Es ADCs (Antibody-Drug Conjugates) correspondent à une nouvelle stratégie thérapeutique anti-tumorale particulièrement prometteuse. Néanmoins, les ADCs actuellement utilisés en clinique sont obtenus par conjugaisons chimiques, resultant en des mixtures hétérogènes impactant négativement leurs pharmacocinétiques et leurs performances in vivo.Récemment, différentes strategies de couplage site-spécifique ont été développées afin de réduire cette hétérogénéité. Dans cette thèse, nous rapportons le développement d’une nouvelle technologie CovIsoLink™ (Covalently Isopeptide Crosslinking) permettant la génération d’ADCs par utilisation de nouveaux peptides glutamine Q-Tag présentant des affinités optimisées par rapport à des peptides disponibles (ZQG, LLQG) pour une enzyme bactérienne la transglutaminase (mTG).La preuve de concept de cette technologie a été réalisée par insertion de ces peptides Q-Tag en C-ter de la région codant pour la chaine lourde des anticorps anti-HER2 (Trastuzumab). Nous avons ainsi pu démontrer la conjugaison homogène et reproductible de différentes drogues sans contamination par des chaines d’anticorps non conjuguées. Nous avons pu montrer que l’immunoréactivité et la capacité d’internalisation de ces ADCs n’étaient pas altérées par la conjugaison et qu’ils présentaient in vitro et in vivo, des propriétés de lyse de cellules tumorales similaires au Trastuzumab emtansine (Kadcyla®), actuellement en clinique. Par ailleurs, afin de généraliser notre technologie à différents formats d’anticorps nous avons générés des fragments Fab et scFv et évalué leur fonctionnalité. Ainsi, nous avons pu prouver que l’utilisation de nouveaux peptides optimisés Q-Tag substrat de la transglutaminase permettait une stratégie de couplage alternative plus homogène par couplage de différentes molécules sans espèce contaminante non couplée / Antibody-drug conjugates (ADCs) are a powerful class of therapeutic agents, demonstrating success in the treatment of several malignancies. The currently approved ADCs are produced by chemical conjugations and exist as heterogeneous mixtures that negatively influence the pharmacokinetics and in vivo performance. Recently many of site-specific conjugation technologies have been developed to reduce heterogeneity and batch-to batch variability. Microbial transglutaminase (mTG) has been demonstrated as efficient tool for site-specific conjugation. In this thesis we report the development CovIsoLink™ (Covalently Isopeptide Crosslinking) technology for the generation of homogenous immunoconjugates using a novel glutamine donor peptides (Q-tag) with improved affinity compared to the known peptides (ZQG, LLQG). As a proof of concept, the peptides sequences were engineered into the heavy chain C-terminal of Trastuzumab antibody. We demonstrated the reproducible and homogeneous conjugation of Q-tagged Trastuzumab with different payloads, without any unconjugated species. The ADCs were evaluated in series of in vitro and in vivo assays. We confirmed that the immunoreactivity and internalisation are not altered by the conjugation. Furthermore similar in vitro and in vivo tumor cell killing potency was demonstrated than Trastuzumab emtansine (Kadcyla®), which is already used in the clinic. Morover we extend our site-specific conjugation technology to antibody fragments (Fab and scFv), evaluating their functionality by conjugation with AlexaFluor488-cadaverine and in antigen binding assays. Thus, using novel glutamine donor peptides, our technology provides an alternative enzymatic conjugation strategy for the engrafment of different payloads resulting in homogeneous batches, without unconjugated species

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(工学) / 乙第13145号 / 論工博第4163号 / 新制||工||1687(附属図書館) / (主査)教授 森 泰生, 教授 浜地 格, 教授 梅田 眞郷 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DFAM

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La majorité des ADC qui sont actuellement en clinique et en développement sont produits par une conjugaison chimique via les résidus lysine ou cystéine, menant à un produit hétérogène pour leur ratio toxine sur anticorps (DAR). L'objet des travaux de thèse a pour but de décrire la caractérisation in vitro et in vivo de nouveaux ADC optimisés et construits à partir de l'anticorps anti-CD30 cAC10, ayant le même squelette polypetidique que Adcetris, et de comparer les résultats à ce dernier. La transglutaminase bactérienne (BTG) a été utilisée pour conjuguer de manière site-spécifique la MMAE aux glutamines aux positions 295 et 297 du cAC10, amenant à des ADCs homogènes de DAR 4, TG-ADC. Des travaux préliminaires ont permis d’établir les conditions optimales de conjugaison avec un procédé en deux étapes. Les tests de cytotoxicité ont révélé des EC50 comparables entre Adcetris et les TG-ADC. Les données d’efficacité in vivo montrent une efficacité équivalente voire légèrement supérieure pour les TG-ADC que Adcetris. L'étude de biodistribution in vivo dans un modèle avec et sans tumeur est réalisé avec un 125-I TG-ADC et est comparé à 125I-Adcetris. Le TG ADC site spécifique montre une meilleure distribution tumorale. Adcetris a une distribution non médiée par la cible, dans le foie et la rate, plus importante. En ligne avec ces résultats, la dose maximale tolérée des TG ADC est significativement plus élevée que Adcetris chez le rat. Ces résultats suggèrent que les ADC homogènes ont une meilleure pharmacocinétique et un meilleur index thérapeutique comparés aux ADC avec des DAR hétérogènes. / Most ADC that are currently in clinical