La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos. / Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos. / Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.

Fundamenta con argumentos ético filosóficos la posibilidad del uso de células madres embrionarias provenientes de embriones tempranos, bajo estrictos controles éticos, científicos y sociales, realizados por comités formados por hombres de ciencia, filósofos, bioéticos, y, eventualmente, representantes de las organizaciones sociales, como grupos de defensa de pacientes, sindicatos y representantes de todas las confesiones religiosas. / Tesis

Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst and have the capacity for unlimited proliferation while retaining their potential to differentiate into a wide variety of cell types when cultured in vitro. These properties have made of human embryonic stem cells (hESC) an excellent model on which to study the conditions required for differentiation into specific cell lineages, and consequently the possibility of transplanting specific cell types into damaged tissues. The continued turn over of ESC while maintaining an undifferentiated state is dependent on unusual cell cycle properties. These unusual proliferative properties are responsible for the generation of tumours when these cells are injected into adult animals. Thus, the study of the unusual proliferative properties of hESC needs to be addressed if their potential is to be realized. To date, most studies of the cell cycle in hESC have been descriptive, lacking functional studies that reveal the mechanisms of how the cell cycle maintains pluripotency and self- renewal of hESC. In this thesis we sought to understand the mechanisms of cell cycle control of hESC. We asked the question if a single cell cycle gene could regulate the self-renewal or pluripotency properties of hESC using a gain and loss of gene function strategy. We have identified that the protein expression of the p27Kip1 cell cycle inhibitor was low in human pluripotent cells, but its expression increased during differentiation together with changes in the cell cycle structure of pluripotent cells. By adopting a gain and loss of function strategy we increased or reduced its expression in undifferentiating conditions to define its functional role in self-renewal and pluripotency of Hesc, using undifferentiation conditions, overexpression of p27Kip1 in hESC lead to a G1 phase arrest with an enlarged and flattened hESC morphology and consequently loss of self-renewal ability. Loss of p27Kip1 caused an increase of self-renewal while maintaining an undifferentiated phenotype. Moreover, we have shown that a change in the balance of p27Kip1 levels in undifferentiated hESC affects expression of the mesoderm markers: BRACHYURY and TWIST. We have found that expression changes of TWIST are associated with the presence of p27Kip1 protein in the TWIST1 gene promoter. The results presented in this thesis have interesting implications in stem cell biology. Firstly, these results define that the maintenance of p27Kip1 protein levels at a certain level is essential for self-renewal and pluripotency of hESC. Secondly, p27Kip1 is involved in the regulation of TWIST which is upregulated in several types of tumours and induces an epithelial-mesenchymal transition to facilitate tumor metastasis. / Las células madre embrionarias humanas (conocidas como hESC por sus siglas en inglés de human embryonic stem cells) son derivadas de la masa celular interna de los blastocistos y poseen la capacidad para auto-renovarse ilimitadamente, reteniendo su potencial para diferenciarse hace una amplia variedad de tipos celulares (pluripotencia), cuando son cultivadas in vitro. Estas propiedades permiten el estudio de las condiciones requeridas para la diferenciación hacia linajes específicos y la posibilidad de trasplantar tipos celulares específicos en tejidos dañados. El continuo recambio de las hESC al mismo tiempo que mantienen un estado de indiferenciación es dependiente de sus inusuales propiedades proliferativas. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio de los mecanismos de control del ciclo celular de las hESC. Nos preguntamos si una única proteína del ciclo celular podría regular las propiedades de auto-renovación o pluripotencia de las hESC. En esta tesis doctoral identificamos que la expresión proteica del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 era baja en diversas líneas celulares humanas pluripotentes pero aumentó durante la diferenciación, al mismo tiempo que la estructura del ciclo celular cambió. Mediante una estrategia de ganancia y pérdida de función, aumentamos o reducimos la expresión de p27Kip1 a fin de definir su función en la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC. En condiciones de indiferenciación, la sobreexpresión de p27Kip1 en las hESC resultó en un arresto del ciclo celular en fase G1 y un cambio hacia una morfología más grande y aplanada, y consiguiente pérdida de la propiedad de auto-renovación. La pérdida de p27Kip1 causó un aumento de la auto-renovación manteniendo un fenotipo indiferenciado. También, hemos demostrado que un cambio en la expresión de p27Kip1 en hESC indiferenciadas afecta la expresión de los reguladores de mesodermo: BRACHYURY y TWIST. Además, hemos descubierto que los cambios en la expresión de TWIST están asociados con la presencia de la proteína p27Kip1 en el promotor de TWIST1. Estos resultados definen que los niveles de expresión de p27Kip1 son críticos para la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC y sugieren una función para p27Kip1 en el control de la transición de epitelio a mesénquima.

