Evalúa a la ciclina A1 (CCNA1) cuya expresión ha sido reportada casi exclusivamente en testículos de otros animales incluyendo el hombre y se le atribuye una función crítica en el control del ciclo celular durante la espermatogénesis. Se evalua la expresión del mRNA de CCNA1, mediante RTqPCR, en testículos de alpacas provenientes del Camal Municipal de Huancavelica en edad fértil (n = 35). Estos resultados son correlacionados con parámetros fisiológicos evaluados in vitro. Se encuentra que la expresión de mRNA de CCNA1 en testículos de alpacas con regiones conservadas a nivel nucleotídico. A diferencia de lo que sucede en humanos y otros animales, el mRNA de CCNA1 mostró una baja, pero significativa asociación, con la concentración espermática (p<0.05).

La edad influye en el empaquetamiento adecuado de la cromatina espermática haciéndola más vulnerable con el transcurrir del tiempo. Las protaminas son las proteínas nucleares más abundantes en el espermatozoide maduro y empaquetan fuertemente el genoma paterno dentro del núcleo espermático, haciéndolo inaccesible a nucleasas o mutágenos, protegiendo de esta manera al ADN espermático. Ratones con sólo una copia de estos genes son infértiles, lo que demuestra que son esenciales para la función espermática normal. El objetivo de esta tesis fue investigar si existe relación entre la edad masculina y la protaminación espermática a nivel fisiológico y molecular. Se usaron ratones (Mus musculus Linnaeus, 1758) macho de la cepa C57BLACK6 (C57BL6) (20 – 25 g), divididos en dos grupos etarios: ratones de 3-4 meses (Grupo joven: G1) y 18-21 meses (Grupo viejo: G2). Se emplearon espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo para los análisis de movilidad espermática, fragmentación del ADN mediante el ensayo cometa bidimensional y estrés oxidativo mediante TBARS. Se utilizó tejido testicular para evaluar la expresión génica de Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2, mediante PCR en tiempo real (RT-qPCR). Respecto a las velocidades de movimiento espermático se observó que el G1 presentó mayores valores que G2, en cuanto a MOT (50.63 ± 6.60 % vs 30.38 ± 5.16 %, p<0.05) y MR (24.50 ± 3.04 % vs 13.92 ± 3.02 %, p<0.05), mientras que ME fue mayor en G2 que en G1 (69.31 ± 5.31 % vs 48.38 ± 7.39 %, p<0.05). Respecto a los tipos de desplazamiento de los espermatozoides, se observó que G1 presentó mayores valores que G2 respecto a VAP (67.89 ± 5.68 % vs 52.12 ± 3.38 %, p<0.05) y VSL (43.15 ± 3.47 % vs 30.68 ± 2.45 %, p<0.05). El estrés oxidativo medido con TBARS no presentó diferencias entre el G1 y G2 (132.50 ± 9.64 ng MDA/106 spz vs 135.00 ± 10.81 ng MDA/106 spz; p>0.05). Tampoco se observaron diferencias significativas en la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado entre los grupos G1 y G2 (20.51 ± 1.41 % vs 20.11 ± 1.29 %, p>0.05), ni en la cantidad de ADN fragmentado por espermatozoide entre ambos grupos (17.36 ± 0.49 % vs 17.76 ± 0.62 %, p>0.05). La comparación de los niveles de expresión de los genes Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2 demostró que Prm2 y Tnp1 en el G2 se sobreexpresan observándose una diferencia significativa respecto al G1 (p<0.05), sin embargo, Prm1 y Tnp2 no mostraron diferencias significativas (p>0.05). Si bien el aumento de la edad presentó diferencias significativas con los niveles de expresión Prm2 y Tnp1, esto no sería suficiente para ejercer algún impacto sobre la producción de ROS y el aumento de la fragmentación del ADN espermático, debido quizás al papel protagónico de Prm1 en la protaminación espermática reportado en todas las especies estudiadas hasta la fecha y cuyos niveles de expresión no son alterados en el grupo de ratones viejos. Se concluye que el incremento de la edad no altera la protaminación espermática en ratones. / --- Age has an influence in the proper packaging of sperm chromatin, rendering it more vulnerable as time goes on. Protamines are the most abundant nuclear proteins in the mature spermatozoon and they are responsible for packing the paternal genome inside the sperm cell nucleus, making it inaccessible to nucleases or mutagens, thus protecting it. Mice with only one copy of these genes are infertile, which proves that are essential for normal spermatic function. The aim of this study was to look for a correlation between male age and sperm protamination at molecular and physiological levels. Male mice (Mus musculus Linnaeus, 1758) from C57BLACK6 (C57BL6) strain (20-25g) were used and distributed in two age groups: 3-4 month old mice ("Young" group: G1) and 18-21 month old ("Elderly" group: G2). Spermatozoa obtained from the epididymis tail were employed in sperm motility analysis, DNA fragmentation analysis by bidimensional comet assay, and oxidative stress by TBARS assay. Testicular tissue was used for assess the gene expression of Prm1, Prm2, Tnp1 and Tnp2, by real time PCR (RT-qPCR). When analyzing sperm motility, MOT (50.63 ± 6.60% vs 30.38 ± 5.16 %) and MR (24.50 ± 3.04 % vs 13.92 ± 3.02 %) were higher in G1 compared to G2 (p<0.05). However, ME was higher in G2 compared to G1 (69.31 ± 5.31 % vs 48.38 ± 7.39 %, respectively) (p<0.05). Likewise, when analyzing displacement types in the sperm cells, VAP (67.89 ± 5.68 % vs 52.12 ± 3.38 %, p<0.05) and VSL (43.15 ± 3.47 % vs 30.68 ± 2.45 %, p<0.05) were higher in G1 compared to G2. Oxidative stress levels measured by TBARS did not show any differences between G1 and G2 (132.50 ± 9.64 ng MDA/106 spz vs 135.00 ± 10.81 ng MDA/106 spz; p>0.05). The proportion of sperm cells with fragmented DNA were not significantly different (G1 vs G2, 20.51 ± 1.41 % vs 20.11 ± 1.29 % respectively, p>0.05) and there were also no differences in the percentage of fragmented DNA of those subpopulations (17.36 ± 0.49 % vs 17.76 ± 0.62 %, p>0.05). Gene expression levels of Prm2 and Tnp1 were significantly overexpressed in G2 in comparison to G1 (p<0.05); however, Prm1 and Tnp2 did not show significant differences between both groups (p<0.05). Despite of age had an influence in expression levels of Prm2 and Tnp1, it would not be relevant enough to alter ROS production and sperm DNA fragmentation. It was probably due to the central role of Prm1 in sperm protamination, something widely reported in all studied species to date, which levels were not altered in the elderly group. As a conclusion, increase of age does not alter sperm protamination in mice. / Tesis

