Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 3 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 4 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 5 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5) Publico-12671e.pdf: 132448 bytes, checksum: 7153a9583a94f50f2a56c79c6d7d320a (MD5) / O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular. / Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O crescimento gengival induzido por ciclosporina-A (CG) é caracterizado por uma variedade de sinalizações que envolvem fatores de crescimento e proteoglicanos, porém pouco compreendidas. Investigamos a expressão gênica dos proteoheparans sulfato de superfície celular sindecam-2 (SDC-2), -4 (SDC-4) e betaglicam nesse CG. A quantidade total e relativa de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) e a distribuição de SDC-2 e SDC-4 no tecido gengival também foram analisadas. Métodos: A expressão de mRNA dos proteoglicanos SDC-2, SDC-4 e betaglicam foi analisada pela reação de polimerase em cadeia e transcrição reversa (RT-PCR) em amostras gengivais de 9 indivíduos com CG (grupo CsA) e 6 com gengiva normal (grupo controle). Os GAGs foram extraídos e purificados dos tecidos gengivais e analisados tanto por eletroforese em gel de agarose quanto por espectrofotometria. Foi realizada uma avaliação imunohistoquímica dos tecidos com anticorpos para SDC-2 e SDC-4, para sua localização nos tecidos. Os grupos foram comparados pelo teste t de Student. Resultados: Todos os proteoglicanos estudados mostraramse aumentados no grupo CsA (165% para SDC-2, 308% para SDC-4 e 42% para betaglicam), comparativamente ao grupo controle (P < 0.0001). Não foram observadas diferenças significativas na quantidade total e relativa de GAGs. A imunohistoquímica mostrou uma distribuição marcante de SDC-2 e SDC-4 no componentes epitelial, conjuntivo, vascular, nervoso e inflamatório, incluindo os compartimentos celulares e matriciais de toda a casuística. Nossos resultados revelam expressão aumentada de mRNA de SDC-2, SDC-4 e betaglicam no crescimento gengival induzido pela ciclosporina-A, porém não se observaram diferenças na quantidade de glicosaminoglicanos sulfatados em relação ao tecido gengival não exposto ao fármaco. / Cyclosporin-induced gingival overgrowth (CIGO) comprises a variety of signaling pathways including growth factors and proteoglycans that remains not fully understood. We investigated the gene expression of the cell-surface heparan sulfate proteoglycans syndecan-2 (SDC-2), -4 (SDC-4) and betaglycan in CIGO. Total and relative amounts of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and the distribution of SDC-2 and SDC-4 in the gingival tissue were also analyzed. Methods: mRNA expression of the proteoglycans SDC-2, -4 and betaglycan was analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in gingival samples obtained from 9 individuals with CIGO and 6 with a normal gingiva (control group). GAGs were extracted and purified from gingival tissues and analyzed by agarose gel electrophoresis and spectrophotometry. An immunohistochemical evaluation using panels of antibodies for SDC-2 and -4 was performed for localization in the tissues. Groups were compared by the Student's t test. Results: All proteoglycans expressions revealed increase in the CIGO group (165% for SDC-2, 308% for SDC-4 and 42% for betaglycan) compared to the control group (P < 0.0001). No significant differences were observed for the total and relative amounts of GAGs. Immunohistochemistry showed a marked distribution of SDC-2 and SDC-4 in gingival epithelial, connective, vascular, neural and inflammatory components comprising cellular and matrix environments in both groups. Our results reveal increased mRNA expression of SDC-2, SDC-4 and betaglycan in CIGO, but no significant differences in the sulfated glycosaminoglycans component in situ.

O crescimento gengival induzido por ciclosporina-A (CG) é caracterizado por uma variedade de sinalizações que envolvem fatores de crescimento e proteoglicanos, porém pouco compreendidas. Investigamos a expressão gênica dos proteoheparans sulfato de superfície celular sindecam-2 (SDC-2), -4 (SDC-4) e betaglicam nesse CG. A quantidade total e relativa de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) e a distribuição de SDC-2 e SDC-4 no tecido gengival também foram analisadas. Métodos: A expressão de mRNA dos proteoglicanos SDC-2, SDC-4 e betaglicam foi analisada pela reação de polimerase em cadeia e transcrição reversa (RT-PCR) em amostras gengivais de 9 indivíduos com CG (grupo CsA) e 6 com gengiva normal (grupo controle). Os GAGs foram extraídos e purificados dos tecidos gengivais e analisados tanto por eletroforese em gel de agarose quanto por espectrofotometria. Foi realizada uma avaliação imunohistoquímica dos tecidos com anticorpos para SDC-2 e SDC-4, para sua localização nos tecidos. Os grupos foram comparados pelo teste t de Student. Resultados: Todos os proteoglicanos estudados mostraramse aumentados no grupo CsA (165% para SDC-2, 308% para SDC-4 e 42% para betaglicam), comparativamente ao grupo controle (P < 0.0001). Não foram observadas diferenças significativas na quantidade total e relativa de GAGs. A imunohistoquímica mostrou uma distribuição marcante de SDC-2 e SDC-4 no componentes epitelial, conjuntivo, vascular, nervoso e inflamatório, incluindo os compartimentos celulares e matriciais de toda a casuística. Nossos resultados revelam expressão aumentada de mRNA de SDC-2, SDC-4 e betaglicam no crescimento gengival induzido pela ciclosporina-A, porém não se observaram diferenças na quantidade de glicosaminoglicanos sulfatados em relação ao tecido gengival não exposto ao fármaco. / Cyclosporin-induced gingival overgrowth (CIGO) comprises a variety of signaling pathways including growth factors and proteoglycans