Evalúa a la ciclina A1 (CCNA1) cuya expresión ha sido reportada casi exclusivamente en testículos de otros animales incluyendo el hombre y se le atribuye una función crítica en el control del ciclo celular durante la espermatogénesis. Se evalua la expresión del mRNA de CCNA1, mediante RTqPCR, en testículos de alpacas provenientes del Camal Municipal de Huancavelica en edad fértil (n = 35). Estos resultados son correlacionados con parámetros fisiológicos evaluados in vitro. Se encuentra que la expresión de mRNA de CCNA1 en testículos de alpacas con regiones conservadas a nivel nucleotídico. A diferencia de lo que sucede en humanos y otros animales, el mRNA de CCNA1 mostró una baja, pero significativa asociación, con la concentración espermática (p<0.05).

Orientador: Karina Gottardello Zecchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ortega_RoseMara_M.pdf: 2975676 bytes, checksum: afd715972fbc788aca5b999d67d862a8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Ácido graxo sintase (FASN - fatty acid synthase) é a enzima metabólica responsável pela síntese endógena do ácido graxo saturado palmitato, a partir dos precursores acetil-CoA e malonil-CoA. Diversos estudos mostram que, em contraste com a maioria das células normais, FASN é altamente expressa em vários tipos de neoplasias malignas humanas, tais como as de próstata, mama e melanoma sendo que, em alguns destes tumores, a alta expressão de FASN está associada a um pior prognóstico. Anteriormente demonstramos que a inibição específica da atividade de FASN reduz significativamente a proliferação celular e promove a apoptose em linhagem celular de melanoma murino, B16-F10. O objetivo deste trabalho foi investigar de que maneira a inibição farmacológica de FASN reduz a proliferação de células B16-F10, utilizando a cerulenina, um produto natural do fungo Cephalosporium caerulens, como inibidor de FASN. O tratamento com cerulenina reduziu significativamente a proliferação das células B16-F10 de maneira dose-dependente. Ensaios de lipogênese utilizando 3H2O confirmaram a inibição da atividade de FASN pelo tratamento com cerulenina. Tal inibição resultou em significativo bloqueio da proliferação, conforme evidenciado pelo aumento do número de células nas fases G0/G1, assim como redução de células na fase S, em comparação com os controles. Paralelamente, o tratamento com cerulenina também aumentou o número de células em apoptose. Western blottings, feitos a partir de extratos de células tratadas com cerulenina, mostraram aumento significativo da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1, assim como redução de cdk2, uma Ser/Thr necessária para a transição G1/S, e Skp2, uma proteína necessária para a degradação proteossômica de p27Kip1. Apesar de não ter alterado o conteúdo total de p27Kip1, a inibição de FASN aumentou a quantidade de p27Kip1 co-imunoprecipitada com cdk2. Por outro lado, o tratamento com cerulenina não alterou o conteúdo de outras proteínas envolvidas na progressão das fases G1-S do ciclo celular, tais como cdk4, cdk6, Rb total, ciclina D1 e ciclina E. Em conjunto estes resultados demonstram que a inibição de FASN primeiramente altera os níveis de proteínas envolvidas na transição de G1 para S, tais como p21WAF1/Cip1, p27Kip1 e Skp2, e posteriormente induz apoptose em células de melanoma murino B16-F10 / Abstract: Fatty acid synthase (FASN) is the metabolic enzyme responsible for the endogenous synthesis of the saturated long-chain fatty acid palmitate, from the precursors acetyl-CoA and malonyl-CoA. In contrast to most normal cells, the overexpression of FASN in several human malignancies, such as those of prostate, breast, ovary, melanoma, and soft tissue sarcomas has been associated with poor prognosis. We have previously shown that the specific inhibition of FASN activity significantly reduce proliferation and promote apoptosis in the mouse metastatic melanoma cell line B16-F10. Here we investigated the events involved in cell cycle arrest subsequent to pharmacological FASN inhibition with cerulenin, a natural antifungal antibiotic obtained from Cephalosporium caerulens, in B16-F10 cells. Cerulenin treatment significantly reduced melanoma cells proliferation in a dose dependent manner. Lipogenesis using 3H2O confirmed inhibition of FASN activity after cerulenin treatment. Such enzymatic inhibition culminated in cell cycle arrest, evidenced by a significant increase in G0/G1 phase, as well as decline of the S phase, in comparison with untreated cells. Cerulenin treatment also induced apoptosis in B16-F10 tumor cells. Western blotting analysis of cerulenin-treated cells showed a significant accumulation of the tumor suppressor proteins p21WAF1/Cip1 and p27Kip1, together with decreased amounts of cdk2, a Ser/Thr protein kinase necessary for the G1/S transition, and Skp2, essential for the proteasomal degradation of p27Kip1. Cerulenin treatment increased the levels of p27Kip1 co-immunoprecipitated with cdk2, despite western blotting analysis showed similar content of total p27Kip1. The levels of other proteins involved in G1/S cell cycle progression, such as cdk4, cdk6, total Rb, cyclins A and E, were not affected by FASN inhibition. Collectively these findings suggest that FASN inhibition first modify the levels of proteins involved in transition G1-S, as p21WAF1/Cip1, p27Kip1 and Skp2, to finally induce apoptosis in mouse melanoma B16-F10 cells / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

O estudo do díptero Rhynchosciara americana forneceu informações importantes sobre a biologia cromossômica, por apresentar cromossomos politênicos e amplificação gênica em diferentes órgãos. Dentre os órgãos que apresentam especializações do ciclo celular, o ovário é um dos mais interessantes, possuindo características únicas, como o desenvolvimento sincrônico dos folículos ovarianos e o fato de apresentar uma única e gigante célula nutridora conectada ao ovócito através de um canal citoplasmático. Une em si: meiose no ovócito, célula nutridora com poliploidia seguido de politenia e células foliculares com mitose. Células poliplóides e politênicas possuem cópias extras de DNA genômico através de repetidos ciclos de fase S sem que ocorra a divisão celular, um processo denominado endoreplicação. Os ciclos celulares, são dirigidos pela oscilação da ativação de complexos ciclina/Cdk. Estudos mostraram que a ciclina A atua em células endoreplicativas em Drosophila e a ciclina B inibe ciclos endoreplicativos induzindo a divisão celular. Torna-se relevante investigar a associação dessas moléculas reguladoras do ciclo celular com os ciclos endoreplicativos que ocorrem na ovogênese de R. americana. Perfis de expressão das ciclinas A e B foram detectados nos ovários por RT-PCR ao longo do desenvolvimento. Ensaios de incorporação do nucleosídeo timidina mostraram elevada atividade proliferativa das células foliculares para formar o folículo e o fim da atividade endoreplicativa nas células nutridoras em pupas de 4 dias. Preparações de imunolocalização proteica em ovários na fase de pupa revelaram acúmulo de ciclina A no citoplasma das células nutridoras e dos ovócitos, e acúmulo de ciclina B no citoplasma e na vesícula germinal do ovócito, atuando nos mecanismos meióticos. O estudo de proteínas relacionadas ao ciclo celular nesse modelo é importante para um melhor entendimento dos ciclos celulares incomuns presentes em diferentes órgãos de insetos. / Study of the diptera Rhynchosciara americana has provided important information about chromosome biology, for it displays polytene chromosomes and gene amplification in different organs. Among the organs that possess cell cycle specializations, the ovary is one of the most interesting ones, showing unique characteristics, such as the synchronous development of follicles and the presence of a single giant nurse cell connected to the oocyte through a cytoplasmic channel. This organ gathers: meiosis in the oocyte, nurse cell with polyploidy followed by polyteny, and follicle cells in mitosis. Polyploid and polytene cells have extra copies of genomic DNA obtained via sequential cycles of S phase not followed by cell division, a process called endoreplication. Cell cycles are driven by the oscilation in the activation of different cyclin/CDK complexes. Studies have shown that Cyclin A acts in endoreplicating cells in Drosophila and Cyclin B inhibits endoreplicative cycles, inducing cell division. Thus, it is relevant to investigate the association between these cell cycle-regulating proteins and the endoreplication cycles that occur during the oogenesis of R. americana. Expression profiles of cyclins A and B were evaluated in the ovary via RT-PCR throughout the development. Thymidine nucleoside incorporation assays showed high proliferative activity in follicle cells to build the follicle and the end of endoreplicative activity in nurse cells of 4-day-old pupae. Protein immunolocalization in ovary at the stage of pupa has shown accumulation of Cyclin A in the cytoplasm of nurse cells and oocytes, and accumulation of Cyclin B in the cytoplasm and germinal vesicle of the oocyte, acting on meiosis mechanisms. The study of proteins related to cell cycle in this model is important for a better understanding of uncommon cell cycle in different insect organ.

