O espaço intergênico (IGS) juntamente com suas subunidades flanqueadoras (cpcB) e (cpcA) do operon do ficocianina foi usado para identificar linhagens de cianobactérias. Dentro do domínio Bacteria somente as cianobactérias possuem o operon da ficocianina e a região cpcBA-IGS é suficientemente variável para diferenciar linhagens desses microrganismos. No presente estudo 25 linhagens de cianobactérias isoladas de diversos locais brasileiros foram caracterizadas usando a seqüência cpcBA-IGS. DNA genômico foi extraído das ordens Chroococcales (oito linhagens), Oscillatoriales (duas linhagens), Nostocales (onze linhagens) e Stigonematales (quatro linhagens). Os oligonucleotídeos iniciadores PCβF/PCαR, específicos para a seqüência cpcBA-IGS, foram usados para amplificar fragmentos de DNA de aproximadamente 685 pb. Os produtos da PCR foram clonados, seqüenciados e as seqüências foram comparadas pela análise BLAST. Todas as seqüências de Microcystis e também as seqüências de Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 e Gloeotrichia UFV-B2 mostraram identidades com seqüências do GenBank. Entretanto, nenhuma identidade foi encontrada para as seqüências restantes. As relações filogenéticas das seqüências de cpcBA-IGS foram investigadas junto com outras seqüências de cianobactéria do Genbank usando a análise “Neighbour Joining". A topologia da árvore foi congruente com outras árvores de cianobactérias, com exceção de todas as seqüências sem identidades no GenBank, as quais formaram um agrupamento separado. Os dados das seqüências de cpcBA-IGS analisadas confirmam que as cianobactéria heterocitadas formam um grupo monofilético. Estudos anteriores realizados com linhagens de cianobactéria mostraram que estes microrganismos são uma fonte rica de produtos naturais. No presente estudo conduzido com 59 linhagens de cianobactérias, sendo a maioria isolada de ambientes brasileiros, isto foi confirmado. Para alcançar esse objetivo, dois conjuntos de iniciadores degenerados foram usados para produzir seqüências amplificadas por PCR das sintetases de peptídeos não-ribossômicos (NRPSs), e de sintases policetídeos (PKSs) modulares, as quais são enzimas multifuncionais envolvidas na produção de produtos naturais. O sistema híbrido NRPS/PKS também foi amplificado por PCR usando uma combinação de iniciadores de NRPS e de PKS. Essa abordagem molecular mostrou a presença de genes de NRPS e de PKS em 93% e 81% linhagens de cianobactérias, respectivamente. Genes de NRPS/PKS foram encontrados em 87% das cianobactérias examinadas. Numa tentativa de atribuir funções a oito fragmentos de PKS identificados por PCR, estas seqüências foram clonadas, seqüenciadas e analisadas filogeneticamente. As seqüências de PKSs da Microcystis aeruginosa NPCD1 e Fischerella CENA62 mostraram correlação com a síntese de sideróforo e de microcistina, respectivamente. Todas as 59 linhagens foram analisadas para a produção do microcistinas e 20 linhagens apresentaram resultados positivos. Para a maioria das linhagens potencialmente produtoras de microcistinas os produtos de PCR esperados de NRPS, PKS e NRPS/PKS foram amplificados. A produção de sideróforos foi testada em 28 linhagens e somente cinco produziram resultados positivos. Em três linhagens produtoras de sideróforos todos os três sistemas moleculares analisados estavam presentes. Estes resultados serão altamente valiosos na exploração futura de cada peptídeo dessas cianobactérias e para a elucidação da bioatividade de tais produtos naturais. / The intergenic spacer (IGS) together with its flanking subunits  (cpcB) and  (cpcA) of the phycocyanin operon has been used to identify cyanobacterial strains. Within the Bacteria domain only cyanobacteria present phycocyanin operon and the cpcBA-IGS region is variable enough to differentiate strains of these microorganisms. In the present study 25 cyanobacterial strains isolated from several Brazilian locations were characterized using the cpcBA-IGS sequence. Genomic DNA was extracted from the orders Chroococcales (eight strains), Oscillatoriales (two strains), Nostocales (eleven strains) and Stigonematales (four strains). The primers PCβF/PCαR targeting the cpcBA-IGS sequence were used to amplify DNA fragments of approximately 685 bp. The PCR products were cloned, sequenced and the sequences were compared by BLAST analysis. All Microcystis sequences and also sequences from Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 and Gloeotrichia UFV-B2 showed identities with sequences from GenBank. However, no identities were found for the