that remains not fully understood. We investigated the gene expression of the cell-surface heparan sulfate proteoglycans syndecan-2 (SDC-2), -4 (SDC-4) and betaglycan in CIGO. Total and relative amounts of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and the distribution of SDC-2 and SDC-4 in the gingival tissue were also analyzed. Methods: mRNA expression of the proteoglycans SDC-2, -4 and betaglycan was analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in gingival samples obtained from 9 individuals with CIGO and 6 with a normal gingiva (control group). GAGs were extracted and purified from gingival tissues and analyzed by agarose gel electrophoresis and spectrophotometry. An immunohistochemical evaluation using panels of antibodies for SDC-2 and -4 was performed for localization in the tissues. Groups were compared by the Student's t test. Results: All proteoglycans expressions revealed increase in the CIGO group (165% for SDC-2, 308% for SDC-4 and 42% for betaglycan) compared to the control group (P < 0.0001). No significant differences were observed for the total and relative amounts of GAGs. Immunohistochemistry showed a marked distribution of SDC-2 and SDC-4 in gingival epithelial, connective, vascular, neural and inflammatory components comprising cellular and matrix environments in both groups. Our results reveal increased mRNA expression of SDC-2, SDC-4 and betaglycan in CIGO, but no significant differences in the sulfated glycosaminoglycans component in situ.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Durante a metastase, as celulas perdem seu contato tecidual original, movem-se pela matriz extracelular (MEC), invadem o sistema linfatico e/ou sanguineo, extravasam e formam novos tumores. Devido a isso, essas celulas tumorais precisam modificar sua adesao celula-MEC. Receptores de adesao exercem papeis cruciais na transformacao neoplasica de celulas normais atraves da inducao de comportamentos celulares e morfologicos especificos do cancer. Isto implica que celulas tumorais provavelmente expressam e utilizam um conjunto distinto de receptores de adesao celular durante e carcinogenese. Sindecam-2 e um proteoglicano transmembranico de heparam sulfato (HS) que participa da formacao de dominios especializados na membrana plasmatica e funciona diretamente como um vinculo entre o ambiente extracelular e a organizacao do citoplasma cortical. Em diversas linhagens celulares de cancer colorretal, a expressao de sindecam-2 encontra-se aumentada, quando comparada com linhagens normais, e este aumento parece ser critico para o comportamento das celulas cancerosas, uma vez que regula sua adesao e proliferacao, e, portanto, sua atividade tumorigenica. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que em celulas de carcinoma colorretal altamente metastaticas, pertencentes a linhagem HCT-116, a expressao e a sintese de sindecam-2 sao intensificadas na presenca de MEC produzida por fibroblastos. Os demais sindecans sofrem diminuicao, assim como o HS presente na MEC produzida pelas celulas tumorais. Entre os componentes da MEC estromal, a fibronectina mostrou-se como principal responsavel pelo aumento de sindecam-2. Houve co-localizacao entre sindecam-2, integrina ƒÑ5ƒÒ1 e fibronectina, o que sugere a participacao destas moleculas no mecanismo de adesao em celulas HCT-116. Alem disso, o bloqueio de sindecam-2 resultou na nao formacao de fibras de estresse durante a adesao celular, indicando seu importante papel na regulacao de filamentos de actina. Fica claro, portanto, o papel fundamental da MEC estromal na regulacao da expressao de proteinas de superficie celular e provavelmente na sinalizacao para o interior de celulas cancerosas, modificando sua proliferacao, adesao e seu formato. / During metastasis cells lose their original tissue contacts, move through the extracellular matrix (ECM), enter the lymphatic and/or blood system, extravasate and subsequently form new tumors. Therefore, these tumor cells must experience changes in cell-ECM adhesion. Adhesion receptors play crucial roles in the neoplastic transformation of normal cells through the induction of cancer-specific cellular behavior and morphology. This implies that cancer cells likely express and utilize a distinct set of adhesion receptors during carcinogenesis. Syndecan-2 is a transmembrane heparan sulfate (HS) proteoglycan which has been implicated in the formation of specialized membrane domains and functions as a direct link between the extracellular environment and the organization of the cortical cytoplasm. In several colon-rectal cancer cell lines, syndecan-2 is highly expressed compared to normal cell lines. This increase appears to be critical for cancerous cell behavior since it regulates adhesion and proliferation and therefore the tumorigenic activity. The results of this study showed that in a highly metastatic colon-rectal cancer cell line, HCT-116, both expression and synthesis of syndecan-2 are enhanced when grown on ECM produced by fibroblasts. The expression of the others syndecans decreased, as did HS in the ECM produced by the cancer cells. Among the stromal components of ECM, the fibronectin was shown to be important for the increase of syndecan-2. Co-localization between syndecan-2, integrin ƒÑ5ƒÒ1 and fibronectin, suggests the involvement of these molecules in the adhesion mechanism of HCT-116 cells. Furthermore, blocking syndecan-2 with an antibody resulted in the absence of stress fibers during cell adhesion, indicating its important role in the regulation of actin filaments. Thus, the stromal ECM has a fundamental role in regulating the expression of cell surface proteins and probably signaling to the interior of cancer cells by altering their proliferation and adhesion, and its format. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações