Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-14T11:53:05Z No. of bitstreams: 1 danilo-parmera.pdf: 3155055 bytes, checksum: ac63cd2b7c2719955b83925c310aabbc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T11:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 danilo-parmera.pdf: 3155055 bytes, checksum: ac63cd2b7c2719955b83925c310aabbc (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As culturas de células vêm sendo utilizadas extensivamente no desenvolvimento e na produção de uma variedade de produtos terapêuticos e profiláticos, tornando-se uma ferramenta indispensável para geneticistas, imunologistas, vacinologistas e a indústria farmacêutica. A adoção de sistemas de ensaios celulares in vitrotem sido aplicada como um método alternativo para a substituição ou diminuição do uso de animais nas fases de desenvolvimento, produção e testes de vacinas, demonstrando resultados promissores. Da mesma forma, sistemas computacionais podem ampliar a utilização desta ferramenta para etapas do desenvolvimento de vacinas candidatas na fase pré-clínica. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de umprotocolo in vitroutilizando culturas de células humanas - a linhagem de monócitos THP-1, para a seleção de um protótipo vacinal - a cepa Pasteur de Mycobacterium bovisBCG expressando o antígeno Sm14 de Schistossoma mansoni(BCG/sm14). Para isso foram empregadas duas metodologias – citometria de fluxo e imunocitoquímica, para a identificação do perfil da expressão das citocinas IL-10, IL-12 e TNF-α. Foram utilizados como controles a cepa Pasteur do M. bovisBCG e a construção da cepa Pasteur do M. bovisBCG contendo o vetor de expressão pAU5 (BCG/pAU5).Após padronização, a multiplicidade de infecção utilizada para os experimentos foi de 10 bacilos para 1 célula THP-1 (10MOI). A expressão daproteína Sm14 foi detectada em todos os protótipos vacinais. Para assegurar queo protótipo BCG/sm14 era capaz de diferenciar a linhagem de monócitos THP-1 em macrófagos, avaliamos a taxa de crescimento celular e foi possível observarque após a infecção estas células apresentavam o índice de proliferação diminuído em 2 logs em relação à célula não infectada. O protótipo vacinal BCG/sm14não mostrou diferenças quanto a capacidade de infecção, a taxa de persistência intracelular e a estabilidade da construção plasmidial. As duas metodologias empregadas mostraram resultados discrepantes em relação ao percentual de citocinas expressas após a infecção com o protótipo vacinal ou os BCG controles, mostrando um maior percentual de células positivas quando avaliados por citometria de fluxo.Contudo, mesmo com esta diferença observamos que o protótipo vacinal BCG/sm14 não alterou o perfil de expressão de IL-10, IL-12 e TNF-α. O fato do plasmídeo pAU5 ser um vetor de expressão citoplasmática, sugere que a proteína Sm14 não foi capaz de estimular a mudança de citocinas em monócitos humanos. Experimentos futuros devem investigar o papel do BCG/sm14em macrófagos maduros, quanto a indução de citocinas pró e anti-inflamatórias, TLR, bem como na indução da resposta imune adaptativa, como a apresentação antigênica, na tentativa de melhor entender a resposta imune a esta vacina candidata. / Cell cultures has been used extensively in the development of a broad range of therapeutic and prophylactic products, and are an important tool for geneticists, immunologists, vaccinologists and the pharmaceuticsindustry. In vitrocell assay has been applied as an alternative method to replace ordiminish the use of animal model in the developmental, production in vaccine test phases, with promising results. Otherwise, computational methods should amplify theuse of cell cultures tools to test candidate vaccines. The mean goal of this work was to develop an in vitro protocol using human cell line – monocytic cell THP-1, to select a vaccine prototype – strain Pasteur Mycobacterium bovisBCG expressing Schistosoma mansoniSm14-antigen (BCG/sm14). Two methodologies were employed – a flow cytometry and immunocytochemistry, to quantify the expression of IL-10, IL-12 e TNF-α. Pasteur M. bovisBCG and the strain Pasteur do M. bovisBCG containing the expression vector pAU5 (BCG/pAU5) were used as controls. Multiplicityof infection (MOI) was determined and showed a better 10 bacilli to 1 cells ratios, regarding the expression of intracellular cytokines. Sm14 protein expressionwas detected in all vaccine prototype before use. To assure that BCG/sm14was able to differentiate monocytic THP1 cell line in mature macrophage, we evaluated the proliferative ration after BCGs infection and all strain showed the ability toinduce monocytic THP1 cells maturation, diminishing in 2.0 logs the cell proliferation. No differences were seen in the uptake, intracellular persistence and plasmidial stability. Interestingly, we observe discrepant results regarding the amount of positivecells expressing cytokines detected by the two methods used, independent of which BCG was tested. The overall results obtained by the cytometric method was high than immunocytochemistry. However, beside these ambiguous results, no alteration in the IL-10, IL-12 and TNF-alfa profile was observed whenBCG/sm14was compared with BCG. These results point to the plamidial BCG construction pAU5 and its intracellular expression, suggesting no modification in the cytokine profile in human monocytic cell lines. Further experiments should be addressedto identify the role of BCG/sm14 in modulate mature macrophage and, the induction ofadaptive immune response, as antigen presentation, pro- and anti-inflammatory cytokines, TLR expression and activation, to better understating the vaccine prototype immune response.