remaining sequences. Phylogenetic relationships of the cpcBA-IGS sequences were investigated together with other cyanobacterial sequences from Genbank using the Neighbour Joining analysis. The tree topology was congruent with previous cyanobacterial trees, except for all sequences with no identities in the GenBank, which formed a separated cluster. The cpcBA-IGS sequences analysis data confirm that heterocyte-forming cyanobacteria are a monophyletic group. Previous studies carried out with cyanobacterial strains showed that these microorganisms are a rich source of natural products. This has been confirmed in the present study conducted with 59 cyanobacterial strains, with the majority of them isolated from Brazilian environment. To reach this goal, two sets of degenerate primers were used to generate PCR amplification sequences of nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and modular polyketide synthases (PKSs), which are multifunctional enzymes implicated in natural products production. Also, NRPS/PKS hybrid system was PCR amplified by using a combination of NRPS and PKS primers. This molecular approach revealed the presence of NRPS and PKS genes in 93% and 81% cyanobacterial strains, respectively. NRPS/PKS genes were found in 87% of cyanobacteria examined. In an attempt to attribute functions to eight PCR identified PKS fragments, these sequences were cloned, sequenced and phylogenetically analyzed. PKSs sequences of Microcystis aeruginosa NPCD1 and Fischerella CENA62 showed correlation with the synthesis of siderophore and microcystin, respectively. All 59 strains were analyzed for microcystin production and 20 strains presented positive results. For the majority of potentially producing-microcystin strains expected PCR products of NRPS, PKS and NRPS/PKS were amplified. The siderophores production was tested in 28 strains and only five gave positive results. In three producing-siderophore strains all three molecular systems analyzed were present. These results will be highly valuable for further exploring each of these cyanobacterial peptides and for elucidating the bioactivity of such natural products.

Florações de cianobactérias tóxicas em corpos dágua doce usados como fonte para o consumo humano, recreação e irrigação são freqüentes nos dias de hoje devido à eutrofização destes ambientes. O monitoramento de linhagens tóxicas é importante para a prevenção dos efeitos adversos causados por suas toxinas na saúde de humanos e animais. Métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce das cianobactérias tóxicas em estações de tratamento de água e em programas de monitoramento de mananciais são de fundamental interesse para a prevenção desses efeitos. Atualmente, contagem de células, identificação de cianobactérias por microscopia óptica e análises químicas ou imunológicas das toxinas são usadas nos monitoramentos. Em anos recentes, métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da presença de cianobactérias tóxicas em diversos ambientes. Este estudo teve por objetivo implementar uma metodologia capaz de acessar e quantificar as cianobactérias do gênero Microcystis na Praia dos Namorados, no reservatório de Salto Grande, Americana, SP, local cujo uso recreacional é bastante intenso e florações de cianobactérias são freqüentemente observadas. Simultaneamente, buscou-se detectar o potencial de produção de microcistinas desses organismos. A técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR) foi empregada com essa finalidade e dois conjuntos de oligonucleotídeos LUX foram desenvolvidos tendo como alvo dois genes distintos. Seqüências de cpcBA-IGS do operon da ficocianina (PC) foram obtidas para sete linhagens de cianobactérias brasileiras, as quais foram alinhadas com outras seqüências existentes em banco de dados público, e permitiram o desenho dos iniciadores de qPCR QPCF/QPCR, capazes de amplificar fragmentos de 144 pb. Da mesma forma, outras 11 sequências inéditas foram obtidas para uma região do domínio da N-methyltransferase do gene da sintetase de microcistinas (mcyA) e permitiram o desenvolvimento dos iniciadores QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR, capazes de amplificar fragmentos de 154 pb. Ambos os conjuntos foram marcados uma única vez com os fluoróforos FAM (QPCF/QPCR) ou JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR). Curvas de calibração para ambos os genes foram estabelecidas com regressão linear simples usando os valores de Ct (número de ciclos da qPCR em que a fluorescência atinge um limiar fixo pré-determinado) e