Orientador: José Maurício Barbanti Duarte / Coorientador: José Maurício Barbanti Duarte / Banca: Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura / Banca: Marcelo Emílio Beletti / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: Por muito tempo Mazama nemorivaga foi considerado sinonímia de Mazama gouazoubira. Atualmente são consideradas espécies distintas conhecidas como Mazama cinzas brasileiros. Apesar de serem morfologicamente identificados como Mazama, há indícios genéticos que estas duas espécies devam ser separadas em dois novos gêneros. Uma forma de contribuir para resolução desta complexidade taxonômica é caracterizar e descrever detalhadamente cada uma das espécies no intuito de auxiliar os estudos filogenéticos, fundamentais para discutir esse problema. Assim, utilizamos dados sobre as características espermáticas para fazer comparações entre as espécies. Através de análises multivariadas discriminantes, de dados de morfometria espermática, identificamos as principais diferenças entre os espermatozoides das duas espécies. Utilizando as técnicas de eletroforese SDS-PAGE bidimensional e espectrometria de massa ESI-Q Tof, comparamos a constituição de proteínas do plasma seminal. Neste trabalho observamos que existem diferenças importantes na dimensão e no formato da cabeça dos espermatozoides das duas espécies, sendo a área e a largura as principais variáveis que as diferenciam. Através das análises discriminantes conseguinos separá-los adequadamente entre os dois grupos de espécies, M. gouazoubira e M. nemorivaga. Ao compararmos o perfil de proteínas totais do plasma seminal, observamos diferenças na distribuição dos spots no gel de poliacrilamida. Além disso, grupos distintos de proteínas foram identificadas no plasma seminal de cada uma das espécies. Esses resultados demonstraram que M. gouazoubira e M. nemorivaga possuem diferenças significativas nas características seminais, o que reforça a hipótese de que dois novos gêneros devem ser criados para cada uma das espécies estudadas / Abstract: Brazilian gray deers are represent by two species: Gray brocket deer (Mazama gouazoubira) and Amazonian brocket deer (Mazama nemorivaga). They belong to genus Mazama, but there are genetic evidence to separate them into two different genera. To contribute to this discution about Mazama taxonomic complexity, we decide to characterize and describe the seminal plasma, of these species, in detail. We performed multivariate analisis to compare sperm morphometry data and identify the main differences between two species. We also used two-dimensional electrophoresis SDS-PAGE techniques and mass spectrometry ESI-Q TOF to compare the constitution of seminal plasma. As result, we found important differences on dimension and shape of the head sperm, being area and width the main variables that differentiate them. Using discriminant analysis, we properly separate them into two groups of species, M. gouazoubira and M. nemorivaga. Comparing the protein profile of the seminal plasma, we observed differences in the distribution of spots, and were identified different groups of proteins in seminal plasma of the distinct species. These results demonstrated that M. gouazoubira and M. nemorivaga have significant differences in the semen characteristics that reinforce the hypothesis that these two species may be separated into two new genera / Doutor

Orientador: Carlos Alberto Vicentini / Banca: Maíra Aparecida / Banca: Silvana Martinez Baraldi Artoni / Resumo: Amostras de sêmen e testículo foram coletadas de exemplares machos e adultos de Piracanjuba (Brycon orbignyanus). Jundiá (Rhamdia quelen) e Piraputanga (Brycon hilarii) no Centro de Aqüicultura da UNESP (CAUNESP) - Jaboticabal - SP (Brasil) e no Centro Nacional de Pesquisa em Peixes Tropicais (CEPTA) - Pirassununga SP (Brasil). Análises macroscópicas evidenciaram características relacionadas à cor, aspecto e volume. Microscopicamente foram avaliadas: Motilidade, viabilidade e concentração dos espermatozóides. Bioquimicamente foram analisados os principais componentes do plasma seminal, íons (sódio, potássio, magnésio e cálcio), osmolaridade e concentração de glicose. Para a realização dos estudos ultraestruturais, fragmentos dos testículos foram fixados em glutaraldeído 2,5% e processados segundo rotina de microscopia eletrônica de transmissão. O objetivo deste trabalho foi analisar, comparativamente, os parâmetros seminais e a estrutura dos espermatozóides de 3 espécies de peixes neotropicais (Piracanjuba, Brycon orbignyanus, Piraputanga, Brycon hilarii e Jundiá, Rhamdia quelen). Na piracanjuba, o sêmen apresentou coloração amarelada e aspecto aquoso. Em jundiá a cor do sêmen é branca e o aspecto cremoso. Na piraputanga a coloração do sêmen é esbranquiçada e o aspecto leitoso. Se comparamos estas características com a concentração espermática encontrada em piracanjuba (2,72 x 109 ± 1,92 x 109 sp/mL), jundiá (4,57 x 1010 ± 1,50 x 1010 sp/mL) e piraputanga (6,46 x 109 ± 2,72 x 109 sp/mL) e com os valores do espermatócrito (5,5%, 93,5% e 16,6% respectivamente), podemos concluir que quanto mais cremoso for o sêmen, maior será