Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Plusieurs avancements technologiques sont à la base de la neurophotonique, une science qui utilise les propriétés de la lumière pour sonder le système nerveux. Le développement de plusieurs méthodes de détection optiques, la découverte des protéines fluorescentes, le développement de sondes moléculaires fluorescentes et l'avancement dans le domaine des modifications génétiques fournissent aux neurosciences des outils spécifiques pour l'étude du système nerveux et des différentes populations cellulaires qui le composent. Alors que ces techniques sont pleinement accessibles in vitro, les outils de détection in vivo demeurent limités. En effet, la microscopie est limitée aux couches superficielles du système nerveux et les systèmes endoscopiques sont relativement invasifs. L'objectif des travaux présentés dans le cadre de cette thèse est de fournir des outils de détection optique multifonctionnels pour la détection de fluorescence ou l'illumination in vivo qui pallient aux limitations des techniques couramment utilisées pour mesurer la fluorescence provenant de cellules du système nerveux ou encore contrôler (via les outils optogénétiques) l'activité neuronal à l'aide de stimuli optique in vivo. Cette thèse comprend en premier lieu une revue de littérature et certains aspects théoriques relatifs aux microsondes optiques et électriques. Par la suite, différents types de microsondes sont présentés. Un premier type a été fabriqué à l'aide d'une fibre optique étirée et d'une microélectrode « ion-sensitive » dans le but d'enregistrer les variations intracellulaires de la concentration de l'ion K+, qui jouent un rôle important pour le maintien du potentiel de membrane cellulaire et pour le niveau d'excitabilité neuronale. Ces sondes ont permis d'enregistrer, pour la première fois, les fluctuations de K+ intracellulaire pendant les crises d'épilepsie chez le chat anesthésié. Le deuxième type de sonde utilisé fut fabriqué à l'aide d'une fibre à deux cœurs, un cœur optique et un cœur creux servant d'électrode. Ces sondes ont permis d'enregistrer simultanément la concentration calcique intracellulaire et l'activité neuronale extracellulaire. Ces enregistrements ont permis de confirmer le caractère unicellulaire de la résolution de la sonde. Les travaux de cette thèse ont également servi à augmenter les propriétés multifonctionnelles des sondes optiques et électriques et à élargir la gamme d'expériences auxquelles elles peuvent s'adapter. Nos travaux ont montré que les sondes optiques pouvaient être utilisées avec un système de détection optique multispectrale et combiner plus d'un type d'enregistrement électrophysiologique en utilisant des couches métalliques conductrices. Il a également été montré qu'elles pouvaient être utilisées avec les outils optogénétiques pour contrôler le niveau d'activité neuronale. Les dépolarisations et hyperpolarisations photo-induites avec les sondes ont d'ailleurs permis de développer une nouvelle méthode de mesure permettant de mesurer les propriétés intrinsèques de la membrane neuronale à partir du milieu extracellulaire. / Neurophotonic, a science that uses light properties to probe the nervous system, relies on many technological advances. The development of optical detection methods, the discovery of fluorescent proteins, the development of fluorescent molecular probes and the advancement in the field of genetic modification provided neuroscientists specific tools to study the brain and the different cell populations that it includes. While these techniques are fully accessible in vitro, in vivo detection tools remain limited. Indeed, microscopy is limited to superficial layers of the nervous system or is relatively invasive (endoscopic systems). The objective of this thesis is to provide tools for in vivo fluorescence optical detection or light delivery that overcomes the limitations of commonly used techniques to measure fluorescence arising from neurons or glial cells or control (via optogenetic tools) cellular activity with optical stimuli in vivo. This thesis first review the optical detection techniques and list theoretical aspects related to optical microprobes. Subsequently, different developed types of microprobes are presented. One type that was developed combines a tapered optical fiber and an ion-sensitive microelectrode to record changes in intracellular K+ concentration, which plays an important role in maintaining cellular membrane potential and the neuronal excitability level. These probes allowed us to record for the first time intracellular K+ fluctuations during epileptic seizures in anesthetised cat. The second type of probe used in our work was fabricated from a dual core fiber integrating an optical core and a hollow core used as an electrode. Using the latter probe, we measured simultaneously intracellular Ca2+ fluctuations and extracellular neuronal activity and demonstrated their single-cell resolution capabilities. Our work also involved enhancing the microprobe multifunctional capabilities and the range of experiments that it can be adapted to. We demonstrated that optical microprobes could be used with a multispectral optical detection system and adapted to include thin metallic layers as secondary electrodes to record local field potentials. It was also shown that they could be used with optogenetics tools to control the level of neuronal activity. Finally, photo-induced currents generated with the probes were used to develop an innovative method to resolve intrinsic membrane properties of neurons from the extracellular medium.