Introdução: A identificação de mecanismos genéticos envolvidos no processo de carcinogênese do câncer colorretal levou ao surgimento de novas estratégias terapêuticas como a terapia gênica. Através do bloqueio ou estímulo de determinados alvos genéticos ou moleculares seria possível interromper o ciclo celular de células transformadas. Uma das estratégias sugeridas foi a utilização de seqüências anti-sense do gene da ciclina G que revelou resultados iniciais clínicos e experimentais promissores em diversas neoplasias, inclusive na colorretal. Assim seria esperado que a expressão da ciclina G estivesse freqüentemente alterada de maneira seletiva nas células do câncer colorretal quando comparado às células normais. Por estas razões, decidiu-se estudar a expressão da ciclina G em pacientes com câncer do reto. Métodos: Dados clínicos, epidemiológicos, anátomo-patológicos e de sobrevivência de 36 pacientes com câncer do reto foram obtidos e correlacionados com os resultados de expressão imunohistoquímica da ciclina G. O tecido neoplásico e normal distante da lesão primária foram submetidos a reação imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-ciclina G e quantificados através de três métodos: (1) quantitativo, obtido a partir da contagem de células determinando a razão entre o número de células positivas e o número total de células contadas em 10 campos; (2) semi-quantitativo (cruzes), obtido a partir da pontuação em sistema de cruzes conforme a intensidade e quantidade de células positivas em áreas de maior impregnação do corante; (3) semi-quantitativo (escore), obtido a partir da pontuação em sistema de escore (alto ou baixo) conforme a intensidade e quantidade de células positivas em áreas de maior impregnação do corante. O estudo estatístico incluiu teste T de student, Qui-quadrado, exato de Fisher, teste t pareado, Wilcoxon, log-rank e curva ROC sendo considerados significativos quando o valor de p<0,05. Resultados: A expressão da ciclina G foi positiva em 76,5±30% da células contadas, com média de 3,2±1,1 cruzes e escore alto em 32 pacientes no tecido tumoral. No tecido normal dos pacientes a positividade foi de 42,2±27,4%, com média de 1,9±1,1 cruzes e escore alto em 16 casos. Quando comparados os tecidos tumoral e normal de cada paciente, o resultado tumor>normal foi obtido em 28 (77,8%) pacientes (quantitativa), 27 (75%) pacientes (semi-quantitativa/cruzes) e 18 (50%) pacientes (semi-quantitativa/escore). A diferença de expressão entre tecido tumoral e tecido normal maior que 10% apresentou correlação com ausência de metástases sistêmicas enquanto que a diferença maior que 38% apresentou correlação com a ausência de metástases linfonodais (área da curva 0,69 nos dois casos). Houve correlação entre o resultado tumor>normal e a ausência de metástases linfonodais quando o método de quantificação foi semi-quantitativo (cruzes e escore;p=0,02 e 0,04). Não houve correlação entre o resultado tumor>normal e as demais características. Não houve influência do resultado tumor>normal nas curvas de sobrevivência (3 anos). Conclusões: A expressão da ciclina G é maior no tecido neoplásico do câncer colorretal quando comparada ao tecido normal. Apesar disso, a expressão da ciclina G é raramente nula no tecido normal. A expressão de ciclina G tumor>normal esteve associada a ausência de metástases linfonodais quando mensurada através de métodos semi-quantitativos. Apesar