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As hidrolases de glicosídeos (GHs) exercem papéis fundamentais em vários processos biomédicos e aplicações industriais. A maioria destas enzimas possui vários domínios funcionais ligados entre si por peptídeos conhecidos como linkers. Informações sobre organização estrutural destas enzimas e sua mobilidade, posições e orientações mútuas de domínios individuais, bem como mudanças conformacionais introduzidas por ligantes ou por mudanças de condições bioquímicas (pH e T) podem ser muito informativas. Por esse motivo, é muito importante determinar a organização estrutural de GHs em termos de posição e orientação de seus domínios individuais e compreender a interação entre estes domínios em condições próximas às fisiológicas. Entretanto, atualmente, a conformação, dinâmica e função dos GHs com múltiplos domínios ainda não são totalmente compreendidas. Assim, o principal objetivo deste projeto foi conduzir estudos de hidrolases de glicosídeos em solução, usando SAS. Um grande número de GHs foi clonado e expresso em laboratório sob a direção do Prof. Dr. Igor Polikarpov (Grupo de Biotecnologia Molecular, IFSC / USP), seguindo protocolos já estabelecidos na literatura, para sua expressão e purificação. Experimentos SAXS foram realizados em colaboração com o Dr. Evandro Ares de Araújo (USP, São Carlos) e com o Prof. Dr. Mário de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Para estudar as hidrolases de glicosídeos, foi utilizado o método de espalhamento a baixo ângulo, e em adição ao trabalho experimental, foi desenvolvido um novo pacote de software SAXSMoW2 para processar os dados do SAXS. Este pacote permite obter rapidamente os principais parâmetros estruturais de moléculas de proteínas, calcular o peso molecular e o estado oligomérico. Também foi aperfeiçoado e aplicado o método de acoplamento estatístico (statistical coupling analysis) , para complementar os dados estruturais experimentais, em especial para xiloses isomerases. Este método pode permitir uma melhor compreensão da relação entre as características estruturais evolutivas e sua funcionalidade biológica. Além disso, métodos de bioinformática foram desenvolvidos para complementar e compreender melhor as informações estruturais obtidas nos experimentos de SAXS. O primeiro foi um método para separar sequências de GH7 em duas categorias, exo e endogluconases. É útil analisar cada tipo de proteína dentro da família separadamente e estudar o papel dos loops funcionais - características estruturais que influenciam significativamente a atividade biológica. Outro método foi desenvolvido para encontrar o centro de atividade na nova enzima Xilose Isomerase obtida, usando uma estrutura relacionada, bem conhecida, da mesma família. Este método foi aplicado a enzimas cujas estruturas foram estudadas pela técnica de cristalografia em nosso laboratório no IFSC / USP. Inspirado pelo SCA, um método de detecção de comunidades difusas de aminoácidos em proteínas foi desenvolvido. Essa informação também pode complementar os resultados do SCA, indicando conjuntos fortemente correlacionados de aminoácidos na enzima. Outro novo método desenvolvido é uma estimativa de afinidade nas famílias de enzimas ativas em carboidratos utilizando similaridade dos modelos escondidos de Markov e bancos de dados open access de sequências de proteínas. / The Glycoside Hydrolases (GHs) play a key role in a number of biomedical processes and industrial applications. Most of these enzymes are multidomain proteins composed of different functional domains connected by linker peptides. Thus, it is very important to determine structural organization of glycoside hydrolases in terms of positions and orientations of their individual domains and comprehend the interplay between their multiple domains under close-to physiological conditions. To study the glycoside hydrolases, in this work a small-angle scattering method has been used. Currently, the conformation, dynamics and function of GHs with multiple domains are not fully understood. This is why the information on their structural organization and mobility; mutual position and orientation of the individual domains and conformational changes induced by interaction with the substrates or difference in biochemical conditions might be very informative. A large number of GHs have been cloned and expressed in the lab under direction of Prof. Dr. Igor Polikarpov (Molecular Biotechnology group, IFSC/USP) and we follow already established protocols for their expression and purification. SAXS experiments have been carried out in collaboration with Dr. Evandro Ares de Araujo (USP, São Carlos) and Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Additionally to experimental work, a new software package SAXSMoW2 for SAXS data processing has been developed. The software allows to obtain rapidly main structural parameters of the protein molecule, calculate molecular weight and oligomeric state. To supplement an structural data, the method of statistical coupling analysis (SCA) has been significantly improved and applied. The method allows a better understanding of interconnection between evolutionary caused structural features and their biological functionality. Also, various bioinformatic methods were developed to complete and understand better structural information obtained in SAXS experiments. The first one is a method for separating sequences from GH7 into the two bins of exo- and endogluconases. It is helpful to analyze each type of proteins inside the family separately and study the role of functional loops -- structural features that significantly influence on biological activity. Other developed method is for finding of activity center in the new obtained Xylose Isomerase enzyme using related well-known structure from the same family. This method was applied to the enzyme whose structure was studied using crystallography technique in our laboratory at IFSC/USP. Inspired by SCA, a method of aminoacid fuzzy communities detection in proteins has been developed as well. This information also can complete SCA results showing strong correlated sets of aminoacids in the enzyme. Another one new developed method is an estimation of carbohydrate-active family affiliation of unknown proteins using Markov hidden model similarities and open access databanks of protein sequences.