use or development produced by chemical conjugation of a toxin via either lysine or cysteine residues, inevitably leading to heterogeneous products with variable drug-to-antibody ratios (DARs). Here, we describe the in vitro and in vivo characterization of novel ADCs that are based on the anti-CD30 antibody cAC10, which has the same polypeptide backbone as Adcetris, and compare the results with the latter. Bacterial transglutaminase (BTG) was exploited to site-specifically conjugate derivatives of MMAE to the glutamines at position 295 and 297 of cAC10, yielding homogeneous ADCs with a DAR of 4, TG-ADC. Preliminary works have led to define optimal conditions for conjugation, but also define a two step process. In vitro cell toxicity experiments revealed comparable EC50-values for Adcetris and TG-ADC. The efficacy data have shown slightly better efficacy for TG-ADC compared to Adcetris. Quantitative time-dependent in vivo biodistribution studies in normal and xenografted mice were performed with a selected 125I TG ADC and compared with 125I-Adcetris. Adcetris has an higher liver and spleen unspecific uptakes. In line with these results, the maximum tolerated dose of the BTG-coupled ADC (> 60 mg/kg) was significantly higher than that of ADCETRIS® (18 mg/kg) in rats. These results suggest that homogenous ADCs display improved pharmacokinetics and better therapeutic indexes compared to chemically modified ADCs with variable DARs.

Les conjugués anticorps-médicament (ADC) représentent une avancée révolutionnaire dans la thérapeutique du cancer en délivrant de manière sélective des médicaments cytotoxiques aux cellules tumorales, minimisant ainsi la toxicité systémique. Les ADC se composent de trois composants principaux : un anticorps monoclonal (mAb) ciblant un antigène spécifique associé à la tumeur, un médicament cytotoxique et un lien qui conjugue le médicament à l’anticorps. Malgré leur potentiel thérapeutique, la fabrication des ADC est confrontée à d’importants défis, nécessitant l’optimisation de plusieurs paramètres, en particulier pour obtenir une technologie de conjugaison optimale et un ratio médicament-anticorps (DAR) optimal. Les méthodes de conjugaison traditionnelles basées sur la chimie donnent souvent lieu à des mélanges hétérogènes avec des DAR variables, ce qui peut affecter négativement l’efficacité thérapeutique et la sécurité du produit final. Pour résoudre ce problème, la conjugaison spécifique au site a émergé comme une méthode plus précise, garantissant que les médicaments cytotoxiques sont attachés à des sites spécifiques sur la molécule d’anticorps. Cette technique vise à produire des ADC homogènes avec des DAR constants, améliorant ainsi leur pharmacocinétique et leur pharmacodynamie. Cependant, les conjugaisons spécifiques au site ne sont pas exemptes de limitations. L’un des principaux défis réside dans la complexité de l’ingénierie des modifications nécessaires. L’introduction de sites de conjugaison spécifiques nécessite un génie génétique précis, ce qui peut être techniquement difficile et chronophage. De plus, les processus de fabrication des ADC spécifiques au site sont plus complexes et nécessitent des techniques sophistiquées et des mesures étendues de contrôle qualité. Ces facteurs peuvent donc affecter la production d’ADC basée sur la conjugaison spécifique au site. Le travail présenté dans cette thèse de doctorat propose l’utilisation d’une paire de peptides hétérologues à haute affinité, à savoir les coiled-coils E/K, pour produire des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. Pour commencer, nous avons conçu, produit et purifié une bibliothèque d’anticorps monoclonaux (trastuzumab) marqués avec divers peptides Ecoil et évalué leur manufacturabilité via une transfection transitoire dans des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et avons étudié les caractéristiques des anticorps marqués produits. Nos données montrent que l’ajout de peptides Ecoil aux extrémités C-terminales des chaînes d’anticorps (chaînes légères, chaînes lourdes ou les deux) n’entrave pas la production de constructions chimériques de trastuzumab. De plus, les tests analytiques et cellulaires ont confirmé que les constructions de trastuzumab marquées avec Ecoil ont maintenu leur bioactivité. La position, le nombre et la longueur des peptides Ecoil n’ont eu aucune influence sur l’affinité de liaison et la stabilité des anticorps marqués à leur antigène. Dans le cadre d’une étude supplémentaire et d’une étape supplémentaire pour démontrer la polyvalence des peptides E/K, nous avons également évalué la capture et la libération du trastuzumab marqué avec Ecoil produit à partir d’hydrogels de dextrane macroporeux fonctionnalisés avec le peptide Kcoil (le partenaire de liaison du peptide Ecoil). Ensemble, ces données ont révélé que les peptides Ecoil, quelle que soit leur longueur, leur nombre et leur position sur l’anticorps, n’avaient aucun effet significatif sur la manufacturabilité, la capacité de liaison ou le schéma de libération de l’hydrogel. Sur la base de cette fondation, nous avons exploré l’utilisation de deux peptides d’affinité complémentaires, E-coil (EVSALEK) et K-coil (KVSALKE), pour développer des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. En utilisant une méthode d’analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) sur mesure et une chromatographie d’exclusion stérique, nous avons mesuré la dissociation cinétique et la stabilité des complexes formés par le trastuzumab marqué avec Ecoil et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP) marquée avec Kcoil en tant que substitut de médicament. La stabilité in vitro a également été évaluée dans le sérum sanguin à l’aide d’un test ELISA en interne avant les études in vivo. Ensuite, pour évaluer les performances in vivo, nous avons mené des études de biodistribution et de localisation tumorale dans des modèles de souris xénogreffées HER2. Ces expériences ont démontré la stabilité de nos ADC dans la circulation sanguine et leur accumulation efficace sur le site de la tumeur. En général, ce projet vise à démontrer la faisabilité et la polyvalence du système d’affinité E/K pour la conjugaison spécifique au site de molécules thérapeutiques sur le squelette d’anticorps sans modifications chimiques complexes/préjudiciables. La fabrication simplifiée des ADC en utilisant cette méthode de “conjugaison en une seule étape” présentée ici ouvre la voie au développement de nouvelles méthodes dans la production d’ADC avec potentiellement une pharmacocinétique, une bioactivité et une stabilité améliorée. / Antibody-drug conjugate (ADC) represents a transformative breakthrough in cancer therapeutics by selectively delivering cytotoxic drugs to tumor cells, thereby minimizing systemic toxicity. ADC consists of three main components: a monoclonal antibody (mAb) targeting a specific tumor-associated antigen, a cytotoxic drug, and a linker that conjugates the drug to the antibody. Despite their therapeutic potential, the manufacturing of ADCs faces significant challenges, requires the optimization of several parameters particularly in achieving optimal conjugation technology and drug-to-antibody ratio (DAR). Traditional chemical-based conjugation methods often result in heterogeneous mixtures with variable DARs, which can adversely affect the therapeutic efficacy and safety of the final product. To address this issue, site-specific conjugation has emerged as a more precise method, ensuring that cytotoxic drugs are attached to specific sites on the antibody molecule. This technique aims to produce homogeneous ADCs with consistent DARs, thereby enhancing their pharmacokinetics and pharmacodynamics. However, site-specific conjugations are not exempt from limitations. One of the main challenges is the complexity involved in engineering the necessary modifications. Introducing specific conjugation sites requires precise genetic engineering, which can be technically challenging and time-consuming. Moreover, site-specific ADC manufacturing processes are more complex and require sophisticated techniques and extensive quality control measures. These factors can therefore affect ADC production based on site-specific conjugation. The work presented in this doctoral thesis proposed use of a high-affinity peptide pair, namely the E/K coiled-coils, to produce ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. To begin with, we designed, produced, and purified a library of monoclonal antibodies (trastuzumab) tagged with various Ecoil peptides and evaluated their manufacturability via transient transfection in Chinese hamster ovary (CHO) cells and investigated the characteristics of the produced tagged antibodies. Our data show that the addition of Ecoil tags at the C-termini of antibody chains (light chains, heavy chains, or both) does not hinder the production of chimeric trastuzumab constructs. Further, analytical and cell-based assays confirmed that the Ecoil-tagged trastuzumab constructs maintained their bioactivity. The position, number, and length of the Ecoil tags had no influence on the binding affinity and stability of tagged antibodies to HER2 antigen. As an additional study and an extra step towards demonstrating the versatility of the E/K affinity peptides, we also evaluated the capture and release of produced Ecoil-tagged trastuzumab from macroporous dextran hydrogels functionalized with Kcoil peptide (the Ecoil peptide binding partner). Together, these data revealed that the Ecoil tags, regardless of their length, number, and position on the antibody, had no significant effect on manufacturability, binding capacity, or release pattern from the hydrogel. Building on this foundation, we explored the use of two complementary affinity peptides, E-coil (EVSALEK) and K-coil (KVSALKE), to develop ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. Using a tailored surface plasmon resonance (SPR) assay and size exclusion chromatography(SEC), we measured the kinetics of dissociation and stability of the complexes formed by Ecoil-tagged trastuzumab and Kcoil-tagged monomeric red fluorescent protein (mRFP) as a drug surrogate. The in vitro stability was also assessed in blood serum using an in-house enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) prior to the in vivo studies. Next, to evaluate the in vivo performance, we conducted biodistribution and tumor localization studies in HER2 xenograft mouse models, specifically using SKOV-3 cells, which exhibit deregulated HER2 expression. These experiments demonstrated the stability of our ADCs in blood circulation and their effective accumulation at the tumor site. Overall, this project aims to demonstrate the feasibility and versatility of the E/K coiled coil affinity system for site-specific conjugation of the payload to the antibody backbone without complex/detrimental chemical modifications. The simplified manufacturing of ADCs using this “single-step conjugation” method shown here paves the way for developing new methods in production of ADCs with potentially enhanced pharmacokinetics, bioactivity, and stability.