disso, a expressão alterada da ciclina G não tem influência sobre sobrevivência precoce em pacientes com câncer do reto. / Introduction: Identification of genetic mechanisms involved in colorectal cancer carcinogenesis led to the development of new treatment strategies such as gene therapy. The aim of this strategy is to interrupt cell-cycle of transformed malignant cells by blocking or stimulating specific gene expression. Utilization of cyclin G antisense constructs has been suggested with clinical and experimental promising results in various neoplasias, including colorectal cancer. In this setting, one would expect that cyclin G would be selectively overexpressed in colorectal cancer cells as opposed to normal tissue. For this reason, we decided to study cyclin G expression in patients with rectal cancer. Methods: Clinical, epidemiological, pathological and survival data from 36 patients with rectal cancer was collected and correlated with Cyclin G immunohistochemical expression. Neoplastic and non-adjacent normal tissue were stained with monoclonal anti-Cyclin G antibody and quantified according to 3 different methods: (1) quantitative, obtained from cell count and determined by the ratio between positive counted cells and total number of counted cells observed in 10 microscopic fields; (2) semi-quantitative (crosses), obtained from a scoring system that takes into account both quantity and intensity of most strongly stained areas; (3) semi-quantitative (score), obtained from a scoring system that takes into account both quantity and intensity of most strongly stained areas. Statistical analysis included ROC curves, student\'s T, Chi-square, Fisher\'s exact, log rank, Wilcoxon, and paired t test. Significant differences were considered for p<0.05. Results: In tumor-tissue, positive Cyclin G expression was observed in 76.5±30% of counted cells, with a mean number of 3.2±1.1 crosses and high expression score in 32 patients (89%). In normal tissue, positive cyclin G expression was observed in 42.2±27.4% of counted cells, with a mean of 1.9±1.1 crossed and high expression score in 16 patients. When comparing tumor and normal tissue within each patient, a result of tumor>normal cyclin G expression was observed in 28 (77.8%) patients (quantitative method), 27 (75%) patients (semi-quantitative crosses) and 18(50%) patients (semi-quantitative score). A difference of cyclin G expression between tumor and normal tissue greater than 10% was associated with the absence of metastatic disease. A difference of cyclin G expression between tumor and normal tissue greater than 38% was associated with the absence of lymph node metastases (ROC curve area of 0.69 in both cases). There was significant association between cyclin G expression tumor>normal result and the absence of lymph node metastases when using semi-quantitative quantification methods (p=0.02 for crosses; p=0.04 for score). There was no association between cyclin G expression and other patient\'s characteristics or survival. Conclusion: Cyclin G expression is greater in tumor tissue when compared to normal tissue in patients with rectal cancer. However, cyclin G expression in normal tissue is rarely absent. Tumor>normal cyclin G expression is significantly associated with absence of lymph node metastases when quantified using semiquantitative methods. However, cyclin G expression had no influence in short-term survival.