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Esta tese apresenta uma abordagem para a criação rápida de modelos em diferentes geometrias (complexas ou de alta simetria) com objetivo de calcular a correspondente intensidade espalhada, podendo esta ser utilizada na descrição de experimentos de es- palhamento à baixos ângulos. A modelagem pode ser realizada com mais de 100 geome- trias catalogadas em um Banco de Dados, além da possibilidade de construir estruturas a partir de posições aleatórias distribuídas na superfície de uma esfera. Em todos os casos os modelos são gerados por meio do método de elementos finitos compondo uma única geometria, ou ainda, compondo diferentes geometrias, combinadas entre si a partir de um número baixo de parâmetros. Para realizar essa tarefa foi desenvolvido um programa em Fortran, chamado de Polygen, que permite modelar geometrias convexas em diferentes formas, como sólidos, cascas, ou ainda com esferas ou estruturas do tipo DNA nas arestas, além de usar esses modelos para simular a curva de intensidade espalhada para sistemas orientados e aleatoriamente orientados. A curva de intensidade de espalhamento é calculada por meio da equação de Debye e os parâmetros que compõe cada um dos modelos, podem ser otimizados pelo ajuste contra dados experimentais, por meio de métodos de minimização baseados em simulated annealing, Levenberg-Marquardt e algorítmicos genéticos. A minimização permite ajustar os parâmetros do modelo (ou composição de modelos) como tamanho, densidade eletrônica, raio das subunidades, entre outros, contribuindo para fornecer uma nova ferramenta para modelagem e análise de dados de espalhamento. Em outra etapa desta tese, é apresentado o design de modelos atomísticos e a sua respectiva simulação por Dinâmica Molecular. A geometria de dois sistemas auto-organizado de DNA na forma de octaedro truncado, um com linkers de 7 Adeninas e outro com linkers de ATATATA, foram escolhidas para realizar a modelagem atomística e a simulação por Dinâmica Molecular. Para este sistema são apresentados os resultados de Root Mean Square Deviations (RMSD), Root Mean Square Fluctuations (RMSF), raio de giro, torção das hélices duplas de DNA além da avaliação das ligações de Hidrogênio, todos obtidos por meio da análise de uma trajetória de 50 ns. / This thesis presents an approach to the fast creation of models in different geometries (complex or high symmetry) in order to calculate the scattering intensity, which can be used for the description of small angles scattering experiments. The modeling can be performed using more than 100 geometries cataloged in a database, besides the possibility to build structures from random positions distributed on the surface of a sphere. In all cases the models are generated using the finite element method composing a single geometry, or composing different geometries combined with each other, using a small number of parameters. To accomplish this task it was developed a program called Polygen, written in Fortran language, which allows the modeling of convex polyhedrons in different geometries, as solids, shells, with aligned beads or DNA-like structures at the edges. To simulate the scattering intensity curve, these models are used and is possible simulate oriented and randomly oriented systems. The scattering intensity curve is calculated using the Debye equation and the main parameters describing the models, can be optimized by the fitting of the calculated curves against experimental data. The optimization is performed by the use minimization methods based on simulated annealing, Levenberg-Marquardt and genetic algorithmic. The minimization procedures allows the optimization of themodel parameters (or models of composition) as size, electron density, gyration radius, among others, contributing to provide a new tool for modeling and scattering data analysis. In a further step of this thesis, the design of atomistic models is presented and therespective simulation by Molecular Dynamics. Two geometries for DNA self-assembly

Nickel-base superalloys obtain high temperature mechanical properties through formation of precipitate phases formed via heat treatment. The precipitate microstructure evolves with heat treatment or thermal exposure, which can lead to degrading mechanical properties. This project focuses on the use of electrical resistivity as a non-destructive testing method to monitor the precipitate phase in Waspaloy (a polycrystalline nickel-base superalloy). The evolution of the precipitate microstructure is characterized throughout the volume of the specimens using both small angle neutron scattering (SANS) and ultra small angle X-ray scattering (USAXS) measurements. These measurements are also aided by microscopy and X-ray diffraction measurements.