A pesar de la abundancia de estudios realizados sobre el papel de las células acinares en las patologías exocrinas del páncreas (i.e. pancreatitis y cáncer), el estudio de las modificaciones producidas durante la diferenciación acinar en dichas patologías, se ha visto limitado por la escasez de modelos celulares no tumorales. Resultados previos de nuestro laboratorio, muestran que las células mES (células madre embrionarias de ratón )- pluripotentes y con la capacidad para generar tipos celulares especializados- pueden desarrollar un fenotipo acinar in vitro. Los objetivos de esta tesis han sido aumentar el contenido de enzimas digestivos así como las propiedades funcionales de las células generadas. Para ello se sobreexpresaron de forma estable p48, RBPJL y Mist1en células madre por transducción lentiviral de estos genes. Obtuvimos, gracias a una estrategia de infección en múltiples etapas, líneas celulares transgénicas mES que expresaban de forma constitutiva RBPJL y/o Mist1. La superimposición de la expresión de p48 por infección lentiviral en células en proceso de diferenciación dio lugar a una fuerte expresión de enzimas digestivos, con un patrón de regulación similar al que acontece in vivo durante el desarrollo pancreático. En esta inducción, tanto p48 como RPBJL son indispensables. Por otro lado, hemos mostrado un aumento elevado en la producción de varios componentes de la maquinaria secretota dependiente de Mist1. Además, hay que hacer notar ,que las células p48/RBPJL/Mist1 exhiben una regulada-secreción en respuesta a los secretagogos acinares y una mejor actividad de que la línea celular acinar 266-6. La expresión combinada de genes clave implicados en el desarrollo pancreático en células ES es un prometedor abordaje que nos llevará a una comprensión de los sutiles procesos del desarrollo exocrino pancreático. / Despite known involvement of acinar cells in pancreatic exocrine pathologies (i.e pancreatitis and pancreatic cancer), the lack of normal cell-based models has limited the study of the alterations that occur in the acinar differentiation program. Our previous data showed that mES (murine embryonic stem) cells, which are pluripotent and have the ability to generate specialized cell types, can acquire an acinar phenotype in vitro. The aim of this work was to increase the digestive enzyme content of the generated cells as well as their functional properties based on stable overexpression of p48, RBPJL and Mist1 by lentiviral gene transduction. Thus, we engineered transgenic mES cell lines constitutively expressing RBPJL and/or Mist1 using a multi-step infection strategy. The superimposition of p48 expression by lentiviral infection of differentiating cells resulted in a strong expression of digestive enzymes, with a pattern of regulation similar to what occurs in vivo during pancreatic development. In this induction, both p48 and RPBJL are indispensable. On the other hand, we showed a high increase in the production of several components of the secretory machinery which was dependent of Mist1. Importantly, p48/RBPJL/Mist1 cells exhibited a regulated-secretory in response to acinar secretagogues and a better secretion activity than the 266-6 acinar cell line. Combined expression of key genes involved in pancreatic development in ES cells may be a promising approach to better understand subtle steps of pancreatic exocrine development.