Introdução: A identificação de mecanismos genéticos envolvidos no processo de carcinogênese do câncer colorretal levou ao surgimento de novas estratégias terapêuticas como a terapia gênica. Através do bloqueio ou estímulo de determinados alvos genéticos ou moleculares seria possível interromper o ciclo celular de células transformadas. Uma das estratégias sugeridas foi a utilização de seqüências anti-sense do gene da ciclina G que revelou resultados iniciais clínicos e experimentais promissores em diversas neoplasias, inclusive na colorretal. Assim seria esperado que a expressão da ciclina G estivesse freqüentemente alterada de maneira seletiva nas células do câncer colorretal quando comparado às células normais. Por estas razões, decidiu-se estudar a expressão da ciclina G em pacientes com câncer do reto. Métodos: Dados clínicos, epidemiológicos, anátomo-patológicos e de sobrevivência de 36 pacientes com câncer do reto foram obtidos e correlacionados com os resultados de expressão imunohistoquímica da ciclina G. O tecido neoplásico e normal distante da lesão primária foram submetidos a reação imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-ciclina G e quantificados através de três métodos: (1) quantitativo, obtido a partir da contagem de células determinando a razão entre o número de células positivas e o número total de células contadas em 10 campos; (2) semi-quantitativo (cruzes), obtido a partir da pontuação em sistema de cruzes conforme a intensidade e quantidade de células positivas em áreas de maior impregnação do corante; (3) semi-quantitativo (escore), obtido a partir da pontuação em sistema de escore (alto ou baixo) conforme a intensidade e quantidade de células positivas em áreas de maior impregnação do corante. O estudo estatístico incluiu teste T de student, Qui-quadrado, exato de Fisher, teste t pareado, Wilcoxon, log-rank e curva ROC sendo considerados significativos quando o valor de p<0,05. Resultados: A expressão da ciclina G foi positiva em 76,5±30% da células contadas, com média de 3,2±1,1 cruzes e escore alto em 32 pacientes no tecido tumoral. No tecido normal dos pacientes a positividade foi de 42,2±27,4%, com média de 1,9±1,1 cruzes e escore alto em 16 casos. Quando comparados os tecidos tumoral e normal de cada paciente, o resultado tumor>normal foi obtido em 28 (77,8%) pacientes (quantitativa), 27 (75%) pacientes (semi-quantitativa/cruzes) e 18 (50%) pacientes (semi-quantitativa/escore). A diferença de expressão entre tecido tumoral e tecido normal maior que 10% apresentou correlação com ausência de metástases sistêmicas enquanto que a diferença maior que 38% apresentou correlação com a ausência de metástases linfonodais (área da curva 0,69 nos dois casos). Houve correlação entre o resultado tumor>normal e a ausência de metástases linfonodais quando o método de quantificação foi semi-quantitativo (cruzes e escore;p=0,02 e 0,04). Não houve correlação entre o resultado tumor>normal e as demais características. Não houve influência do resultado tumor>normal nas curvas de sobrevivência (3 anos). Conclusões: A expressão da ciclina G é maior no tecido neoplásico do câncer colorretal quando comparada ao tecido normal. Apesar disso, a expressão da ciclina G é raramente nula no tecido normal. A expressão de ciclina G tumor>normal esteve associada a ausência de metástases linfonodais quando mensurada através de métodos semi-quantitativos. Apesar disso, a expressão alterada da ciclina G não tem influência sobre sobrevivência precoce em pacientes com câncer do reto. / Introduction: Identification of genetic mechanisms involved in colorectal cancer carcinogenesis led to the development of new treatment strategies such as gene therapy. The aim of this strategy is to interrupt cell-cycle of transformed malignant cells by blocking or stimulating specific gene expression. Utilization of cyclin G antisense constructs has been suggested with clinical and experimental promising results in various neoplasias, including colorectal cancer. In this setting, one would expect that cyclin G would be selectively overexpressed in colorectal cancer cells as opposed to normal tissue. For this reason, we decided to study cyclin G expression in patients with rectal cancer. Methods: Clinical, epidemiological, pathological and survival data from 36 patients with rectal cancer was collected and correlated with Cyclin G immunohistochemical expression. Neoplastic and non-adjacent normal tissue were