Reproduction de : Thèse de doctorat : Physique : Lyon 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. 115 réf. bibliogr.

Une augmentation de la prévalence des maladies cardiométaboliques (CMD) et mentales est observée au sein des populations autochtones du Nord du Canada. Le passage d'une alimentation traditionnelle à une diète de type occidental pourrait être responsable d'une déstabilisation du microbiote intestinal, un ensemble de microorganismes participants à des processus physiologiques clé incluant la régulation du système immunitaire. Le suivi de l'évolution de biomarqueurs du tractus gastrointestinal en temps réel et de manière longitudinale permettrait de supporter l'élucidation des liens entre les habitudes alimentaires de l'hôte et sa diète. Cependant, cela est entravé par les méthodes d'analyse classiques relativement longues qui reposent sur le prélèvement d'échantillons sanguins ou de fèces, acheminés ensuite vers des laboratoires spécialisés. L'objectif général de ce projet consiste à développer une sonde permettant l'analyse des processus microbiens du tractus gastrointestinal en temps réel en se basant sur l'utilisation d'une fibre optique fonctionnalisée avec des nanoparticules fluorescentes. Dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons démontré la possibilité d'utiliser l'agrégation de fluorophores avec des nanoparticules plasmoniques pour la détection d'acides lysophosphatidiques (LPA), des métabolites d'intérêt étant donné leur implication dans de nombreux processus, incluant la signalisation cellulaire, et dont une dysbiose est reliée à certains cancers. Tout d'abord, des sondes possédant une portion styrylpyridinium à titre de tête fluorescente ont été synthétisées afin d'optimiser l'interaction complémentaire avec les LPA tout en permettant leur immobilisation sur des particules plasmoniques. Une architecture cœur-coquille a été produite en combinant la croissance de germes pour l'obtention de particules d'argent, suivie d'un procédé Stöber modifié pour y déposer une fine coquille de silice d'épaisseur contrôlée. Leur fonctionnalisation avec les sondes moléculaires a été réalisée par l'utilisation de silanes afin de leur conférer une exaltation de fluorescence en plus d'une meilleure photostabilité. Dans le cas des sondes moléculaires, l'ajout de LPA cause une extinction de fluorescence pour de faibles concentrations d'analyte, mais une augmentation subséquente du signal pour des quantités plus élevées. Des analyses mécanistiques, incluant le titrage à calorimétrie isotherme de même que des analyses de temps de vie de fluorescence, ont permis d'investiguer le mécanisme de détection, en particulier la formation d'excimères. Dans le cas des suspensions colloïdales, c'est plutôt une amplification de signal qui est obtenue. Une caractérisation par suivi de nanoparticules a montré une agrégation des particules lors de l'ajout de LPA, indiquant une contribution potentielle du couplage plasmonique sur la tendance obtenue. Les perspectives du projet sont surtout reliées à l'immobilisation des particules fluorescentes sur une lamelle de microscopie ou même l'extrémité d'une fibre optique à titre de cathéter afin d'étudier l'impact de ce confinement sur les performances analytiques. La méthode d'analyse sera ensuite validée dans le but d'obtenir les concentrations métaboliques résolues spatialement et dans le temps. / Cardiometabolic disorders (CMD) and mental illnesses are increasingly prevalent pathologies found among indigenous populations of the northern Canada. Ongoing changes in their nutrition from country food to a western-type diet could give rise to a dysregulation of their gut microbiota, i.e., micro-organisms ongoing key physiological processes such as immune system regulation. Monitoring the longitudinal evolution of gut biomarkers in real-time would help decipher the links between the hosts diet and health. However, this is currently hampered by classical a posteriori analysis of fecal or gut