sua concentração espermática. A piracanjuba apresentou o menor valor de porcentagem de motilidade espermática (77±6,74%). Por outro lado, observou-se que a composição iônica varia entre as espécies e dentro das... / Abstract: Semen and testes samples were collected of male adults of Piracanjuba (Brycon orbignyanus). Jundiá (Rhamdia quelen) and Piraputanga (Brycon hilarii) in the Aquaculture Center of UNESP (CAUNESP) - Jaboticabal - SP (Brazil) and in the National Center of Research in Tropical Fish (CEPTA) - Pirassununga - SP (Brazil). Macroscopic analyses evidenced characteristics related to the color, aspect and volume. It was microscopically appraised: The motility, viability and cell concentration of the sperm. The main biochemistry components of the seminal plasm, ionic (sodium, potassium, magnesium and calcium), osmolality and glucose concentration were analyzed. For the accomplishment of the ultrastructural studies, fragments of testicular tissue were fixed in glutaraldehyde 2,5% and processed according to transmission electron microscope routine. The aim of this study was analyze comparatively, the seminal parameters and the structure of the spermatozoon of 3 neotropical fish species (Piracanjuba, Brycon orbignyanus, Piraputanga, Brycon hilarii and Jundiá, Rhamdia quelen). In the piracanjuba, the semen is yellowish and with aqueous aspect. In jundiá the color of the semen is white and with creamy aspect. In the piraputanga the coloration of the semen is whitish and milky aspect. Comparing these characteristics with the sperm concentration found in piracanjuba (2,72 x 109 ± 1,92 x 109 sp/mL), jundiá (4,57 x 1010 ± 1,50 x 1010 sp/mL) and piraputanga (6,46 x 109 ± 2,72 x 109 sp/mL) and with the values of the spermatocrit (5,5%, 93,5% and 16,6% respectively), we can observed that the more creamy semen, the bigger the sperm concentration. The piracanjuba presented the smallest value of percentage of sperm motility (77±6,74%). On the other hand, it was observed that the ionic composition varies among the species and inside of the same ones, due to factors as the environment or to the reproduction ... / Mestre

En las zonas alto-andinas del Perú, donde la agricultura y ganadería común no son viables, la crianza de camélidos, como la alpaca, constituye el único medio de subsistencia y principal actividad económica de las familias campesinas. Por tanto, el estudio de la fisiología reproductiva de la alpaca es indispensable para el establecimiento de proyectos de mejoramiento genético y reproducción asistida. Las proteínas que participan en la interacción de los gametos de las alpacas son desconocidas, es por ello que el presente trabajo planteó determinar la expresión proteica y la caracterización de una proteína de Zona Pelúcida (ZP) que induzca espontáneamente la reacción acrosómica (RA) en ovocitos de alpacas. En la mayoría de mamíferos la ZP está conformada por tres glicoproteínas ZP1, ZP2 y ZP3. En el presente trabajo se demostró que en las alpacas existen también 3 glicoproteínas con pesos moleculares de 110 kDa, 75 kDa y 65 kDa correspondientes a ZP1a, ZP2a y ZP3a, respectivamente. La ZP3 es el agonista natural de la RA en espermatozoides de la misma especie, sin embargo, los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que ZP3a es capaz de inducir la RA tanto en espermatozoides de ratón como en los de su propia especie. De esta manera, este estudio ayuda al mejor entendimiento de la naturaleza de las glicoproteínas de ZP en alpacas. / --- In areas of high-Andean Peru, where agriculture and livestock are not viable, the breeding of camels, such as alpaca is the only means of livelihood and main economic activity of farm households. Therefore, the study of the reproductive physiology of alpacas is essential to the establishment of projects in assisted reproduction and genetic improvement. The proteins involved in the interaction of the alpaca’s gametes are unknown; therefore the present determined the protein expression and characterization of a zona pellucida (ZP), which induce the spontaneous acrosome reaction (AR) in oocytes of alpacas. In most mammals, the zona pellucida (ZP) is composed by three glycoproteins ZP1, ZP2 and ZP3. In this research demonstrated that in Alpacas there are also 3 glycoproteins with molecular weights of 110 kDa, 75 kDa and 65 kDa corresponding to aZP1, aZP2 and aZP3, respectively. ZP3 is the natural agonist of the acrosome reaction (AR) in spermatozoa of the same species, however, our results obtained in this research showed that aZP3 can also induce RA in mouse sperm and in their own species. Therefore, this study helps to better understand the nature of the zona pellucida glycoproteins in alpacas. / Tesis