Thèse de doctorat : Sciences de la Vie et de la Santé. Biophysique : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 16 p.

L’objet de cette thèse a été la réalisation de sondes moléculaires fluorescentes pour de la détection de césium et de potassium en milieu aqueux. Deux problématiques ont été abordées : la détection de traces de césium en vue d’applications environnementales, et la mesure de variations de potassium en milieu biologique en vue d’applications biologiques. La première partie de cette thèse concerne la détection du césium. Dans un premier temps, différentes entités complexantes du césium ont été étudiées dans le but de mesurer des concentrations de césium comprises entre 1.10-3 et 5 ppm. Certaines de ces sondes ont ensuite été utilisées au sein d’un système de mesures basé sur un circuit micro-fluidique destiné à mesurer le césium de façon continue. La seconde partie de cette thèse s’intéresse à la détection du potassium. Dont le but a été de mettre au point des sondes pour mesurer le potassium extracellulaire par imagerie de fluorescence. Une cage complexante sélective du potassium a tout d’abord été identifiée. Différentes stratégies ont ensuite été développées pour remplacer la coumarine par un fluorophore excitable à de plus hautes longueurs d’ondes. Parmi les sondes étudiées, le Calix-COU-Alcyne-Sulf a permis d’effectuer des mesures in vitro préliminaires qui ont montré que ce type de sondes ne perturbe pas l’activité neuronale et permet de détecter le potassium dans la gamme de concentration visée. / The aim of this PhD was to study fluorescent molecular sensors in order to detect cesium and potassium in aqueous media. Two different issues have been addressed: the detection of cesium traces for environmental applications, and the measure of potassium fluctuations for biological applications. The first part concerns the detection of cesium. Several complexing units were first studied, to measure cesium concentration between 1.10-3 and 5 ppm. Some of the molecules made were then used in a measuring system based on a micro-fluidic chip to measure cesium in a continuous way. The second part concerns the detection of potassium. The aim was to design sensors to measure extracellular potassium fluctuations by fluorescence imaging. A selective complexing unit was first found. Several strategies were then explored to replace a coumarin by a fluorophore excitable at higher wavelengths. Among the molecules made, the Calix-COU-Alcyne-Sulf enabled preliminary in vitro measurements and showed that this type of molecules does not affect the neuronal activity and enables to measure potassium in the range of concentration targeted.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Pour bénéficier de la grande sensibilité de la spectroscopic de fluorescence, l'emploi de marqueurs luminescents stables et brillants est nécessaire. Cependant, les fluorophores organiques les plus couramment utilisés souffrent de certaines limitations importantes (hydrophobicité, extinction collisionnelle en milieu aqueux, faible rendement quantique de fluorescence, faible résistance à la photodégradation). À cet égard, le phénomène d'exaltation plasmonique de la fluorescence, soit, le couplage entre les plasmons de surface de nanostructures métalliques et les fluorophores à proximité, représente une technologie puissante pour surmonter ces limitations et augmenter la sensibilité de détection des différentes applications biologiques de ses fluorophores. Dans cette thèse, nous avons développé des nanosondes composées d'un noyau métallique recouvert d'une matrice de silice contenant le(s) fluorophore(s) d'intérêt(s) (Figure 1.13). Dans de tels systèmes, le noyau métallique manifeste une forte résonance plasmonique dont l'interaction avec les molécules fluorescentes environnantes améliore considérablement l'efficacité d'excitation et le taux d'émission radiatif. Par ailleurs, la réduction de la durée de vie de l'état excité du fluorophore qui s'ensuit est responsable de l'augmentation de la photostabilité et de la détectabilité. En outre, la coquille de silice protège les fluorophores contre la désactivation collisionnelle et peut être aisément fonctionnalisée avec des biomolécules cibles ou des fluorophores et former des complexes électrostatiques avec des molécules chargées. Enfin, l'exaltation plasmonique permet d'améliorer l'efficacité, le taux de transfert et la portée du transfert d'énergie par résonance de type Fôrster (FRET) au sein de la nanoparticule en augmentant la force des interactions donneur-accepteur. Tout cela peut conduire à l'excitation par un seul donneur de plusieurs accepteurs sur des distances dépassant la portée normale du FRET. Ces nanoparticules multicouches de type coeur-coquille présentent de nombreuses caractéristiques requises pour l'obtention d'une sonde fluorescente idéale, ce qui a été démontré avec succès avec l'utilisation de ces nanosondes pour la détection ultrasensible et spécifique de faibles quantités d'ADN en solution, sans aucun marquage ou amplification enzymatique des acides nucléiques.