samples. The overarching goal of the project is to develop an optical nanoprobe to monitor microbial processes in the gastrointestinal tract based on the use of an optical fiber functionalized with luminescent nanoparticles. During my thesis, we have demonstrated the possibility to use aggregation-based fluorescent transduction with the combination of plasmonic nanoparticles for lysophosphatidic acid (LPA) detection. LPA constitute targets of significant interest since they are involved in several processes, including cellular signalization, and of which a dysbiosis is related to several cancers. To begin with, molecular probes composed of a styrylpyridinium fluorescent head followed by a hydrophobic chain were synthesized to optimize the complementarity of interactions with LPA and allowing for their further immobilization on plasmonic nanoparticles. A core-shell nanoarchitecture was obtained by combining a seed-growth method for the silver nanoparticles core with a modified Stöber process to generate a silica shell of controlled thickness. Their surface functionalization with the fluorescent probe was achieved through the use of silane chemistry to bestow them with enhanced fluorescence intensity and photostability. In the case of the free molecular probes, adding LPA to the medium induces fluorescence quenching for small target concentrations, whereas a subsequent fluorescence enhancement is observed at higher LPA concentrations. Mechanistic investigations involving isothermal titration calorimetry and time-resolved fluorescence spectroscopy provided information on the potential transduction mechanism which would be related to the formation of excimers of the dyes. In the case of colloidal suspensions, a signal enhancement is obtained during titration with LPA. Nanoparticle tracking analysis revealed an aggregation of the nanoparticles when they interact with LPA, suggesting that plasmonic coupling is one of the contributions to the overall trend; the other mechanism would come from the local environment change at the surface of the particles. For the future works of the project, the fluorescent plasmonic nanoparticles will be immobilized on a glass substrate (microscope glass slide or optical fiber) to determine the impact of this constraint on the analytical performances of the sensor. The analytical method will further be validated in complex matrices to allow real-time and spatially-resolved measurements of gut metabolites in vivo.

Les activités humaines sont à l'origine de nombreuses pollutions par des hydrocarbures au niveau des écosystèmes, et plus particulièrement au niveau des sols. Afin de préserver la santé humaine et environnementale, il est nécessaire d'éliminer les polluants présents. Dans ce but, les techniques de bioremédiation apparaissent aujourd'hui comme de réelles alternatives aux techniques classiques, invasives et onéreuses. Cependant, l'utilisation optimale de tels procédés nécessite une meilleure connaissance des capacités métaboliques des communautés microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Dans ce cadre, l'utilisation des biopuces ADN fonctionnelles pour analyser ces écosystèmes semble très appropriée.Cependant, une de ses limitations actuelles est la détermination des sondes, qui ne ciblent que les gènes dont les séquences ont été caractérisées. Pour cela, un outil informatique (Metabolic Design) a été mis au point, afin de déterminer des sondes exploratoires pour biopuces fonctionnelles. L'étude, avec notre biopuce fonctionnelle, des capacités métaboliques de dégradation des HAP de la souche Sphingomonas paucimobilis sp. EPA505 a permis de mettre en évidence la sensibilité et la spécificité des sondes développées, ainsi que leur aspect exploratoire. Puis, nous nous sommes attachés à caractériser les capacités métaboliques des communautés bactériennes d'un sol pollué principalement par des HAP, sans à priori sur les séquences ou les organismes présents, montrant l'efficacité de notre approche.