concentrações conhecidas de DNA gênomico (em número de células equivalente) da Microcystis sp. NPLJ-4 (produtora de microcistina). As diluições utilizadas para o estabelecimento dessas curvas variaram de 1:10 a 1:10-5 e as concentrações de DNA foram correlacionadas com o respectivo número de células na amostra, obtido pela técnica de Utermöhl em laboratório certificado, como metodologia independente. Para PC e mcyA, as equações de regressão foram y = 43,977 - 1,8097Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05) e y = 42,932 - 1,8449Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05), respectivamente, sendo y = Ct com limiar de fluorescência fixo avaliado em 0,03 e x = quantidade de DNA na amostra em concentrações conhecidas (dada como log do número de células equivalente). Para ambos os genes analisados, o limite de detecção foi de 100 células por reação. Eficiências de 79 e 76% foram alcançadas nas amplificações para PC e mcyA, respectivamente. Posteriormente, essa metodologia foi aplicada a duas outras linhagens isoladas de Microcystis e em amostras ambientais de água, que foram coletadas sempre no mesmo ponto (Praia dos Namorados), em quatro períodos distintos (dez 06, abr 07, set 07 e nov 07). Genótipos PC (em número de células mL-1) foram quantificados pela técnica de qPCR em todas as amostras analisadas. Porém, genótipos mcy puderam ser determinados apenas em M. aeruginosa NPJB1 (0,5%) e na amostra referente à primeira coleta (2,7%). Os resultados de número de células em todas as análises feitas usando a técnica de Utermöhl foram superiores aos obtidos pela qPCR. A comparação entre as médias dos valores de quantificações gerados por Utermöhl e qPCR (PC) mostrou diferença significativa (Teste t de Student, p <0,05). Nas amostras ambientais, com exceção da primeira coleta, a presença de outros gêneros de cianobactérias cocóides, como Radiocystis e Sphaerocavum, foi observada, e suas distinções não foram possíveis nas observações microscópicas após a disrupção das colônias. Estudos adicionais realizados com a região cpcBA-IGS desses outros gêneros mostraram 96% de identidade com Microcystis, e seqüências IGS bastante similares. Assim, existe a possibilidade de que os iniciadores desenhados neste estudo estejam também amplificando esses dois gêneros de cianobactérias. Em adição, a contagem em microscópio pode ter superestimado os resultados, enquanto que a técnica de qPCR mostrou baixa eficiência de amplificação. O ensaio imunológico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) identificou a produção de microcistinas dos tipos LR, RR ou YR em todas as amostras com concentrações maiores que 0,1 g L-1, com exceção da M. aeruginosa NPCD1 (não produtora de microcistinas). Os resultados obtidos neste estudo indicam que o número de células de Microcystis, estimado pela técnica de qPCR pode ser usado para o monitoramento ambiental na Praia dos Namorados, em atendimento à Portaria MS 518. Além disso, demonstram que é possível inferir a proporção de genótipos mcyA a partir da determinação de genótipos PC. Contudo, a validação dessa técnica requer maiores estudos, incluindo a utilização de mais gêneros de cianobactérias e análises de outros reservatórios brasileiros, para melhor avaliar sua confiabilidade para uso no monitoramento ambiental. Para fins de monitoramento em larga escala, a técnica de qPCR mostrou-se mais viável economicamente em relação à contagem de células por microscopia, devido a sua maior capacidade de processamento (18 amostras dia-1) / Toxic cyanobacterial blooms in freshwater bodies used as a source for human consumption, recreation and irrigation are frequent nowadays due to the eutrofication of these environments. The monitoring of toxic strains is important for the prevention of the side effects caused by their toxins in human and animal health. Rapid and sensitive methods for early detection of toxic cyanobacteria in water treatment stations and aquatic monitoring programs are essential for the prevention of these effects. Currently, cells counting, cyanobacterial identification using optical microscopy and chemical or immunological analyses of the toxins are applied for monitoring purposes. In recent years, molecular approaches are being developed and proposed for rapid and sensitive diagnosis of the presence of toxic cyanobacteria in several environments.This study aimed to implement a methodology capable of access and quantify Microcystis cyanobacterial genus at the Praia dos Namorados, in the Salto Grande reservoir, Americana, SP, where