Le mercure est universellement reconnu comme un contaminant largement distribué dans l'environnement en raison d'activités naturelles et anthropiques. Comme certaines de ses espèces peuvent se propager et s'accumuler à travers la chaine alimentaire, ce polluant peut poser un risque élevé pour la santé humaine. Heureusement, ces dangers sont atténués par la mise en place de politiques et par le suivi de la qualité de l'eau et des aliments dans des laboratoires d'analyse équipés d'instruments de pointe conçus pour fournir une réponse analytique précise et sensible. Malgré cela, cette approche est plus ou moins adéquate pour répondre aux besoins spécifiques des communautés de régions éloignées, où l'accès limité aux installations d'analyse et les coûts d'expédition élevés entravent le suivi exhaustif des aliments. Pourtant, les peuples autochtones habitant l'Arctique, comme les Inuits, courent un risque plus élevé d'exposition au mercure en raison de l'accumulation préférentielle du contaminant aux pôles et d'un mode de vie reposant fortement sur la chasse et la pêche traditionnelles. Considérant que l'alimentation traditionnelle est une partie vitale de la culture et qu'elle procure d'autres nutriments essentiels à la santé, limiter la consommation de ces aliments n'est pas une option viable et l'amélioration du suivi de la qualité alimentaire est donc capitale. Dès lors, le développement d'une plateforme de détection qui serait facile à utiliser, peu coûteuse à produire et qui présenterait une faible empreinte spatiale permettrait d'accomplir le suivi de la qualité directement sur le terrain, favorisant alors l'autonomie de ces communautés. Compte tenu de ce qui précède, l'objectif principal encadrant les travaux de cette thèse était de développer une sonde moléculaire fluorescente pour la détection sélective et sensible du mercure en bénéficiant de la simplicité instrumentale associée à la récolte de signaux optiques. La mise au point de cette stratégie a d'abord exigé la synthèse d'un fluorophore sensible au Hg et l'étude de ses propriétés de détection. Dans un deuxième temps, la photostabilité et la sensibilité au Hg de la molécule ont été améliorées par son assemblage sur des nanoparticules d'argent ayant des propriétés plasmoniques propices à l'exaltation de la fluorescence par le métal (MEF). Troisièmement, le capteur hybride argent-fluorophore développé a été intégré dans un dispositif microfluidique facilitant l'utilisation de la sonde en éliminant la manipulation des solutions typiquement requise par l'utilisateur pour faire l'analyse du mercure. De plus, comme une préparation d'échantillon précède généralement l'analyse en laboratoire, le potentiel de la méthode de détection dans un dispositif portatif qui intégrerait des étapes de préparation d'échantillon a aussi été évalué et discuté. / Mercury is universally established as a contaminant widely distributed in the environment due to natural and anthropogenic activities. As some of its species can distribute and accumulate through the food chain, this pollutant can cause a significant threat to human health. Fortunately, these hazards are alleviated by establishing policies and monitoring this contaminant in analytical laboratories equipped with state-of-the-art instruments designed to provide a precise and sensitive analytical response. Regardless, this approach is sometimes ill-suited to meet the specific needs of populations living in remote regions where access to facilities is limited and high shipping costs impede timely and reasonably priced food monitoring. Yet, the indigenous peoples inhabiting the Artic, such as the Inuits, are at a higher risk of mercury exposure due to the latter's preferential accumulation at the poles combined with a livelihood that strongly relies on traditional hunting and fishing. Since country food is an integral part of their culture and provides other essential nutrients, limiting the consumption of these foods is not a sustainable route and improving the efficiency of quality monitoring is therefore imperative. This could be achieved through the development of a field-deployable detection platform that would be easy to operate, inexpensive to produce and would exhibit a small spatial footprint. This strategy would eventually enable northern communities to have a better autonomy with regards to food monitoring and the ensuing decision-making. The main objective of the project presented in this thesis was to design a fluorescent molecular probe for the sensitive and selective sensing of mercury by benefitting from the instrumental simplicity associated with the detection of optical signals. Developing this strategy first required the synthesis of a Hg-sensitive fluorophore and the study of its detection properties. In a second stage, the molecule's photostability and Hg-sensitivity was enhanced by its assembly onto silver nanoparticles which exhibit plasmonic properties that are conducive to fluorescence enhancement through a phenomenon called metal-enhanced fluorescence (MEF). Thirdly, the MEF assembly was integrated into a microfluidic cartridge that facilitates the usage of the developed sensor without requiring the complex handling of solutions to perform mercury analysis. Moreover, as a sample preparation is usually carried out beforehand in a laboratory set-up, the compatibility of the detection method in a portable device that would also integrate sample preparation steps was evaluated and discussed.