L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) offre une excellente résolution à l’échelle macroscopique alors que l’imagerie optique lui est parfaitement complémentaire car elle dispose d’une haute résolution à l’échelle microscopique ainsi que d’une forte sensibilité. Les complexes de gadolinium(III) ont déjà prouvé leur efficacité en tant qu’agents de contraste IRM et d’autres lanthanides luminescents émettant dans le proche infrarouge conviennent pour l’imagerie optique. Des complexes de lanthanides bishydratés à motif pyridine montrant des résultats très prometteurs pour les deux types d’imagerie ont été développés précédemment au laboratoire. Afin d’améliorer leurs propriétés optiques, des ligands à motifs isoquinoléines ont été synthétisés. Leurs complexes de lanthanides montrent des propriétés magnétiques prometteuses et des constantes thermodynamiques qui démontrent leur faible toxicité in vitro. La longueur d’onde d’excitation et les rendements quantiques des complexes d’Yb3+ et de Nd3+ ont été augmentés pour permettre d’obtenir des images de luminescence et d’envisager des applications in vivo.Afin d’améliorer davantage ces propriétés optiques, la synthèse de ligands à motif 2-azaanthraquinone a été entreprise mais l’instabilité chimique de ces molécules n’a pas permis d’isoler les ligands désirés.Cette approche bimodale a été appliquée à la conception de sondes sensibles au zinc. La synthèse de complexes de Gd3+ à motifs pyridines adaptés permet une detection relaxométrique qualitative et sélective de ce cation. Cependant, l’absence de variation du nombre d’hydratation ne permet pas la détection par luminescence. De légères modifications chimiques sur les ligands devraient permettre d’atteindre cet objectif. / Among the state-of-the-art imaging techniques, Magnetic Resonance Imaging (MRI) offers an excellent macroscopic scale resolution whereas optical imaging shows high microscopic scale resolution and great sensitivity. Gadolinium complexes have already proved their efficiency as MRI contrast agents whereas other lanthanide cations emitting in the near infrared may suit for optical imaging purposes. Pyridine-based lanthanide complexes which showed promising results as bimodal probes have previously been developed. In the objective of improving their optical properties, isoquinoline-based ligands have been synthesized. The lanthanide complexes show promising magnetic properties and their thermodynamic stability presumes in vitro low toxicity. Excitation wavelengths and quantum yields of both Nd3+ and Yb3+ complexes have been improved to obtain luminescence images and to foresee in vivo applications. In order to further improve the optical properties, attempts to synthesize 2-azaanthraquinone-based ligands have been made.The desired ligands could not have been isolated due to their chemical instability. This bimodal approach has been applied to the design of smart probes sensitive to zinc. The qualitative and selective detection of the latter has been realized thanks to Gd3+ complexes with adapted pyridine-based ligands. However, the detection by luminescence could not be achieved. Slight chemical modifications on the ligands should allow reaching this goal.

L’imagerie in vivo du petit animal est de plus en plus utilisée en pharmacologie pour identifier et caractériser l’activité de nouveaux agents anticancéreux.La première partie de ma thèse a consisté à développer des outils pour améliorer la quantification enbioluminescence. Une méthode, basée sur les caractéristiques spectrales des photons émis, a été établie pour corriger l’absorption tissulaire. La seconde, faisant appel aux méthodes de restauration d’images, avait pour but de corriger la diffusion pour augmenter la résolution. Dans un second temps, j’ai mis en place des modèles in vivo de tumeurs expérimentales bioluminescentes (un glioblastome intracérébral, un lymphome anaplasique à grandes cellules et un neuroblastome métastatique) en utilisant les méthodes d’imagerie décrites précédemment. Ces études ont permis d’étendre la caractérisation de l’activité préclinique d’un nouvel agent anticancéreux. L’objectif de la dernière partie de mon travail était de développer des sondes d’imagerie. La première sonde, un anticorps monoclonal anti-CD45 marqué avec un fluorochrome a permis la détection de cellules leucémiques humaines implantées chez la souris en utilisant l’imagerie de fluorescence. La seconde a été développée pour prédire l’entrée d’un agent anticancéreux, un conjugué spermine-podophyllotoxin, dans les cellules tumorales via les transporteurs des polyamines. La sonde synthétisée est une spermine à laquelle un groupement HYNIC a été ajouté afin de pouvoir lier un radioisotope : le Technétium 99m et ainsi réaliser un examen scintigraphique. Les résultats ont démontré la faisabilité d’une application préclinique de cette sonde. Ainsi à l’issu de cette thèse, les méthodes de traitement des signaux de bioluminescence développées sont disponibles pour améliorer l’application de l’imagerie optique en pharmacologie. Bien sûr des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir précisément dans quel contexte ces corrections seront les plus appropriées. / Small animal imaging is more and more used in pharmacology to identify and to characterize the activities of new antitumor agents. The first part of my thesis consisted in the development of new tools to improve the quantitation in bioluminescence. A method, based on spectral characteristics of emitted photons, has been established to correct tissue absorption. The second, using methods of image restoration had for objective to correct tissue scattering to increase the resolution. In a second part, I developed in vivo models of bioluminescent tumors (intracranial glioblastoma, a large cell anaplastic lymphoma and a metastatic neuroblastoma) using the imaging methods described previously. These studies allowed the characterization of the activity of a new antitumor agent. The aim of the last part was to develop imaging probes. The first, a monoclonal antibody antiCD45 labeled with a fluorochrome allowed the detection of human leukemic cells implanted in the mice using fluorescence imaging. The second was developed to predict the uptake of a antitumor agent, a spermine-podophyllotoxin conjugate, in tumor cells via the polyamine transport system. The synthesized probe is a spermine conjugated to a HYNIC group to bind a radioisotope: the Technetium 99m and to realize a scintigraphic examination. The results showed the feasibility of a preclinical use of this probe. So, at this end of this thesis, the developed methods of bioluminescent signal processing are available to improve the use of optical imaging in pharmacology. Of course, supplementary studies are necessary to define precisely in which context these corrections will be the most appropriate.