Orientador: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: Em bovinos, a produção in vitro de embriões (PIVE) configura-se como uma das biotecnologias reprodutivas de maior importância no Brasil, sendo responsável pela rápida expansão da raça Senepol em nosso país. Estimar a PIVE em animais Senepol com base na análise seminal dos reprodutores seria valioso para a indústria de criopreservação de sêmen, institutos de pesquisa e criadores da raça. Espermatozoides que diferem quanto ao seu padrão de motilidade coexistem em um ejaculado e podem ser agrupados em diferentes subpopulações espermáticas após análise da cinética com o sistema CASA (Computer-assisted sperm analysis). Aliar essa avaliação com outras análises de qualidade espermática e analisar os resultados com estatísticas multivariadas e inteligência artificial pode ajudar a melhorar a estimativa de fertilidade de um reprodutor. Diante disso, os objetivos no presente estudo foram: 1) identificar e caracterizar as subpopulações espermáticas no sêmen criopreservado de touros Senepol após processo de lavagem para fertilização in vitro (FIV); 2) gerar um modelo estatístico para estimar a PIVE com base nas subpopulações espermáticas e demais atributos espermáticos analisados, utilizando análises estatísticas multivariadas e 3) aplicar a inteligência artificial, por meio do uso das redes neurais artificiais (RNAs) com o intuito de melhorar a estimativa da PIVE. Dados retrospectivos de 386 rotinas de PIVE foram obtidos a partir dos registros pertencentes à empresa In Vitro Brasil e a ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In cattle, in vitro embryo production (IVEP) is one of the most important reproductive biotechnologies in Brazil, being responsible for the rapid expansion of the Senepol breed in our country. Estimating IVEP in Senepol animals based on seminal analysis of breeders would be valuable for the semen cryopreservation industry, research institutes and Senepol cattle breeders. Spermatozoa that differ in their motility pattern coexist in an ejaculate and can be grouped into different sperm subpopulations after kinetic analysis with the CASA system (Computer-assisted sperm analysis). Combining this assessment with other analyzes of sperm quality and analyzing the results with multivariate statistics and artificial intelligence can help to improve a breeder's fertility estimate. Therefore, the objectives in the present study were: 1) identify and characterize sperm subpopulations in cryopreserved semen of Senepol bulls after washing process for in vitro fertilization (IVF); 2) generate a statistical model to estimate IVEP based on the sperm subpopulations and other sperm attributes analyzed, using multivariate statistical analysis and 3) apply artificial intelligence, through the use of artificial neural networks (ANNs) in order to improve the estimate of IVEP. Retrospective data from 386 IVEP routines were obtained from the records belonging to the enterprise In Vitro Brasil and embryonic production was categorized as high, medium and low. After, 38 samples of cryopreserved semen fro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

En el Perú, los estudios sobre peces mesopelágicos, fueron orientados hacia aspectos de taxonomía, distribución espacial y estimación acústica de la biomasa de Vinciguerria lucetia “vinciguerria”. Debido a su importancia tanto en el aspecto nutricional, económico como ecológico, la presente tesis pretende aportar una base científica para posteriores investigaciones, estableciendo una escala histológica de madurez gonadal que permita validar una escala macroscópica para facilitar el manejo de la obtención de datos sin tener que recurrir al uso de sofisticada maquinaria que actualmente es requerida para este tipo de investigación. El sistema reproductor de las hembras de V. lucetia consta de un par de ovarios, los cuales en su parte anterior están unidos por un solo oviducto y van adoptando una forma tubular en su parte media y posterior, terminando en bordes redondeados. Microscópicamente, los ovarios están conformados por una pared, lamelas y un estroma que los sostiene. El sistema reproductor de los machos consta de un par de testículos, de forma ligeramente laminar, con un túbulo de colección común que se engrosa en estadios maduros, microscópicamente, se diferenció una zona de crecimiento (periférica) y una zona de colección (central), en la primera se presentó los túbulos seminíferos y en la segunda los ductos eferentes. En el desarrollo ovocitario se caracterizó por presentar ovogonias y 5 tipos de ovocitos (inmaduro, pre-vitelogénico, vitelogénico, maduro e hidratado). Además de estructuras como folículos post – ovulatorios y atresia. El desarrollo espermatogénico presentó 4 tipos de células espermatogénicas (espermatogonia, espermatocito, espermátida y espermatozoide). La escala de madurez gonadal para hembras validada microscópicamente consta de 5 estadios (inmaduro, en maduración, maduro, desovante y recuperación) y macroscópicamente de 4 estadios (inmaduro, en maduración, maduro y desovante). Para machos, la escala macroscópica de madurez gonadal validada microscópicamente consta de 4 estadios (inmaduro, en maduración, maduro y expulsante). La proporción sexual de la fracción adulta fue favorable para hembras en el periodo de estudio y la talla de primera madurez gonadal para hembras a considerar es de 52 mm. El IGS promedio mostró un mayor valor para las hembras que para los machos, con un promedio de 5.19 ± 2.76 % y 4.38 ± 2.62 % 13 respectivamente. El FC varió para las hembras de 0.20 - 0.87 %, con un promedio de 0.49 ± 0.09 % y para los machos de 0.28 - 0.87 %, con un promedio de 0.51 ± 0.09 %. PALABRAS CLAVES: Vinciguerria lucetia, tipos de ovocitos, tipos de células espermatogénicas, estadios de madurez gonadal, escala de madurez gonadal. / Tesis

