de la orquiectomía de 20 caninos adultos aparentemente saludables con edades entre 1 y 8 años. Los testículos/epidídimos fueron colocados en cloruro de sodio al 0.9% y almacenados a 5ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo suspendido en dilutor Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor) se le añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5ml, las cuales fueron sometidas a una curva de enfriamiento para luego ser colocadas en nitrógeno líquido. Los parámetros evaluados fueron: Motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana; parámetros que fueron analizados antes y después de la criopreservación. Adicionalmente se obtuvieron datos sobre morfología y concentración, evaluadas sólo antes de la criopreservación. Todos los parámetros evaluados disminuyeron gradualmente a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, los cuales al ser evaluados a las 48 horas de almacenamiento, antes y después del proceso de criopreservación, no variaron significativamente con respecto a los evaluados a las 0 horas. Sin embargo, cabe resaltar que todos los valores obtenidos después del proceso de criopreservación fueron marcadamente inferiores a los obtenidos antes del proceso. / The aim of this study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve sperm from the tail of the epididymis of canine post-orchiectomy. The testes/epididymides were obtained by orchiectomy of 20 apparently healthy adult dogs between 1 to 8 years old. The testes/epididymides were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 ° C for 0, 24, 48 and 72 hours. Sperm were recovered by cutting the tail of the epididymis dilutor suspended in Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, the diluted sample (sperm + dilutor) was added egg yolk (20%) and glycerol (5%). The new dilution was packaged in 0.5ml straws, which were subjected to a cooling curve to be later placed in liquid nitrogen. The parameters evaluated were: Total motility, progressive motility and membrane functional integrity; parameters were analyzed before and after cryopreservation. Additionally, data were obtained on morphology and concentration, evaluated just before the cryopreservation. All evaluated parameters decreased gradually when the storage time increased. Such parameters to be evaluated at 48 hours of storage, before and after the cryopreservation process, did not differ significantly from those evaluated at 0 hours. However, it is noted that all values obtained after the cryopreservation process were markedly lower than those obtained before process.

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, primero (Experimento 1) se seleccionó, entre tres dilutores (A, B y C), el más adecuado para ser usado en la segunda parte (Experimento 2), en la cual se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1)Glicerol - Trehalosa, 2)Glicerol - Sacarosa, 3)Etilenglicol - Trehalosa y 4)Etilenglicol - Sacarosa sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para tal efecto, se realizaron 6 repeticiones para el Experimento 1 y 8 repeticiones para el Experimento 2. Cada repetición constó de 4 eyaculados cada una. En el experimento 1 se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva y viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento (69% y 63%) en comparación con el Dilutor B (37% y 35%) y el Dilutor C (23% y 23%). Por lo cual, el Dilutor A fue empleado en el experimento 2. En el experimento 2 se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa (64%; 56%; 40% y 63%) y glicerol-trehalosa (64%; 58%; 38% y 60%) en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa (48%; 42%; 25% y 37%) y etilenglicol-trehalosa (44%; 38%; 27% y 40%). Lo cual demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol. Sin embargo, no existe diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino. / The objective of the study was to evaluate the effect of four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to have th ebetter one for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethyleneglycol-Trehalose, and 4) Ethyleneglycol–Sucrose. In this way, 6 assays for Experiment 1 and 8 assays for the Experiment 2 were carry out. In each assay, 4 ejaculated were mixed to work as an original sample. Percentages of motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher (69% and 63%) than extender B (37% and 35%) and extender C (23% and 23%). Therefore, extender A was used for experiment 2. In the experiment 2, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose (64%; 56%; 40%, and 63%) and Glycerol-trehalose (64%; 58%; 38%, and 60%) in comparison with groups Ethileneglycol-sucrose (48%; 42%; 25% and 37%) and Ethileneglycol-trehalose (44%; 38%; 27% and 40%). However, there is not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A, it means, using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen.

El potencial de membrana mitocondrial (PMM) es uno de los parámetros espermáticos más importantes debido a que las mitocondrias son la principal fuente de ATP necesaria para la movilidad espermática en el tracto reproductivo de la hembra para lograr la fecundación. La criopreservación de espermatozoides es una técnica que permite y facilita el uso de material genético de alto valor. El objetivo es demostrar mediante la citometría de flujo que el porcentaje de espermatozoides de alpaca con alto PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación. Se trabajaron con 41 testículos de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Ninacaca. Provincia de Pasco. Se recuperaron los espermatozoides de la cola del epidídimo con 1 mL de dilutor en base a leche descremada y se congelaron. Sólo fueron congeladas las muestras con mínimo 30% de motilidad y concentración de 50x106 espermatozoides/mL. La evaluación de PMM se realizó antes y después del proceso de criopreservación. Cada muestra se incubó durante 10 minutos a 38 °C con MitoTracker Deep Red (100 nM) para determinar el porcentaje de alto PMM, mediante citometría de flujo con imágenes. El efecto de la criopreservación en el porcentaje de espermatozoides con alto PMM fue evaluado mediante la prueba de T-student pareada. Asimismo, se correlacionaron los porcentajes de motilidad y espermatozoides con alto PMM. Se obtuvo un 49.82 ± 12.41% de alto PMM en muestras antes del proceso de criopreservación, el cual fue significativamente (p<0.05) mayor al porcentaje de alto PMM de las muestras descongeladas (34.97 ± 9.96%). También se encontró una correlación positiva (r: 0.62; p<0.0001) entre motilidad y PMM. Se concluye que el PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación, parámetro relacionado a la motilidad espermática. / Tesis

Determina el efecto de la criopreservación sobre la integridad acrosomal de los espermatozoides viables de alpaca recuperados del epidídimo, determinado mediante citometría de flujo. Se procesaron muestras de 46 testículos de alpaca obtenidos de Camal Municipal de Ninacaca, Pasco, que presentaron una motilidad ≥ 30% y concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL, en promedio 46.6% y 61x106 espermatozoides/mL, respectivamente del total de las muestras obtenidas. Los espermatozoides se recuperaron de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, yema de huevo, fructuosa y DMA; separándose luego en 2 alícuotas de 500 μL. La primera alícuota se utilizó para la evaluación de la viabilidad e integridad acrosomal inicial y la segunda alícuota se congeló en pajillas mediante un sistema automático de criopreservación, para luego almacenarse en nitrógeno líquido hasta el día de su evaluación. Todas las muestras, frescas y descongeladas fueron lavadas 2 veces por centrifugación con solución PBS para retirar el dilutor. Para la evaluación de viabilidad e integridad acrosomal, 100μL de cada muestra fue incubada con 2.5μL de FITC-PSA (100 μg/mL) y 0.5μL de Ioduro de Propidio (PI, 2.4 nM) por 10 minutos a 38°C, obteniendo finalmente una concentración de 2.5 μg/mL y 12 μM, respectivamente. Inmediatamente después las muestras se evaluaron por citometría de flujo con analizador de imágenes, adquiriéndose diez mil eventos compatibles con espermatozoides por muestra. FITC-PSA y PI fueron excitados con el láser de 488 nm, mientras que la emisión de fluorescencia fue detectada utilizando los canales Ch02 (505-560 nm) para FITC-PSA y Ch05 (642-740nm) para PI. Se seleccionó la población de espermatozoides viables (PI negativos), que en promedio fue el 75% del semen fresco y un 42% del semen descongelado, para de ellos determinar el porcentaje de integridad acrosomal (FITC-PSA negativos) y de reacción acrosomal (FITC-PSA positivos). Se realizó un análisis de T-student pareado para determinar como la criopreservación afecta la integridad acrosomal en los espermatozoides viables. Se encontró que la integridad acrosomal de los espermatozoides viables inicial (98.25 ± 5.40%) fue similar (p>0.05) a la integridad acrosomal de los espermatozoides viables post descongelamiento (98.75 ± 2.17%). Se concluye que si bien la criopreservación disminuye la cantidad de espermatozoides viables, la estructura acrosomal no se altera en los espermatozoides de alpaca que sobreviven a este proceso. / Trabajo de suficiencia profesional

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, primero (Experimento 1) se seleccionó, entre tres dilutores (A, B y C), el más adecuado para ser usado en la segunda parte (Experimento 2), en la cual se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1)Glicerol - Trehalosa, 2)Glicerol - Sacarosa, 3)Etilenglicol - Trehalosa y 4)Etilenglicol - Sacarosa sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para tal efecto, se realizaron 6 repeticiones para el Experimento 1 y 8 repeticiones para el Experimento 2. Cada repetición constó de 4 eyaculados cada una. En el experimento 1 se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva y viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento (69% y 63%) en comparación con el Dilutor B (37% y 35%) y el Dilutor C (23% y 23%). Por lo cual, el Dilutor A fue empleado en el experimento 2. En el experimento 2 se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa (64%; 56%; 40% y 63%) y glicerol-trehalosa (64%; 58%; 38% y 60%) en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa (48%; 42%; 25% y 37%) y etilenglicol-trehalosa (44%; 38%; 27% y 40%). Lo cual demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol. Sin embargo, no existe diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino. / --- The objective of the study was to evaluate the effect of four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to have th ebetter one for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethyleneglycol-Trehalose, and 4) Ethyleneglycol–Sucrose. In this way, 6 assays for Experiment 1 and 8 assays for the Experiment 2 were carry out. In each assay, 4 ejaculated were mixed to work as an original sample. Percentages of motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher (69% and 63%) than extender B (37% and 35%) and extender C (23% and 23%). Therefore, extender A was used for experiment 2. In the experiment 2, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose (64%; 56%; 40%, and 63%) and Glycerol-trehalose (64%; 58%; 38%, and 60%) in comparison with groups Ethileneglycol-sucrose (48%; 42%; 25% and 37%) and Ethileneglycol-trehalose (44%; 38%; 27% and 40%). However, there is not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A, it means, using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen. / Tesis