recreation is very intense and cyanobacterial blooms are frequently observed. Simultaneously, it was searched to detect the potential for microcystins production by these organisms. The Real Time Quantitative PCR (qPCR) technique was employed for these purpose and two sets of LUX primers were developed to target two distinct genes. Sequences of cpcBA-IGS of the phycocyanin operon (PC) were obtained for seven Brazilian cyanobacterial strains, which were aligned with other existing public database sequences, and allowed to design the qPCR QPCF/QPCR primers, able to amplify fragments of 144 bp. In the same way, 11 novel sequences were obtained from a region of the N-methyltransferase domain of the microcystin sinthetase gene (mcyA) and allowed the development of QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR primers, able to amplify fragments of 154 bp. Both primer sets were labeled only once with FAM (QPCF/QPCR) or JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR) fluorophors. Standard curves for both genes were established with simple linear regression using the Ct values (the PCR cycle numbers at which the fluorescence reaches a predetermined threshold level) and known Microcystis sp. NPLJ-4 (microcystin producer) genomic DNA concentrations (in cell number equivalents). The dilutions used for the establishment of these curves ranged from 1:10 to 1:10-5 and the DNA concentrations were correlated with the respective cell numbers of the sample, obtained by Utermöhl technique in a certified laboratory, as an independent methodology. For PC and mcyA, the regression equations were y = 43.977 - 1.8097Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05) and y= 42.932 - 1.8449Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05), respectively, where y is the Ct at the set fluorescence threshold level (0.03) and x is the amount of known DNA concentrations in the sample (given as log cell number equivalents). For both analyzed genes, the detection limit was 100 cells per reaction. Efficiencies of 79 and 76% were achieved for PC and mcyA amplifications, respectively. Subsequently, this methodology was applied to two other isolated Microcystis strains and to environmental water samples, which were collected always in the same location (Praia dos Namorados), in four different periods (Dez 06, Apr 07, Set 07 and Nov 07). PC genotypes (in cell numbers mL-1) were quantified by the qPCR technique in all analyzed samples. However, mcy genotypes could be determined only in M. aeruginosa NPJB1 (0.5%) and in the first collected sample (2.7%). The results of cell numbers in all the analyses performed using Utermöhl technique were superior then those obtained by qPCR. The comparison between the average quantification values generated by Utermöhl and qPCR (PC) showed significant difference (Test t of Student, p<0,05). In the environmental samples, except for the first one collected, the presence of other cocoid cyanobacterial genera, such as Radiocystis and Sphaerocavum, was observed, and their distinctions were not possible by microscope observation after colonies disruption. Further studies carried out with the cpcBA-IGS region of these other genera showed 96% of identity with Microcystis, and very similar IGS sequences. Then, there is a possibility that the primers designed in this study are also amplifying these two cyanobacterial genera. In addition, microscopic cells counting may have overestimated the results, whereas qPCR technique showed low efficiency of amplification. The ELISA immunological assay (\"Enzyme-Linked Immunosorbent Assay\") identified the LR, RR or YR microcystins types in all samples analysed with concentrations higher than 0.1 mg L-1, with exception of M. aeruginosa NPCD1 (no microcystin producer). The results obtained in this study suggest that Microcystis cell numbers estimated by qPCR technique can be used for the environmental monitoring of the Praia dos Namorados, in attendance to the MS 518 regulation. Furthermore, they demonstrate that it is possible to infer the mcyA genotypes proportion from the PC genotypes determination. However, further studies are required for the validation of this technique, including the use of more cyanobacterial genera and other Brazilian reservoirs analyses, to better evaluate the reliability for its use in the environmental monitoring. For large scale monitoring, the qPCR technique is more economically viable when compared to the microscopic cells counting, due to its large processing capacity (18 samples day-1)