Los esfingolípidos de las células germinales y espermatozoides de mamífero son inusuales por contener una alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena (VLCPUFA). En las gametas de rata, la esfingomielina (SM) y la ceramida (Cer) contienen especies con ácidos tetraenoicos y pentaenoicos de la serie n-6 de hasta 32 carbonos, en versiones no hidroxiladas (n-V) y 2-hidroxiladas (h-V). Estudios previos habían mostrado que las SM con VLCPUFA se forman en las células espermatogénicas, que la relación entre h-V SM y n-V SM aumenta con la diferenciación celular, y que ambas terminan localizadas específicamente en las cabezas espermáticas. Posteriormente se vio que estas SM disminuyen a medida que aumentan las Cer en las gametas de rata durante reacciones que ocurren en etapas claves de la fertilización, en especial durante la reacción acrosomal. El objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de las propiedades biofísicas de estos inusuales esfingolípidos y a determinar cómo estas propiedades cambian como resultado de dichos eventos bioquímicos. Nuestro primer desafío fue obtener estas relativamente minoritarias especies moleculares en suficiente cantidad y aceptable pureza. Para ello tomamos ventaja de su estructura química. Así, fracciones conteniendo especies de n-V SM y h-V SM se separaron de las mayoritarias SM saturadas y monoenoicas teniendo en cuenta el alto número de dobles ligaduras de sus ácidos grasos. Luego, de la primera fracción se obtuvieron especies de SM con n-28:4, n-30:5 y n-32:5, y de la segunda especies con h-28:4, h-30:5 y h-32:5, aprovechando las diferencias de hidrofobicidad entre estos ácidos grasos. Estas fracciones y especies se incluyeron en sistemas modelo de bicapa y monocapa, y se estudiaron aplicando metodologías e instrumentación previamente validadas para especies de SM con 16:0, 18:1, o 24:1. Un enfoque similar se aplicó para estudiar las especies de las fracciones n-V Cer y h-V Cer. Al estudiarlas por espectroscopía de fluorescencia, tanto la polarización generalizada (GP) del Laurdan como la anisotropía de fluorescencia (r) del DPH mostraron que la mayoría de las n-V SM y h-V SM compartieron la característica de tener temperaturas de transición (Tt) muy bajas, por debajo de 5 °C, salvo n-32:5 SM y h-32:5 SM, cuyas Tt fueron cercanas a los 22 °C. El aumento en la Tt que podría esperarse debido al inusual largo de la cadena acílica, es pues contrarrestado por la presencia de varias dobles ligaduras en estos ácidos grasos. Estos estudios indicaron que las cadenas acilicas de estas especies se encuentran en un estado desordenado a temperatura fisiológica. Las h-V SM exhibieron mayores valores de GP y de r que las correspondientes especies n-V SM, indicando que el grupo hidroxilo en las primeras tiende a promover las interacciones intermoleculares, probablemente a través de la formación de uniones tipo puente hidrógeno. Las interacciones entre las SM con VLCPUFA y otros lípidos se investigaron empleando sistemas modelo multicomponente en forma de bicapa. En bicapas formadas por dimiristoíl-PC y estas SM, se concluyó que éstas últimas jugarían el rol de lípidos “fluidificantes”, en discrepancia con la noción generalmente aceptada de que en las membranas celulares las SM son las que restringen la movilidad de otros lípidos. En sistemas conteniendo dioleoil-PC, colesterol y n-V o h-V SM, ninguna de éstas tendió a segregarse en dominios condensados enriquecidos en SM/colesterol a temperatura ambiente, tal como sí lo hizo claramente la 16:0 SM. Las dos estrategias experimentales sugirieron que a temperatura fisiológica y en membranas naturales donde las SM con VLCPUFA coexisten con otros lípidos, como es el caso de la membrana plasmática de la cabeza espermática, estas especies no se concentrarían en áreas de la membrana ricas en colesterol, sino en áreas ricas en glicerofolípidos poliinsaturados, esto es, en dominios más “desordenados” de la membrana. Una valiosa información acerca de las propiedades de superficie de las SM en estudio se obtuvo de los experimentos realizados en monocapas de Langmuir. Analizando los valores de la presión de superficie (π) y el potencial de superficie (ΔV), así como los datos de la microscopía de ángulo de Brewster (BAM) en función de la compresión aplicada, se caracterizaron las interacciones intermoleculares durante el empaquetamiento de los lípidos y los cambios termodinámicos implicados en ellas. Las SM con VLCPUFA formaron films con un espesor considerablemente menor al esperado, encontrándose en un régimen líquido-expandido (LE) con una alta libertad conformacional. Sus valores de área molecular media (MMA) fueron llamativamente grandes con respecto a la de las SM conocidas, lo cual indica que un mismo número de moléculas ocupa un área significativamente mayor en la membrana. Las h-V SM mostraron menores MMA que las equivalentes n-V SM, confirmando que el grupo hidroxilo en las primeras favorece las interacciones intermoleculares, permitiendo así un mayor grado de empaquetamiento durante el proceso de compresión, lo que explica que ocupen una menor área en el plano de la membrana. Cuando se obtuvieron las isotermas a 7 °C de las seis especies de SM en estudio, sólo n-32:5 SM y h-32:5 SM mostraron transiciones de fase LE → LC (líquido condensado) de primer orden, otro hallazgo consistente con el comportamiento previamente observado en bicapa. Las seis especies moleculares mayoritarias de Cer con VLCPUFA también fueron separadas y estudiadas en monocapas de Langmuir. Las isotermas de compresión presentaron una transición de fase LE  LC de primer orden a temperatura ambiente, con segregación de dominios durante esta transición que pudo ser seguida mediante BAM. En ambos estados de fase, todas ellas mostraron valores mucho más altos de MMA y ΔV que las especies conocidas usadas como referencia. El empaquetamiento molecular y el grado de ordenamiento de las cadenas fue relativamente menor para las n-V Cer que para las h-V Cer. Estas últimas formaron membranas de mayor espesor, ocuparon una menor área de superficie, y presentaron transiciones de fase LE  LC más pronunciadas y cooperativas que las n-V Cer. Tomados en conjunto, los parámetros termodinámicos y de superficie permiten concluir que estas Cer se organizan con sus ácidos grasos en una conformación curvada, formando monocapas con un espesor menor al esperado, siendo esta característica aún más marcada en las n-V Cer que en las h-V Cer. Mientras las propiedades reológicas de la h-28:4 SM fueron similares a las de otras especies de SM, las de la h-28:4 Cer fueron atípicas. Así, la fase LC de ésta fue altamente compresible, lo que es consistente con una gran libertad conformacional de sus cadenas hidrofóbicas, pero la difusión en ella, estuvo muy restringida, presentando un coeficiente de difusión (D) 100 veces más bajo que su contraparte h-28:4 SM. Las propiedades de mezclas en que coexisten h-28:4 SM y h-28:4 Cer fueron estudiadas mediante la pre-mezcla de distintas proporciones de ambas y mediante la generación de la última por acción de una esfingomielinasa colocada en la subfase de un film de h-28:4 SM. Ambos enfoques evidenciaron que la Cer tiende a separarse de la fase fluida en que se encuentra la SM, formando dominios ricos en Cer a medida que aumenta la relación molar Cer/SM. A temperatura fisiológica, estos dominios mostraron una morfología y una organización estructural sobre la superficie del film que difirieron marcadamente de los que exhibió la 16:0 Cer. Tomadas en conjunto, las presentes observaciones podrían ser relevantes para la reorganización estructural que se sabe ocurre sobre la cabeza espermática durante la reacción acrosomal, al completarse la cual la mayor parte de las SM con VLCPUFA preexistentes se convierten en las correspondientes Cer. / The sphingolipids of mammalian germ cells and spermatozoa are unique in that they are made up by a high proportion of very long chain polyunsaturated fatty acids (VLCPUFA). In the rat gametes, sphingomyelin (SM) and ceramide (Cer) contain species with tetraenoic and pentaenoic fatty acids of the n-6 series with up to 32 carbon atoms, in non-hydroxylated (n-V) and 2-hydroxylated (h-V) forms. Previous studies had shown that the SM with VLCPUFA are formed in spermatogenic cells, that the ratio between h-V SM and n-V SM increases with germ cell differentiation, and that both up localized specifically on the sperm heads. Then it was seen that these SM decrease as Cer increase in rat gametes during reactions that take place in key stages of fertilization, especially during the acrosomal reaction. The aim of this work was to contribute to the knowledge of the biophysical properties of these unusual sphingolipids and to determine how such properties change as a result of these biochemical events. Our first challenge was to obtain these relatively minor molecular species in sufficient amounts and with acceptable purity. To this aim we took advantage of their chemical structure. Thus, fractions containing n-V SM and h-V SM species were separated from the major saturated and monoenoic SM taking into account the high number of double bonds of their fatty acids. Then, SM species containing n-28:4, n-30:5 and n-32:5 from the first fraction, and SM species with h-28:4, h-30:5 and h-32:5 from the second one, were obtained by making use of the differences in hydrophobicity among their fatty acids. These fractions and species were included in bilayer and monolayer model systems and studied by applying methodologies and instrumentation previously validated for SM species with 16:0, 18:1 and 24:1. A similar approach was applied to study the species in the n-V Cer and h-V Cer fractions. When studied by fluorescence spectroscopy, both the generalized polarization (GP) of Laurdan and the fluorescence anisotropy (r) of DPH showed that most of the n-V SM and h-V SM shared the characteristic of having very low transition temperatures (Tt), both below 5 °C, except n-32:5 SM and h-32:5 