Thèse doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Paris 12 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Sciences des matériaux : Paris 12 : 2003. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 188 réf.

De par le vieillissement de la population mondiale, les maladies neurodégénératives touchent de plus en plus de personnes. Ces maladies, trouvant leur siège dans la plupart des cas au sein des neurones, restent mal comprises. Dans le but d'améliorer notre connaissance des dysfonctionnements causés lors de ce type d'agression, il est indispensable de raffiner notre analyse (neurones individuels). Les dispositifs à base de nanofils (nanosondes verticales ou transistors à NF) offrent une valeur ajoutée certaine concernant l'interfaçage de dispositifs nanoélectroniques avec les cellules vivantes. En effet, leurs sections sont beaucoup plus petites que les dimensions des cellules, les rendant peu intrusifs et leur grand rapport surface/volume permet une forte interaction NF-cellule. Dans ces travaux de thèse, nous proposons de co-intégrer ces deux types de capteurs passifs et actifs sur une même plateforme à l'aide d'un procédé basé sur une approche top-down, couplant des étapes de photolithographie conventionnelle et de gravure plasma. Afin de tirer parti de la dimension de ces capteurs, particulièrement adaptée à l'interfaçage de cellules individuelles, une approche innovante de fabrication de réseaux organisés de neurones par fonctionnalisation chimique de surface sera présentée. Basée sur l'auto-alignement de molécules d'adhésion grâce à un fort contraste hydrophile/hydrophobe de la surface de l'échantillon, elle permet de contrôler très précisément la localisation spatiale des somas et de guider la croissance des prolongements. De larges réseaux organisés de neurones ont ainsi pu être réalisés, avec un taux élevé de somas individuels (74% des sites occupés). La croissance des prolongements est également maîtrisée à l'échelle sub-micronique. Couplée aux dispositifs d'enregistrement présentés précédemment (nano-sondes passives et transistors à NF), cette maîtrise de la croissance des neurones ouvre de nombreuses perspectives pour le suivi multi-site de l'activité électrique au sein d'une culture neuronale. La chaîne d'acquisition nécessaire au transport de l'information enregistrée depuis le capteur (échelle nanométrique) jusqu'à la visualisation des signaux sera ensuite présentée. Des cultures de neurones ont été réalisées sur cette plateforme et une activité électrique spontanée (PAs et LFPs) a pu être enregistrée après 9DIV par les nanosondes passives. Ces résultats restent à ce jour, inédits avec de tels dispositifs passifs à nanofils sur des neurones de rongeurs. Plusieurs stimulations chimiques (dépolarisation KCl et potentialisation bicuculline) ont également été effectuées, permettant de valider le fonctionnement des transistors et de comparer les deux approches (passive et active). Le caractère multi-sites des enregistrements à l'aide des nanosondes a aussi été mis en évidence. Enfin, des stimulations électriques localisées à l'aide des nanosondes verticales ont été réalisées et des LFPs provenant de l'excitation des neurones voisins du capteur ont pu être enregistrés, démontrant ainsi la bidirectionnalité de l'interaction. / Due to constant aging of world population, the struggle against neurodegenerative diseases is one of the major challenges in the near future and a better understanding of these pathologies goes through an improvement of basic mechanism knowledge involved in neuronal networks. In that scope, miniaturization of electronic components opens new perspectives for addressing such issues and holds great promise to improve the resolution levels. 