O espaço intergênico (IGS) juntamente com suas subunidades flanqueadoras (cpcB) e (cpcA) do operon do ficocianina foi usado para identificar linhagens de cianobactérias. Dentro do domínio Bacteria somente as cianobactérias possuem o operon da ficocianina e a região cpcBA-IGS é suficientemente variável para diferenciar linhagens desses microrganismos. No presente estudo 25 linhagens de cianobactérias isoladas de diversos locais brasileiros foram caracterizadas usando a seqüência cpcBA-IGS. DNA genômico foi extraído das ordens Chroococcales (oito linhagens), Oscillatoriales (duas linhagens), Nostocales (onze linhagens) e Stigonematales (quatro linhagens). Os oligonucleotídeos iniciadores PC&#946;F/PC&#945;R, específicos para a seqüência cpcBA-IGS, foram usados para amplificar fragmentos de DNA de aproximadamente 685 pb. Os produtos da PCR foram clonados, seqüenciados e as seqüências foram comparadas pela análise BLAST. Todas as seqüências de Microcystis e também as seqüências de Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 e Gloeotrichia UFV-B2 mostraram identidades com seqüências do GenBank. Entretanto, nenhuma identidade foi encontrada para as seqüências restantes. As relações filogenéticas das seqüências de cpcBA-IGS foram investigadas junto com outras seqüências de cianobactéria do Genbank usando a análise “Neighbour Joining”. A topologia da árvore foi congruente com outras árvores de cianobactérias, com exceção de todas as seqüências sem identidades no GenBank, as quais formaram um agrupamento separado. Os dados das seqüências de cpcBA-IGS analisadas confirmam que as cianobactéria heterocitadas formam um grupo monofilético. Estudos anteriores realizados com linhagens de cianobactéria mostraram que estes microrganismos são uma fonte rica de produtos naturais. No presente estudo conduzido com 59 linhagens de cianobactérias, sendo a maioria isolada de ambientes brasileiros, isto foi confirmado. Para alcançar esse objetivo, dois conjuntos de iniciadores degenerados foram usados para produzir seqüências amplificadas por PCR das sintetases de peptídeos não-ribossômicos (NRPSs), e de sintases policetídeos (PKSs) modulares, as quais são enzimas multifuncionais envolvidas na produção de produtos naturais. O sistema híbrido NRPS/PKS também foi amplificado por PCR usando uma combinação de iniciadores de NRPS e de PKS. Essa abordagem molecular mostrou a presença de genes de NRPS e de PKS em 93% e 81% linhagens de cianobactérias, respectivamente. Genes de NRPS/PKS foram encontrados em 87% das cianobactérias examinadas. Numa tentativa de atribuir funções a oito fragmentos de PKS identificados por PCR, estas seqüências foram clonadas, seqüenciadas e analisadas filogeneticamente. As seqüências de PKSs da Microcystis aeruginosa NPCD1 e Fischerella CENA62 mostraram correlação com a síntese de sideróforo e de microcistina, respectivamente. Todas as 59 linhagens foram analisadas para a produção do microcistinas e 20 linhagens apresentaram resultados positivos. Para a maioria das linhagens potencialmente produtoras de microcistinas os produtos de PCR esperados de NRPS, PKS e NRPS/PKS foram amplificados. A produção de sideróforos foi testada em 28 linhagens e somente cinco produziram resultados positivos. Em três linhagens produtoras de sideróforos todos os três sistemas moleculares analisados estavam presentes. Estes resultados serão altamente valiosos na exploração futura de cada peptídeo dessas cianobactérias e para a elucidação da bioatividade de tais produtos naturais. / The intergenic spacer (IGS) together with its flanking subunits &#61538; (cpcB) and &#61537; (cpcA) of the phycocyanin operon has been used to identify cyanobacterial strains. Within the Bacteria domain only cyanobacteria present phycocyanin operon and the cpcBA-IGS region is variable enough to differentiate strains of these microorganisms. In the present study 25 cyanobacterial strains isolated from several Brazilian locations were characterized using the cpcBA-IGS sequence. Genomic DNA was extracted from the orders Chroococcales (eight strains), Oscillatoriales (two strains), Nostocales (eleven strains) and Stigonematales (four strains). The primers PC&#946;F/PC&#945;R targeting the cpcBA-IGS sequence were used to amplify DNA fragments of approximately 685 bp. The PCR products were cloned, sequenced and the sequences were compared by BLAST analysis. All Microcystis sequences and also sequences from Radiocystis fernadoi SPC736, Planktothrix mougeotii SPC788, Geitlerinema splendidum SPC923, Microchaete investiens CENA64 and Gloeotrichia UFV-B2 showed