SM, whose Tt values were around 22 °C . The increase in Tt that could have been expected to result from the unusual length of the acyl chains is thus counteracted by the presence of several double bonds in these fatty acids. These studies indicated that the acyl chains of these species are in a disordered state at physiological temperature. The h-V SM exhibited higher GP and r values than the corresponding n-V SM species, indicating that the hydroxyl group in the former tends to promote intermolecular interactions, probably through the formation of hydrogen-bond type of unions. The interactions between SM with VLCPUFA and other lipids were investigated by employing multicomponent lipid systems in bilayer form. In bilayers formed by dimiristoyl-PC and these SM, it was concluded that the latter played the role of “fluidifying” lipids, in discrepancy to the generally accepted notion that in cell membranes the SMs are lipids that restrict the mobility of other lipids. In systems containing dioleoyl-PC, cholesterol and n-V SM or h-V SM, neither of these tended to segregate in SM/cholesterol-rich domains at room temperature, as clearly did 16:0 SM. Both experimental strategies suggested that at physiological temperature and in natural membranes were VLCPUFA-containing SM coexist with other lipids, as is the case of the plasma membrane of the sperm head, these species would not concentrate in cholesterol-rich membrane areas, but in areas rich in polyunsaturated fatty acids, namely in more “disordered” domains of the membrane. Valuable information about the surface properties of the SM under study was obtained from the experiments performed in Langmuir monolayers. By analyzing the values of surface pressure (π) and surface potential (ΔV), and the data from Brewster angle microscopy (BAM) as a function of the compression applied, the intermolecular interactions during the lipid packing and the thermodynamic changes implied in these interactions were characterized. The VLCPUFA-containing SM formed films with a considerably smaller thickness than that expected, and they were found in a liquid-expanded (LE) state with a high conformational freedom. The values of their mean molecular areas (MMA) were markedly high compared with those of best-known SM species, indicating that the same number of molecules occupies an area significantly larger in the membrane. The h-V SM species displayed lower MMA values than the equivalent n-V SM, confirming that the hydroxyl group in the former facilitates intermolecular interactions, thereby allowing a higher degree of packing during the compression process, and explaining that they occupy a smaller area in the plane of the membrane. When the isotherms of the six SM under study were obtained at 7 °C, only n-32:5 SM and h-32:5 SM exhibited first order LE → LC phase transitions, another finding consistent with the behavior previously observed in bilayer. The six major molecular species of Cer with VLCPUFA were also separated and studied in Langmuir monolayers. The compression isotherms showed that they underwent a first-order LE → LC (liquid condensed) phase transition at room temperature, the segregation of domains during that transition being clearly followed by means of BAM. In both phase states, all of them had MMA and ΔV values far higher than the Cer species used as reference. The molecular packing and degree of ordering of the chains were relatively lower for the n-V Cer than for the h-V Cer. The latter formed thicker films, occupied lower surface areas, and presented more pronounced and cooperative LE → LC phase transitions than the n-V Cer. Taken together, the thermodynamic and surface behavior parameters allow to conclude that these Cer species organize with their fatty acids in a curved conformation, forming monolayers with a lower than expected thickness, this feature being more marked for the n-V Cer than for the h-V Cer. Whereas the rheological properties of h-28:4 SM were similar to those of other SM species, those of h-28:4 Cer were atypical. Thus, the LC phase of the latter was highly compressible, in agreement with a high conformational freedom of their hydrophobic chains, but the diffusion in such phase was highly restricted, showing a diffusion coefficient (D) 100-fold lower than that of h-28:4 SM. The properties of mixtures in which h-28:4 SM and h-28:4 Cer coexist were studied by mixing them in different proportions and by generating the latter by the action of a sphingomyelinase placed in the subphase of an h-28:4 SM film. Both approaches evidenced that Cer tends to separate from the fluid phase of SM, forming Cer-rich domains as the molar Cer/SM ratio increases. At physiological temperature, these domains had a morphology and structural organization on the film surface that markedly differed from those displayed by 16:0 Cer. Taken together, the present observations could be relevant to the structural reorganization of the membrane that is known to take place on the sperm head during the acrosomal reaction, after the completion of which a major part of the preexisting VLCPUFA-rich SM are converted into the corresponding Cer.

El estudio evaluó el efecto de la suplementación de L- cisteína al dilutor tes-tris-yema sobre la calidad post descongelación de espermatozoides de Vicugna pacos “alpaca”. Con este propósito, dieciséis muestras de espermatozoides epididimarios fueron colectados de alpacas en el Camal Municipal de Huancavelica - Perú, durante un período de cuatro semanas. Cada muestra se diluyó en el dilutor Tes-Tris-Yema de huevo y se dividió en cuatro alícuotas, conteniendo diferentes concentraciones del antioxidante: L-cisteína 0 mM (tratamiento control), L- cisteína 2.5 mM (tratamiento 1), L-cisteína 5 mM (tratamiento 2) y L-cisteína 10 mM (tratamiento 3). Luego las suspensiones espermáticas fueron cargadas en pajillas (0,25 mL) y criopreservadas mediante la metodología de congelamiento lento programado en un congelador de velocidad controlada, finalmente las pajillas se almacenaron en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 50 ° C durante 7 seg, la movilidad, vitalidad, integridad de membrana plasmática y acrosómica de los espermatozoides; fueron evaluados post descongelación. Los resultados de este estudio mostraron que la suplementación de 2.5 mM de L- cisteína en el medio dilutor de criopreservación mejora significativamente la movilidad y la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides después de la descongelación, en comparación con los demás tratamientos y el grupo control (p < 0.05). Se concluye que la adición de L- cisteína a bajas concentraciones (2.5 mM) en el dilutor proporciona un efecto crioprotector sobre los parámetros espermáticos post descongelación en alpaca. / The present study evaluated the effect of L-cysteine supplementation to tes-tris-yolk extender on the post-thaw quality of Vicugna pacos “alpaca” sperm. For this purpose, sixteen epididymal sperm samples were collected from male alpaca in the Camal Municipal of Huancavelica - Perú, in a period of four weeks (three replicates). Each sample was diluted in tes-tris-yolk extender and divided into four aliquots of different concentrations of antioxidant: 0 mM L-cysteine (Control), 2.5 mM L-cysteine (Treatment 1), 5 mM L-cysteine (Treatment 2) and 10 mM L-cysteine (Treatment 3). Then the sperm suspensions were loaded in straws (0.25 mL) and were cryopreserved using the slow freezing methodology in a controlled-rate freezer. Finally the straws were stored in the liquid nitrogen. Thawing was performed, at 50°C for 7 s and the sperm motility, viability, plasma membrane and acrosomal integrity were assessed post-thaw. The results of this search show that the supplementation of L-cysteine 2.5 mM to tes-tris-yolk extender significantly improved the motility and plasma membrane integrity compared to the other treatments and the control group (P < 0.05). It is concluded that the addition of L-cysteine (2.5 mM) in the extender gave a cryoprotective effect on the alpaca sperm parameters post-thaw.

El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar los cambios en las características clínicas, seminales y endocrinas en carneros con aislamiento escrotal térmico. Se utilizaron 12 animales adultos de raza Merino, distribuidos al azar en dos grupos: a) Control: n = 4 y b) Tratado: n = 8. Los animales del grupo tratado fueron sometidos a aislamiento escrotal con una bolsa de algodón cubierta con plástico para elevar la temperatura a 39.0 ± 0.5 °C por 48 horas. Se registraron cambios en volumen del eyaculado, consistencia testicular, circunferencia escrotal; concentración; motilidad masal (0 - 5); motilidad individual (%) ; anormalidades espermatozoides (%); perfiles endocrinos de testosterona y LH. Se realizó la colección de semen por electroeyaculación, tres veces por semana y para la determinación hormonal, los animales fueron canulados en la vena yugular y se tomó muestras de sangre por 6 horas a intervalos de 15 minutos. Las muestras fueron analizadas mediante radioinmunoanálisis. El periodo de evaluación fue de 35 días. Los resultados señalan cambios en la circunferencia escrotal de 30.43 ± 1.1 (inicio) a 25.00 ± 0.5 cm (semana 5). No se registraron cambios en volumen pero si en concentración espermática a partir de la segunda semana. En motilidad masal se registraron observaciones de valores 0 a partir de la semana 2 y 2.45 ± 3.1 en motilidad individual en la semana 2. El porcentaje de anormales se incremento a 82.3 ± 29.3 % en la semana 3, siendo las anormalidades de cabeza sola, cola doblada y gota citoplasmática, las principales anormalidades observadas. Las concentraciones de Testosterona disminuyen a partir de la semana 2 (280 ± 83 pg/ml) y se incrementan las concentraciones de LH a 0.96 ± 0.72 a partir de la semana 2, con la presencia de un mayor número de pulsos de LH (0.92 ±0 33 / 6 horas). Se concluye que la aplicación de bolsas de algodón, para incrementar la temperatura a nivel del testículo producen cambios en las características clínicas, seminales, proporción de espermatozoides normales, concentración, motilidad masal e individual y cambios en las concentraciones hormonales de Testosterona y LH, por lo que se recomienda adecuadas prácticas de manejo para evitar efectos del incremento de la temperatura a nivel escrotal y las consiguientes deficiencias en el comportamiento reproductivo de los animales machos.