1D-nanostructures such as NW-FET or NW-probes, offer real benefits thanks to their very small sections allowing to be less intrusive combined with their high surface-to-volume ratio leading to a higher affinity with cells. Here, we propose to co-integrate passive and active devices based on 1D nanostructures on the same platform (vertical NW probes and NW-FETs), to accurately compare advantages and drawbacks of each configuration regarding neuron electrical activity measurement. The two NW devices are fabricated with a large scale and cost effective top-down approach combining conventional lithography tools, plasma etching and sacrificial oxidation step to tune the nanostructure geometry. A core-shell-type device has been developed with a conductive part at the center, encapsulated by a conformal silicon oxide to insulate the probing nanostructures from liquid. In parallel, silicon NW-FETs are created with a planar NW channel (50 nm) connected by two highly doped low resistive regions. The device operation has been characterized in liquid environment (interface impedance of passive probes and pH sensing for transistors). Primary rat cortical neuronal cultures have been grown in-vitro with an unprecedented surface functionalization approach to precisely locate single neurons and guide the growth of their extensions. The approach allows the perfect location of somas on devices and the control of neurite growth at sub-micrometer scale. After 10 days-in-vitro, we detected for the first time spontaneous mammalian neuron action potentials using passive vertical NW-probes. Thereafter, several kinds of stimulation protocols have been implemented: (i) at the network level, with chemical stimulations such as KCl depolarization to mimic epileptic synchronization or with more refined stimulation (bicuculline). Local field potentials from few somas and action potentials from single neurons have been successfully recorded with a maximal signal-to-noise ratio of 10 for transistors compared to 40 for passive probes. (ii) At the cell level, where bi-directionality of passive probes have been used to locally trigger neuronal activity under electrical stimulation. Finally, multi-site recordings with vertical probes have been used to compare extra and intracellular probing.

L’objet de cette thèse a été la réalisation de sondes moléculaires fluorescentes pour de la détection de césium et de potassium en milieu aqueux. Deux problématiques ont été abordées : la détection de traces de césium en vue d’applications environnementales, et la mesure de variations de potassium en milieu biologique en vue d’applications biologiques. La première partie de cette thèse concerne la détection du césium. Dans un premier temps, différentes entités complexantes du césium ont été étudiées dans le but de mesurer des concentrations de césium comprises entre 1.10-3 et 5 ppm. Certaines de ces sondes ont ensuite été utilisées au sein d’un système de mesures basé sur un circuit micro-fluidique destiné à mesurer le césium de façon continue. La seconde partie de cette thèse s’intéresse à la détection du potassium. Dont le but a été de mettre au point des sondes pour mesurer le potassium extracellulaire par imagerie de fluorescence. Une cage complexante sélective du potassium a tout d’abord été identifiée. Différentes stratégies ont ensuite été développées pour remplacer la coumarine par un fluorophore excitable à de plus hautes longueurs d’ondes. Parmi les sondes étudiées, le Calix-COU-Alcyne-Sulf a permis d’effectuer des mesures in vitro préliminaires qui ont montré que ce type de sondes ne perturbe pas l’activité neuronale et permet de détecter le potassium dans la gamme de concentration visée. / The aim of this PhD was to study fluorescent molecular sensors in order to detect cesium and potassium in aqueous media. Two different issues have been addressed: the detection of cesium traces for environmental applications, and the measure of potassium fluctuations for biological applications. The first part concerns the detection of cesium. Several complexing units were first studied, to measure cesium concentration between 1.10-3 and 5 ppm. Some of the molecules made were then used in a measuring system based on a micro-fluidic chip to measure cesium in a continuous way. The second part concerns the detection of potassium. The aim was to design sensors to measure extracellular potassium fluctuations by fluorescence imaging. A selective complexing unit was first found. Several strategies were then explored to replace a coumarin by a fluorophore excitable at higher wavelengths. Among the molecules made, the Calix-COU-Alcyne-Sulf enabled preliminary in vitro measurements and showed that this type of molecules does not affect the neuronal activity and enables to measure potassium in the range of concentration targeted.