identities with sequences from GenBank. However, no identities were found for the remaining sequences. Phylogenetic relationships of the cpcBA-IGS sequences were investigated together with other cyanobacterial sequences from Genbank using the Neighbour Joining analysis. The tree topology was congruent with previous cyanobacterial trees, except for all sequences with no identities in the GenBank, which formed a separated cluster. The cpcBA-IGS sequences analysis data confirm that heterocyte-forming cyanobacteria are a monophyletic group. Previous studies carried out with cyanobacterial strains showed that these microorganisms are a rich source of natural products. This has been confirmed in the present study conducted with 59 cyanobacterial strains, with the majority of them isolated from Brazilian environment. To reach this goal, two sets of degenerate primers were used to generate PCR amplification sequences of nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and modular polyketide synthases (PKSs), which are multifunctional enzymes implicated in natural products production. Also, NRPS/PKS hybrid system was PCR amplified by using a combination of NRPS and PKS primers. This molecular approach revealed the presence of NRPS and PKS genes in 93% and 81% cyanobacterial strains, respectively. NRPS/PKS genes were found in 87% of cyanobacteria examined. In an attempt to attribute functions to eight PCR identified PKS fragments, these sequences were cloned, sequenced and phylogenetically analyzed. PKSs sequences of Microcystis aeruginosa NPCD1 and Fischerella CENA62 showed correlation with the synthesis of siderophore and microcystin, respectively. All 59 strains were analyzed for microcystin production and 20 strains presented positive results. For the majority of potentially producing-microcystin strains expected PCR products of NRPS, PKS and NRPS/PKS were amplified. The siderophores production was tested in 28 strains and only five gave positive results. In three producing-siderophore strains all three molecular systems analyzed were present. These results will be highly valuable for further exploring each of these cyanobacterial peptides and for elucidating the bioactivity of such natural products.

Florações de cianobactérias tóxicas em corpos dágua doce usados como fonte para o consumo humano, recreação e irrigação são freqüentes nos dias de hoje devido à eutrofização destes ambientes. O monitoramento de linhagens tóxicas é importante para a prevenção dos efeitos adversos causados por suas toxinas na saúde de humanos e animais. Métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce das cianobactérias tóxicas em estações de tratamento de água e em programas de monitoramento de mananciais são de fundamental interesse para a prevenção desses efeitos. Atualmente, contagem de células, identificação de cianobactérias por microscopia óptica e análises químicas ou imunológicas das toxinas são usadas nos monitoramentos. Em anos recentes, métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da presença de cianobactérias tóxicas em diversos ambientes. Este estudo teve por objetivo implementar uma metodologia capaz de acessar e quantificar as cianobactérias do gênero Microcystis na Praia dos Namorados, no reservatório de Salto Grande, Americana, SP, local cujo uso recreacional é bastante intenso e florações de cianobactérias são freqüentemente observadas. Simultaneamente, buscou-se detectar o potencial de produção de microcistinas desses organismos. A técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR) foi empregada com essa finalidade e dois conjuntos de oligonucleotídeos LUX foram desenvolvidos tendo como alvo dois genes distintos. Seqüências de cpcBA-IGS do operon da ficocianina (PC) foram obtidas para sete linhagens de cianobactérias brasileiras, as quais foram alinhadas com outras seqüências existentes em banco de dados público, e permitiram o desenho dos iniciadores de qPCR QPCF/QPCR, capazes de amplificar fragmentos de 144 pb. Da mesma forma, outras 11 sequências inéditas foram obtidas para uma região do domínio da N-methyltransferase do gene da sintetase de microcistinas (mcyA) e permitiram o desenvolvimento dos iniciadores QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR, capazes de amplificar fragmentos de 154 pb. Ambos os conjuntos foram marcados uma única vez com os fluoróforos FAM (QPCF/QPCR) ou JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR). Curvas de calibração para ambos os genes foram estabelecidas com regressão linear simples usando os valores de Ct (número de ciclos da qPCR em que a fluorescência atinge um limiar fixo pré-determinado) e concentrações conhecidas de DNA gênomico (em número de células equivalente) da Microcystis sp. NPLJ-4 (produtora de microcistina). As diluições utilizadas para o estabelecimento dessas curvas variaram de 1:10 a 1:10-5 e as concentrações de DNA foram correlacionadas com o respectivo número de células na amostra, obtido pela técnica de Utermöhl em laboratório certificado, como metodologia independente. Para PC e mcyA, as equações de regressão foram y = 43,977 - 1,8097Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05) e y = 42,932 - 1,8449Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05), respectivamente, sendo y = Ct com limiar de fluorescência fixo avaliado em 0,03 e x = quantidade de DNA na amostra em concentrações conhecidas (dada como log do número de células equivalente). Para ambos os genes analisados, o limite de detecção foi de 100 células por reação. Eficiências de 79 e 76% foram alcançadas nas amplificações para PC e mcyA, respectivamente. Posteriormente, essa metodologia foi aplicada a duas outras linhagens isoladas de Microcystis e em amostras ambientais de água, que foram coletadas sempre no mesmo ponto (Praia dos Namorados), em quatro períodos distintos (dez 06, abr 07, set 07 e nov 07). Genótipos PC (em número de células mL-1) foram quantificados pela técnica de qPCR em todas as amostras analisadas. Porém, genótipos mcy puderam ser determinados apenas em M. aeruginosa NPJB1 (0,5%) e na amostra referente à primeira coleta (2,7%). Os resultados de número de células em todas as análises feitas usando a técnica de Utermöhl foram superiores aos obtidos pela qPCR. A comparação entre as médias dos valores de quantificações gerados por Utermöhl e qPCR (PC) mostrou diferença significativa (Teste t de Student, p <0,05). Nas amostras ambientais, com exceção da primeira coleta, a presença de outros gêneros de cianobactérias cocóides, como Radiocystis e Sphaerocavum, foi observada, e suas distinções não foram possíveis nas observações microscópicas após a disrupção das colônias. Estudos adicionais realizados com a região cpcBA-IGS desses outros gêneros mostraram 96% de identidade com Microcystis, e seqüências IGS bastante similares. Assim, existe a possibilidade de que os iniciadores desenhados neste estudo estejam também amplificando esses dois gêneros de cianobactérias. Em adição, a contagem em microscópio pode ter superestimado os resultados, enquanto que a técnica de qPCR mostrou baixa eficiência de amplificação. O ensaio imunológico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) identificou a produção de microcistinas dos tipos LR, RR ou YR em todas as amostras com concentrações maiores que 0,1 g L-1, com exceção da M. aeruginosa NPCD1 (não produtora de microcistinas). Os resultados obtidos neste estudo indicam que o número de células de Microcystis, estimado pela técnica de qPCR pode ser usado para o monitoramento ambiental na Praia dos Namorados, em atendimento à Portaria MS 518. Além disso, demonstram que é possível inferir a proporção de genótipos mcyA a partir da determinação de genótipos PC. Contudo, a validação dessa técnica requer maiores estudos, incluindo a utilização de mais gêneros de cianobactérias e análises de outros reservatórios brasileiros, para melhor avaliar sua confiabilidade para uso no monitoramento ambiental. Para fins de monitoramento em larga escala, a técnica de qPCR mostrou-se mais viável economicamente em relação à contagem de células por microscopia, devido a sua maior capacidade de processamento (18 amostras dia-1) / Toxic cyanobacterial blooms in freshwater bodies used as a source for human consumption, recreation and irrigation are frequent nowadays due to the eutrofication of these environments. The monitoring of toxic strains is important for the prevention of the side effects caused by their toxins in human and animal health. Rapid and sensitive methods for early detection of toxic cyanobacteria in water treatment stations and aquatic monitoring programs are essential for the prevention of these effects. Currently, cells counting, cyanobacterial identification using optical microscopy and chemical or immunological analyses of the toxins are applied for monitoring purposes. In recent years, molecular approaches are being developed and proposed for rapid and sensitive diagnosis of the presence of toxic cyanobacteria in several environments.This study aimed to implement a methodology capable of access and quantify Microcystis cyanobacterial genus at the Praia dos Namorados, in the Salto Grande reservoir, Americana, SP, where recreation is very intense and cyanobacterial blooms are frequently observed. Simultaneously, it was searched to detect the potential for microcystins production by these organisms. The Real Time Quantitative PCR (qPCR) technique was employed for these purpose and two sets of LUX primers were developed to target two distinct genes. Sequences of cpcBA-IGS of the phycocyanin operon (PC) were obtained for seven Brazilian cyanobacterial strains, which were aligned with other existing public database sequences, and allowed to design the qPCR QPCF/QPCR primers, able to amplify fragments of 144 bp. In the same way, 11 novel sequences were obtained from a region of the N-methyltransferase domain of the microcystin sinthetase gene (mcyA) and allowed the development of QmcyANMTF/ QmcyA-NMTR primers, able to amplify fragments of 154 bp. Both primer sets were labeled only once with FAM (QPCF/QPCR) or JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR) fluorophors. Standard curves for both genes were established with simple linear regression using the Ct values (the PCR cycle numbers at which the fluorescence reaches a predetermined threshold level) and known Microcystis sp. NPLJ-4 (microcystin producer) genomic DNA concentrations (in cell number equivalents). The dilutions used for the establishment of these curves ranged from 1:10 to 1:10-5 and the DNA concentrations were correlated with the respective cell numbers of the sample, obtained by Utermöhl technique in a certified laboratory, as an independent methodology. For PC and mcyA, the regression equations were y = 43.977 - 1.8097Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05) and y= 42.932 - 1.8449Ln(x) (R2 = 0.99, p<0,05), respectively, where y is the Ct at the set fluorescence threshold level (0.03) and x is the amount of known DNA concentrations in the sample (given as log cell number equivalents). For both analyzed genes, the detection limit was 100 cells per reaction. Efficiencies of 79 and 76% were achieved for PC and mcyA amplifications, respectively. Subsequently, this methodology was applied to two other isolated Microcystis strains and to environmental water samples, which were collected always in the same location (Praia dos Namorados), in four different periods (Dez 06, Apr 07, Set 07 and Nov 07). PC genotypes (in cell numbers mL-1) were quantified by the qPCR technique in all analyzed samples. However, mcy genotypes could be determined only in M. aeruginosa NPJB1 (0.5%) and in the first collected sample (2.7%). The results of cell numbers in all the analyses performed using Utermöhl technique were superior then those obtained by qPCR. The comparison between the average quantification values generated by Utermöhl and qPCR (PC) showed significant difference (Test t of Student, p<0,05). In the environmental samples, except for the first one collected, the presence of other cocoid cyanobacterial genera, such as Radiocystis and Sphaerocavum, was observed, and their distinctions were not possible by microscope observation after colonies disruption. Further studies carried out with the cpcBA-IGS region of these other genera showed 96% of identity with Microcystis, and very similar IGS sequences. Then, there is a possibility that the primers designed in this study are also amplifying these two cyanobacterial genera. In addition, microscopic cells counting may have overestimated the results, whereas qPCR technique showed low efficiency of amplification. The ELISA immunological assay (\"Enzyme-Linked Immunosorbent Assay\") identified the LR, RR or YR microcystins types in all samples analysed with concentrations higher than 0.1 mg L-1, with exception of M. aeruginosa NPCD1 (no microcystin producer). The results obtained in this study suggest that Microcystis cell numbers estimated by qPCR technique can be used for the environmental monitoring of the Praia dos Namorados, in attendance to the MS 518 regulation. Furthermore, they demonstrate that it is possible to infer the mcyA genotypes proportion from the PC genotypes determination. However, further studies are required for the validation of this technique, including the use of more cyanobacterial genera and other Brazilian reservoirs analyses, to better evaluate the reliability for its use in the environmental monitoring. For large scale monitoring, the qPCR technique is more economically viable when compared to the microscopic cells counting, due to its large processing capacity (18 samples day-1)