Les techniques de fluorescence sont des outils de choix pour l’étude et la compréhension fine des processus biologiques. Ceci requiert toutefois l’utilisation de sondes fluorescentes parfaitement adaptées au but visé et répondant aux différentes exigences requises pour l’application visée. Dans ce cadre, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’élaboration de sondes biphotoniques de pH adaptées à une mesure très sensible de faibles variations de pH autour du pH neutre. Les variations et gradients de pH sont en effet impliqués dans un certain nombre de processus biologiques importants et peuvent être associées à des dysfonctionnements liés à certaines maladies. Dans ce cadre, nous avons développé de nouvelles sondes fluorescentes de pH fluorescentes présentant à la fois un comportement ratiométrique, une forte sensibilité autour du pH neutre et facilement excitables dans le proche IR par absorption à deux photons. Ces sondes de structure quadrupolaire et bolamamphiphile permettent ainsi la détection ratiométrique du pH dans des environnements biologiques au moyen d'une excitation biphotonique dans le proche IR. En parallèle, nous nous sommes intéressés à l’élaboration de nanoparticules hyperbrillantes dédiées à l’imagerie biologique par microscopie de fluorescence induite par excitation à deux photons. Nous nous sommes plus particulièrement attachées au design de nanoparticules organiques fluorescentes constituées de molécules organiques de bas poids moléculaire (FONs). Cette approche offre en effet une grande flexibilité et la possibilité d’accéder à des nanosondes ayant des brillances comparables aux très populaires quantum dots mais moins toxiques et plus facilement dégradables. L’ingénierie moléculaire des fluorophores utilisés pour la préparation des FON est cruciale puisqu’elle influence fortement à la fois les propriétés photophysiques (brillance, couleur…) et leur propriétés physico-chimiques (stabilité chimique et structurale, stabilité colloïdale). Dans ce contexte, une librairie de nouveaux chromophores dipolaires a été synthétisée et utilisées pour la préparation de FON par la méthode de nano-précipitation. Leurs propriétés ont été étudiées afin de déterminer la relation entre la structure du chromophore et les propriétés globales des nanoparticules constituées de ces colorants. Ce travail a permis d’identifier les paramètres structuraux permettant d’accéder à des nanoparticules présentant à la fois une brillance exceptionnelle, une émission modulable du vert au rouge et proche IR et une remarquable stabilité colloïdale. Ces nanoparticules présentent des potentialités majeures pour l’imagerie in vivo par excitation et détection dans le proche IR. / Fluorescence-based techniques are popular tools for the study and understanding of biological processes. This has prompted continuous research aimed at the development of a wide range of fluorescent probes specifically designed for specific applications. Among them, fluorescent pH probes are of much interest as pH variations or gradients are involved in many biological events and anomalous alterations are often related to the onset of dysfunctions and diseases. In this framework we have developed a series of promising two-photon pH fluorescent molecular probes. These quadrupolar bolaamphiphilic probes are of great interest, as they combine a steep pH dependence of their optical properties close to neutral pH, ratiometric behavior and large response to two-photon (2P) excitation in the NIR region. As such they offer much promise for ratiometric detection of the pH in biological environments and in situ monitoring of acidification. In parallel, we have been interest in the design of ultrabright nanoparticles for bioimaging purpose (in particular highly sensitive optical imaging). We chose to focus on Fluorescent Organic Nanoparticles made of organic molecules with low molecular weight (FONs) as they offer a flexible route and promising alternatives to toxic quantum dots. In this case the design of the dye used as building blocks of the FONs is of crucial importance and strongly influence the chemical and physical properties of the nanoparticles generated, such as their one and two-photon brightness and both their structural and colloidal stability. In that context a library of novel dipolar chromophores have been synthesized and used to prepare FONs using the nanoprecipitation method. Their properties were thoroughly investigated in order to determine the relationship between the molecular design of the isolated dye and the overall properties of the nanoparticles made of these dyes. As a result, Hyperbright FONs emitting in the green to NIR region and combining giant brightness and remarkable stability have been achieved. They offer major promise for bioimaging based on both excitation and detection in the NIR region.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Instrumentation et analyse avancée : Lille 1 : 2006. / N° d'ordre (Lille 1) : 3950. Résumés en français et en anglais. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 175-179. Liste des publications.