stained with monoclonal anti-Cyclin G antibody and quantified according to 3 different methods: (1) quantitative, obtained from cell count and determined by the ratio between positive counted cells and total number of counted cells observed in 10 microscopic fields; (2) semi-quantitative (crosses), obtained from a scoring system that takes into account both quantity and intensity of most strongly stained areas; (3) semi-quantitative (score), obtained from a scoring system that takes into account both quantity and intensity of most strongly stained areas. Statistical analysis included ROC curves, student\'s T, Chi-square, Fisher\'s exact, log rank, Wilcoxon, and paired t test. Significant differences were considered for p<0.05. Results: In tumor-tissue, positive Cyclin G expression was observed in 76.5±30% of counted cells, with a mean number of 3.2±1.1 crosses and high expression score in 32 patients (89%). In normal tissue, positive cyclin G expression was observed in 42.2±27.4% of counted cells, with a mean of 1.9±1.1 crossed and high expression score in 16 patients. When comparing tumor and normal tissue within each patient, a result of tumor>normal cyclin G expression was observed in 28 (77.8%) patients (quantitative method), 27 (75%) patients (semi-quantitative crosses) and 18(50%) patients (semi-quantitative score). A difference of cyclin G expression between tumor and normal tissue greater than 10% was associated with the absence of metastatic disease. A difference of cyclin G expression between tumor and normal tissue greater than 38% was associated with the absence of lymph node metastases (ROC curve area of 0.69 in both cases). There was significant association between cyclin G expression tumor>normal result and the absence of lymph node metastases when using semi-quantitative quantification methods (p=0.02 for crosses; p=0.04 for score). There was no association between cyclin G expression and other patient\'s characteristics or survival. Conclusion: Cyclin G expression is greater in tumor tissue when compared to normal tissue in patients with rectal cancer. However, cyclin G expression in normal tissue is rarely absent. Tumor>normal cyclin G expression is significantly associated with absence of lymph node metastases when quantified using semiquantitative methods. However, cyclin G expression had no influence in short-term survival.

A via Unfolded Protein Response (UPR) é uma via de sinalização ativada pelo estresse do Retículo endoplasmático (ER). Anteriormente descrevemos um Paciente com Imunodeficiência Comum Variável (CVID) que apresenta um atraso na ativação da via UPR associado com o acumulo de imunoglobulinas dentro do ER e uma taxa de proliferação diminuída. Nossos resultados demonstram que a ativação crônica da UPR interrompe o ciclo celular de EBV-B através da quebra da natureza cíclica da ciclina A1. Essa parada é depende da linhagem EBV-B estudada e da droga utilizada. Além disso, a ativação crônica da UPR aumenta a apoptose através da ativação do braço da PERK da via UPR. Células ex-vivo e EBV-B do Paciente P apresentaram uma taxa metabólica muito baixa e numero aumentado de células em apoptose. A deficiência da resposta do paciente P frente a ativação da via UPR parece ser somente no reconhecimento de proteínas não dobradas. Nossos resultados sugerem que a proliferação deficiente observada em diversos paciente com CVID pode ser resultado de uma ativação deficiente da via UPR. / The unfolded protein response (UPR) is a signaling pathway activated by endoplasmic reticulum (ER) stress. Previously we described a patient (Patient P) with Common Variable Immunodeficiency (CVID) whose delayed activation of the UPR associates with accumulation of immunoglobulins and slower rate of proliferation. Our results showed that chronic UPR stress interrupted cell cycling of EBV-B cells through dysruption of the cyclic nature of cyclin A1. This interrption is depend of the cell type and drug. Furthermore, chronic ER stress triggered early apoptosis through activation of the PERK branch of the UPR. EBV-B and ex vivo cells from patient presented low metabolic rate and a high apoptosis rate even in the absence of ER stressors.. We noted that the deficiency of UPR pathway activation by Patient P apears to be on the recognition of unfolded proteins. Our results support the hypothesis that deficient proliferation observed in some CVID patients might be the result of deficient UPR activation.

Rhynchosciara americana é estudada desde a década de 50 quando foi evidenciada a amplificação gênica em regiões de seus cromossomos politênicos. Os fenômenos de amplificação e a formação destes cromossomos gigantes se dão por meio da ocorrência de endociclos, regulados pela oscilação na atividade do complexo ciclinaE/CDK2. Nas glândulas salivares de nosso modelo, durante o desenvolvimento, há ocorrência de cromossomos politênicos. Foi seqüenciada uma mensagem de uma quinase dependente de ciclina (CDK10) que não apresenta qualquer ligação com os endociclos, descrita na literatura. Este transcrito teve sua sequencia revelada por experimentos de 5\'RACE. A sequência genômica foi parcialmente determinada. O perfil de expressão deste gene foi determinado nos ovários, glândulas salivares e corpo gorduroso. A presença da proteína CDK10 foi determinada por experimentos de western blot em glândulas salivares. A localização celular foi determinada nos ovários. Resultados sugerem a existência de duas isoformas deste gene nos tecidos analisados. / Rhynchosciara americana is studied since the 50s decade when gene amplifications was discovered in some regions of its polytene chromosomes. The phenomena of amplification and the formation of these giant chromosomes happens through the endocycles, regulated by an activity oscillation of the complex CyclinE/CDK2. It is known that, in the salivary glands of our model, during it is development, there is the occurrence of these polytene chromosomes, formed since the beginning of the larval life. It was sequenced a message of CDK10, a cyclin depended kinase that shows no participation with the endocycles, as described at the literature. This transcript was fully sequenced by 5\'RACE experiments. Its genomic sequence was partially determined. The relative expression pattern was determined for ovaries, salivary glands and fat body. The CDK10 protein was observed by western blot experiments in the salivary glands. Its cellular location was determined at the ovaries. Results suggest the existence of two isoforms of the RaCDK10 gene at the tissues analyzed.

Rhynchosciara americana é estudada desde a década de 50 quando foi evidenciada a amplificação gênica em regiões de seus cromossomos politênicos. Os fenômenos de amplificação e a formação destes cromossomos gigantes se dão por meio da ocorrência de endociclos, regulados pela oscilação na atividade do complexo ciclinaE/CDK2. Nas glândulas salivares de nosso modelo, durante o desenvolvimento, há ocorrência de cromossomos politênicos. Foi seqüenciada uma mensagem de uma quinase dependente de ciclina (CDK10) que não apresenta qualquer ligação com os endociclos, descrita na literatura. Este transcrito teve sua sequencia revelada por experimentos de 5\'RACE. A sequência genômica foi parcialmente determinada. O perfil de expressão deste gene foi determinado nos ovários, glândulas salivares e corpo gorduroso. A presença da proteína CDK10 foi determinada por experimentos de western blot em glândulas salivares. A localização celular foi determinada nos ovários. Resultados sugerem a existência de duas isoformas deste gene nos tecidos analisados. / Rhynchosciara americana is studied since the 50s decade when gene amplifications was discovered in some regions of its polytene chromosomes. The phenomena of amplification and the formation of these giant chromosomes happens through the endocycles, regulated by an activity oscillation of the complex CyclinE/CDK2. It is known that, in the salivary glands of our model, during it is development, there is the occurrence of these polytene chromosomes, formed since the beginning of the larval life. It was sequenced a message of CDK10, a cyclin depended kinase that shows no participation with the endocycles, as described at the literature. This transcript was fully sequenced by 5\'RACE experiments. Its genomic sequence was partially determined. The relative expression pattern was determined for ovaries, salivary glands and fat body. The CDK10 protein was observed by western blot experiments in the salivary glands. Its cellular location was determined at the ovaries. Results suggest the existence of two isoforms of the RaCDK10 gene at the tissues analyzed.