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos. / Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.

Compara el porcentaje y calidad postdescongelamiento de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca proliferadas y no proliferadas in vitro. Para ello se emplearon biopsias testiculares de 22 animales provenientes del camal municipal de Huancavelica (aproximadamente 22 horas post mortem). Los parámetros espermáticos iniciales (movilidad y concentración) fueron evaluados en cada muestra a partir de espermatozoides epididimarios. Se obtuvieron suspensiones de células testiculares mediante digestiones enzimáticas y se evaluó la concentración y vitalidad de las células, luego, las células testiculares fueron cultivadas in vitro (FP), criopreservadas mediante un protocolo termocontrolado lento, descongeladas y proliferadas (CP), o proliferadas y luego criopreservadas (PC). La evaluación de las células fue realizada mediante citometría de flujo con marcadores específicos para SSC (DBA-FITC) y Flow Cellect mitopotential Red Kit para la calidad celular (Potencial mitocondrial activo y apoptosis). El porcentaje de SSC en las muestras PC fue de 6.3% ± 1.2, el cual fue mayor que el porcentaje de SSC en las muestras CP, que fue de solo 1.5% ± 0.3 (p< 0.05). La calidad de las SSC fue mejor preservada en las PC, que mostró un 72.6% de células con potencial mitocondrial activo (PMA), 7.8 % de células apoptóticas (A) y 8.1% de células en apoptosis temprana (EA), mientras que en las CP el porcentaje de PMA fue de 59.7%, y valores de 21.3% de apoptosis y 11.5 de apoptosis temprana, que difieren significativamente de las PC y las FP. Se concluye que el cultivo de células testiculares de alpaca previo a la criopreservación permite conservar un mayor porcentaje (6,3%± 1.2) de SSC que la criopreservación sin cultivo previo (1.5% ± 0.3); asimismo conserva la calidad de las SSC a diferencia de las células criopreservadas sin cultivo. De esta forma, el presente trabajo constituye un primer reporte en el cual las técnicas de cultivo celular y criopreservación permiten el mantenimiento del porcentaje y la calidad de las SSC de alpaca. / Tesis

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos. / Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.