<p>Small-angle X-ray scattering (SAXS) is a biophysical technique that allows one to study the statistical conformation of a biopolymer in solution. The two-dimensional data obtained from SAXS is a low-resolution probe of the statistical conformation- it is a population weighted orientational average of all conformers within a conformational ensemble. Traditional biological SAXS experiments seek to describe an "average" structure of a protein, or enumerate a "minimal ensemble" of a protein at the atomic resolution scale. However, for highly flexible proteins, an average structure or minimal ensemble may be insufficient for enumeration of conformational space, and may be an over-parameterized model of the statistical conformation. This work describes a SAXS analysis of highly flexible proteins and presents a protocol for describing the statistical conformation based on minimally parameterized polymer physics models and judicious use of ensemble modeling. This protocol is applied to the structural characterization of S. aureus protein A - a crucial virulence factor - and Fibronectin III domains 1-2 - an important structural protein.</p> / Dissertation

La décomposition de solutions solides sursaturées d'alliages multiconstitués Al-Cu- (Li, Mg) pose des défis théoriques et expérimentaux. La formation de fluctuations chimiques à température ambiante est analysée de façon critique en utilisant une combinaison de diffusion centrale (SAS), de calorimétrie différentielle à balayage (DSC), de sonde atomique tomographique (APT) et de micro-dureté. Une méthodologie pour l'interprétation combinée de données SAS d'expériences utilisant des neutrons et des rayons X est proposée et permet une comparaison avec les données de sonde atomique. Les résultats donnent la chimie et les dimensions sub-nanométriques des amas. L'effet du Mg sur les cinétiques de vieillissement naturel est discuté dans le contexte de son interaction avec les lacunes disponibles pour la diffusion. De courts traitements isothermes à températures relativement basses sont utilisés pour dissoudre les amas présents après vieillissement naturel et obtenir une solution solide avec moins de lacunes qu’après mise en solution. Lorsque du Mg est présent dans le système Al-Cu-Li, le soluté libéré après dissolution se regroupe avec une cinétique comparable à celle obtenue immédiatement après la trempe du traitement de mise en solution. L'augmentation immédiate de la cinétique de mise en amas quand une concentration quelconque de Mg est présente dans les alliages Al-Cu- (Li, Mg) est révélée avec couple de diffusion. / Decomposition of super saturated solid solutions of Al-Cu-(Li,Mg) alloys pose theoretical and experimental challenges. The chemical fluctuations - clusters - formed at room temperature are critically analysed using a combination of in-situ small angle scattering (SAS), differential scanning calorimetry (DSC), atom probe tomography (APT), and micro-hardness. A methodology for combined interpretation of SAS data from experiments using neutron and X-ray radiation is proposed and allows for comparison with standard analysis performed by APT. The results effectively capture the chemistry and sub-nanometer dimensions of clusters. The profound positive effect of Mg on clustering of Cu via excess vacancies available for diffusion is captured through the clustering kinetics over the course of natural ageing. Short isothermal treatments at relatively low temperatures are used to dissolve naturally aged clusters and obtain a solid solution with less expected vacancies. When Mg is present in the Al-Cu-Li system, released solute after dissolution exhibits clustering behaviour with kinetics comparable to those immediately after quench from solution treatment. The immediate increase of clustering kinetics when any concentration of Mg is present in Al-Cu-(Li,Mg) alloys is revealed through a composition graded sample.