El objetivo del presente estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Los testículos/epidídimos fueron obtenidos después de la orquiectomía de 20 caninos adultos aparentemente saludables con edades entre 1 y 8 años. Los testículos/epidídimos fueron colocados en cloruro de sodio al 0.9% y almacenados a 5ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo suspendido en dilutor Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor) se le añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5ml, las cuales fueron sometidas a una curva de enfriamiento para luego ser colocadas en nitrógeno líquido. Los parámetros evaluados fueron: Motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana; parámetros que fueron analizados antes y después de la criopreservación. Adicionalmente se obtuvieron datos sobre morfología y concentración, evaluadas sólo antes de la criopreservación. Todos los parámetros evaluados disminuyeron gradualmente a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, los cuales al ser evaluados a las 48 horas de almacenamiento, antes y después del proceso de criopreservación, no variaron significativamente con respecto a los evaluados a las 0 horas. Sin embargo, cabe resaltar que todos los valores obtenidos después del proceso de criopreservación fueron marcadamente inferiores a los obtenidos antes del proceso. / --- The aim of this study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve sperm from the tail of the epididymis of canine post-orchiectomy. The testes/epididymides were obtained by orchiectomy of 20 apparently healthy adult dogs between 1 to 8 years old. The testes/epididymides were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 ° C for 0, 24, 48 and 72 hours. Sperm were recovered by cutting the tail of the epididymis dilutor suspended in Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, the diluted sample (sperm + dilutor) was added egg yolk (20%) and glycerol (5%). The new dilution was packaged in 0.5ml straws, which were subjected to a cooling curve to be later placed in liquid nitrogen. The parameters evaluated were: Total motility, progressive motility and membrane functional integrity; parameters were analyzed before and after cryopreservation. Additionally, data were obtained on morphology and concentration, evaluated just before the cryopreservation. All evaluated parameters decreased gradually when the storage time increased. Such parameters to be evaluated at 48 hours of storage, before and after the cryopreservation process, did not differ significantly from those evaluated at 0 hours. However, it is noted that all values obtained after the cryopreservation process were markedly lower than those obtained before process.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La adecuada interacción de los gametos depende de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la capacitación y reacción acrosómica, procesos esenciales para la fecundación del ovocito y que pueden verse afectados por el proceso de refrigeración espermática. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides refrigerados de perro, a través de la capacidad de unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra madurados in vitro. El semen se obtuvo de la estimulación digital a 5 perros adultos. Un total de 9 eyaculados provenientes de los mismos perros, fueron procesados como muestras frescas o refrigeradas. Posterior a la evaluación seminal, el plasma seminal fue retirado por centrifugación. Los espermatozoides frescos se resuspendieron inmediatamente en Fert Talp y los espermatozoides a refrigerar se resuspendieron en diluyente en base a TRIS - yema de huevo - ácido cítrico - fructuosa y se conservaron a 4ºC por 24 horas, para luego ser mantenidos a 37°C por 10 minutos y posteriormente centrifugados para retirar el diluyente. Luego, los espermatozoides frescos (control) y refrigerados, fueron incubados en Fert Talp para capacitación in vitro, a temperatura ambiente (20°C) durante 0 a 3 horas y, posterior a cada tiempo de incubación, co-incubados con ovocitos madurados in vitro. Posterior a la co-incubación, los ovocitos inseminados fueron lavados y luego procesados separadamente para ser examinados bajo microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia de epifluorescencia. Para MEB, se evaluaron un total de 318 ovocitos (174 y 134 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente). El análisis de MEB consideró un ovocito con espermatozoides unidos cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides adheridos a la zona pelúcida ovocitaria (ZP), y un ovocito con espermatozoides penetrados cuando se encontraron uno o más espermatozoides atravesando la ZP. Para la microscopia de epifluorescencia se evaluaron un total de 466 ovocitos (219 y 247 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente), considerando un ovocito con espermatozoides unidos cuando se encontraron uno o más espermatozoides adheridos a la ZP y ovocito con epermatozoides penetrados cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides atravesando la ZP, en el espacio perivitelino o dentro del citoplasma ovular. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento de Regresión Logística Binomial (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA). Tanto en MEB como en microscopia de epifluorescencia, los resultados de fecundación in vitro con espermatozoides frescos y refrigerados, no mostraron diferencias significativas en la unión ni en la penetración espermática (p≥0,05), a través de los diferentes tiempos de capacitación. Asimismo, al comparar entre ambos tipos de espermatozoides, la unión y penetración en los diferentes tiempos de capacitación, no se evidenciaron diferencias significativas entre ellos (p≥0,05). En conclusión, los espermatozoides frescos y refrigerados caninos, capacitados in vitro durante 0 a 3 horas, no difieren en su capacidad para unirse y penetrar la ZP de ovocitos de perra madurados in vitro / Proyecto Fondecyt 1060602