A via Unfolded Protein Response (UPR) é uma via de sinalização ativada pelo estresse do Retículo endoplasmático (ER). Anteriormente descrevemos um Paciente com Imunodeficiência Comum Variável (CVID) que apresenta um atraso na ativação da via UPR associado com o acumulo de imunoglobulinas dentro do ER e uma taxa de proliferação diminuída. Nossos resultados demonstram que a ativação crônica da UPR interrompe o ciclo celular de EBV-B através da quebra da natureza cíclica da ciclina A1. Essa parada é depende da linhagem EBV-B estudada e da droga utilizada. Além disso, a ativação crônica da UPR aumenta a apoptose através da ativação do braço da PERK da via UPR. Células ex-vivo e EBV-B do Paciente P apresentaram uma taxa metabólica muito baixa e numero aumentado de células em apoptose. A deficiência da resposta do paciente P frente a ativação da via UPR parece ser somente no reconhecimento de proteínas não dobradas. Nossos resultados sugerem que a proliferação deficiente observada em diversos paciente com CVID pode ser resultado de uma ativação deficiente da via UPR. / The unfolded protein response (UPR) is a signaling pathway activated by endoplasmic reticulum (ER) stress. Previously we described a patient (Patient P) with Common Variable Immunodeficiency (CVID) whose delayed activation of the UPR associates with accumulation of immunoglobulins and slower rate of proliferation. Our results showed that chronic UPR stress interrupted cell cycling of EBV-B cells through dysruption of the cyclic nature of cyclin A1. This interrption is depend of the cell type and drug. Furthermore, chronic ER stress triggered early apoptosis through activation of the PERK branch of the UPR. EBV-B and ex vivo cells from patient presented low metabolic rate and a high apoptosis rate even in the absence of ER stressors.. We noted that the deficiency of UPR pathway activation by Patient P apears to be on the recognition of unfolded proteins. Our results support the hypothesis that deficient proliferation observed in some CVID patients might be the result of deficient UPR activation.

Diferentes modelos experimentais têm sido utilizados para estudar a ação trófica do ACTH na supra-renal, e as respostas a esses estímulos parecem ser importantes para proliferação e morte celular in vivo. Essa hipótese foi testada utilizando ratos hipofisectomisados ou tratados com dexametasona, e através da reação de IH avaliamos: 1-a incorporação de BrdU nas diferentes zonas do córtex adrenal estimuladas com ACTH, FGF2 ou N-POMC; 2-se a resposta mitogênica ocorre via receptor MC2R, utilizando um antagonista do ACTH; 3-o número de células do córtex adrenal que entra em apoptose, e se o ACTH recupera o número de células viáveis. Os resultados obtidos mostram que: 1-o ACTH apresenta ação mitogênica nas três zonas do córtex adrenal; 2-a resposta do ACTH ocorre via MC2R; 3-O FGF2 apresenta ação mitogênica apenas nas zonas internas do córtex adrenal; 4-o N-POMC apresenta ação mitogênica na zona glomerulosa; 5-A hipofisectomia induz apoptose nas três zonas do córtex e é prevenida pelo ACTH; 6-a modulação da ciclina E e a CDKIp27 pode estar envolvida na indução do ACTH. / Different experimental models have been used to study the trophic action of ACTH in adrenal, which seems to be important in proliferation and cell death in vivo. This hypothesis was tested using hypophysectomized or dexamethasone treated rats, and through IHC we evaluate: 1-the BrdU incorporation in different adrenal cortex zone after i.p. of ACTH, FGF2 or N-POMC, 2-if the mitogenic response occurs through the MC2R, using for it an antagonist of ACTH, 3-the number of adrenocortical cells which entered into apoptosis, and if ACTH recover this number. The results show that: 1-ACTH is mitogenic in three zone of adrenal cortex; 2-The mitogenic response of ACTH occurs through MC2R; 3-Mitogenic action of FGF2 occurs in the inner zones of adrenal cortex; 4- The N-terminal POMC peptide induces proliferation in the zone glomerulosa; 5- ACTH prevents apoptosis in the adrenal cortex resulting from the surgery, 6- The alteration of cyclin E and CDKI p27 could be a likely molecular mechanism of the effects induced by ACTH.