Esta tese apresenta uma abordagem para a criação rápida de modelos em diferentes geometrias (complexas ou de alta simetria) com objetivo de calcular a correspondente intensidade espalhada, podendo esta ser utilizada na descrição de experimentos de es- palhamento à baixos ângulos. A modelagem pode ser realizada com mais de 100 geome- trias catalogadas em um Banco de Dados, além da possibilidade de construir estruturas a partir de posições aleatórias distribuídas na superfície de uma esfera. Em todos os casos os modelos são gerados por meio do método de elementos finitos compondo uma única geometria, ou ainda, compondo diferentes geometrias, combinadas entre si a partir de um número baixo de parâmetros. Para realizar essa tarefa foi desenvolvido um programa em Fortran, chamado de Polygen, que permite modelar geometrias convexas em diferentes formas, como sólidos, cascas, ou ainda com esferas ou estruturas do tipo DNA nas arestas, além de usar esses modelos para simular a curva de intensidade espalhada para sistemas orientados e aleatoriamente orientados. A curva de intensidade de espalhamento é calculada por meio da equação de Debye e os parâmetros que compõe cada um dos modelos, podem ser otimizados pelo ajuste contra dados experimentais, por meio de métodos de minimização baseados em simulated annealing, Levenberg-Marquardt e algorítmicos genéticos. A minimização permite ajustar os parâmetros do modelo (ou composição de modelos) como tamanho, densidade eletrônica, raio das subunidades, entre outros, contribuindo para fornecer uma nova ferramenta para modelagem e análise de dados de espalhamento. Em outra etapa desta tese, é apresentado o design de modelos atomísticos e a sua respectiva simulação por Dinâmica Molecular. A geometria de dois sistemas auto-organizado de DNA na forma de octaedro truncado, um com linkers de 7 Adeninas e outro com linkers de ATATATA, foram escolhidas para realizar a modelagem atomística e a simulação por Dinâmica Molecular. Para este sistema são apresentados os resultados de Root Mean Square Deviations (RMSD), Root Mean Square Fluctuations (RMSF), raio de giro, torção das hélices duplas de DNA além da avaliação das ligações de Hidrogênio, todos obtidos por meio da análise de uma trajetória de 50 ns. / This thesis presents an approach to the fast creation of models in different geometries (complex or high symmetry) in order to calculate the scattering intensity, which can be used for the description of small angles scattering experiments. The modeling can be performed using more than 100 geometries cataloged in a database, besides the possibility to build structures from random positions distributed on the surface of a sphere. In all cases the models are generated using the finite element method composing a single geometry, or composing different geometries combined with each other, using a small number of parameters. To accomplish this task it was developed a program called Polygen, written in Fortran language, which allows the modeling of convex polyhedrons in different geometries, as solids, shells, with aligned beads or DNA-like structures at the edges. To simulate the scattering intensity curve, these models are used and is possible simulate oriented and randomly oriented systems. The scattering intensity curve is calculated using the Debye equation and the main parameters describing the models, can be optimized by the fitting of the calculated curves against experimental data. The optimization is performed by the use minimization methods based on simulated annealing, Levenberg-Marquardt and genetic algorithmic. The minimization procedures allows the optimization of themodel parameters (or models of composition) as size, electron density, gyration radius, among others, contributing to provide a new tool for modeling and scattering data analysis. In a further step of this thesis, the design of atomistic models is presented and therespective simulation by Molecular Dynamics. Two geometries for DNA self-assembly

The work in this PhD thesis covers two strands of x-ray experiments: firstly, the characterisation of large arrays of dense structures by means of x-ray scattering, and, secondly, the investigation of hybrid anisotropy square structures with x-ray microscopy. The ability to accurately characterise large arrays of nanoscale magnetic structures is a key requirement for both scientific understanding and technological advance such as bit patterned recording media (BPM). In this work small angle x-ray scattering (SAXS) was investigated as a characterisation technique for large arrays of patterned structures. Dense arrays of magnetic nanostructures were prepared on x-ray transparent membranes and measured. The SAXS data was then modelled to obtain structure parameters such as the mean structure diameter, the diameter distribution and the mean position variance with statistical significance. Arrays (500 x 500 μm2) of nominally uniform nanostructures with centre-to-centre distances between 250 nm-50 nm were structurally characterised and compared to structure diameters obtained by optical scanning electron microscopy measurements. The mean structure diameter was found to be between 39 nm-15nm and agree within the errors with the diameter obtained from SEM measurements. This work provides accurate data on the distribution (variance) of nanostructure sizes which is key for modelling these arrays for applicationin BPM. In the second part of the work, the static and dynamic properties of patterned hybrid anisotropy square structures ([Co/Pd]-Py) were investigated by using time-resolved scanning transmission X-ray microscopy (STXM). In these patterned structures the magnetisation in the layers change both in magnitude and direction and gives rise to interesting new domain configurations. The reciprocal interaction between magnetic vortices in the Py layer and locally circular stripe domains in the Co/Pd was investigated and a mutual domain imprint between the layer was observed. In dynamic excitation experiments the precession of the vortex core is studied and showed good agreement with micromagnetic simulations made by Hrkac and Bryan. As demonstrated patterned hybrid anisotropy square structures have promising magnetic properties with potential applications in data storage (vortex switching) or spintronics (vortex oscillators).