Ce travail de thèse s'inscrit dans le cadre général de l'étude des régimes instables et turbulents dans le plasma magnétisé de la machine de laboratoire Mirabelle. L'existence de gradients de pression et de potentiel transverses au champ magnétique entraîne l'apparition d'instabilités d'ondes de dérives et de types modes flûtes à l'origine d'un transport de particule non-diffusif à travers les lignes de champ magnétique. L'étude expérimentale de ces mécanismes de turbulence repose sur la maîtrise de méthodes de diagnostics adaptées dont la physique s'avère également complexe. Une première partie du travail est consacrée à la mesure des profils d'équilibre par sondes électrostatiques. En complément des sondes de Langmuir classiques, nous avons validé l'utilisation des sondes émissives pour la mesure directe du potentiel plasma dans Mirabelle. Nous nous sommes aussi intéressés au développement de la sonde ball-pen comme une méthode de diagnostic alternative aux deux sondes précédentes permettant également de mesurer directement le potentiel plasma. Une étude paramétrique complète de son fonctionnement nous a permis d'isoler plusieurs critères sur la géométrie de la sonde et son électronique qu'il est indispensable de satisfaire pour obtenir une mesure fiable dans un plasma basse température faiblement magnétisé. La seconde partie du travail est dédiée à la mesure des fluctuations du plasma et du transport turbulent qu'elles induisent. L'utilisation de l'imagerie rapide en tant que diagnostic permettant d'obtenir une mesure bi-dimensionelle non perturbative des fluctuations de densité du plasma a été validée dans le plasma d'hélium de la machine Mirabelle. La combinaison de mesures spectroscopiques et de mesures avec filtres interférentiels, ainsi que l'étude détaillée des différentes transitions radiatives mises en jeu, nous ont permis d'établir le lien explicite entre la densité électronique et la lumière émise naturellement par le plasma. La question délicate de la mesure du transport turbulent par triple sondes électrostatiques est discutée en détails. Différents types de sondes, émissives et sondes de Langmuir conventionnelles, ont été utilisées pour mesurer le transport turbulent dans un régime instable d'ondes de dérive. La contradiction entre les résultats obtenus à partir des différentes méthodes de diagnostics nous a amené à reconsidérer la fiabilité des mesures de transport par triple sonde / The general framework of this thesis is the study of unstable and turbulent regimes in the magnetized plasma device Mirabelle. The existence of pressure and potentiel gradients accross the magnetic field leads to drift-wave and flute mode instabilities which are responsible for non-diffusive cross-field particle transport. The experimental investigation of these turbulence mechanisms needs specific diagnostic methods that turn out to be complex. The first part of the work is devoted to equilibrium profile measurements by electrostatic probes. In addition to conventional Langmuir probes, we have validated the use of emissive probes for direct measurements of the plasma potential in the Mirabelle device. We have also developed the ball-pen probe as an alternative diagnostic method to directly measure the plasma potential. A full parametric study allowed us to find several criteria on the probe geometry and electronics wich are essential to be fulfilled to obtain reliable measurements in a low-temperature and low-magnetized plasma. The second part of the work is dedicated to plasma fluctuations and fluctuations induced transport measurements. The use of fast imaging as a diagnostic tool to obtain a nonperturbative and bi-dimensional plasma density fluctuation measurement has been validated in the helium plasma of the Mirabelle device. The combination of spectroscopic and interference filters measurements, as well as the detailed study of various radiative transitions, allowed to establish an explicit link between the electron density and light naturally emitted by the plasma. The delicate question of the extent of turbulent transport by triple electrostatic probes is discussed in detail. Different types of probes, emissive probes and conventional Langmuir probes, were used to measure the turbulent transport in an unstable drift-wave regime. The contradiction between the results obtained from the different diagnostic methods has led us to reconsider the reliability of transport measurements by triple probe