Thèse doctorat : Chimie Organique : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 25 p.

Les méthodes de synthèse d'hétérocycles fonctionnalisés suscitent un vif intérêt de la part de l'industrie pharmaceutique et sont d'une grande importance pour la synthèse de produits naturels et le développement des nano-sciences. La chimie organométallique a révolutionné les approches de fonctionnalisation d'hétérocycles et actuellement le développement de méthodes alternatives aux couplages croisés basées sur la fonctionnalisation directe de la liaison C-H catalysées par un métal de transition, qui sont plus attractives en terme d'économie d'atomes et de chimioselectivité, est fortement étudié. Toutefois une réelle valorisation de ces techniques repose essentiellement sur un accroissement de la diversité et des techniques de contrôle du site de la substitution. Ce travail s'inscrit dans ce programme de développement en série oxazolique dont l'une des principales difficultés réside dans la compétitivité des positions 2 et 5 du noyau oxazole. Le projet a été centré en particulier sur l'étude de la fonctionnalisation directe régiosélective de l'oxazole-4-carboxylate d'éthyle qui a été sélectionné en raison de sa haute valeur ajoutée en synthèse totale, la modularité chimique apportée par la fonction ester et une plus grande discrimination électronique et environnementale des positions 2 et 5 par rapport à l'oxazole nu. La première partie du travail a été axée sur l'établissement d'un nouveau procédé d'hétéroarylation pallado-catalysé régiosélectif en position 2 de l'oxazole-4-carboxylate d'éthyle avec une large gamme d'(hétéro)aromatiques iodés, bromés et chlorés, basé sur l'emploi spécifique de deux ligands, le Cy-JohnPhos et la tri-o-tolylphosphine dans deux solvants, le dioxane et le toluène. Dans le cadre d'une collaboration avec le Dr Doucet de l'Université de Rennes portant sur le développement de systèmes catalytiques plus "éco-compatibles", une étude préliminaire de remplacement du toluène par le diéthylcarbonate a également été réalisée avec succès. Une procédure étendue de vinylation, de benzylation et de méthylation directes régiosélectives en position 2 de l'oxazole-4-carboxylate d'éthyle a également été développée. Les méthodologies de fonctionnalisation directes de l'oxazole-4-carboxylate d'éthyle ont ensuite été mises à profit pour accéder aux oxazoles 2-mono- et 2,5-difonctionnalisés. Trois nouvelles synthèses totales de la balsoxine, de la texaline et de l'annulonine ont ainsi pu être proposées. De plus, dans le contexte actuel du développement de nouveaux fluorophores pour la chimie de détection, un panel d'analogues DPO-4-carboxylates et POPOP-4-dicarboxylates a été obtenu. Trois analogues possédant un déplacement de Stokes amélioré tout en conservant un très bon rendement quantique ont été identifiés. La dernière partie de ce travail a été consacrée à un examen détaillé de trois paramètres du processus d'arylation directe pallado-catalysé de l'oxazole-4-carboxylate d'éthyle, la demande électronique, la force basique mesurée par incorporation de deuterium, et l'influence de la base sur la réussite du couplage. Il a permis de dégager deux modes d'activation principaux, la déprotonation/métallation ortho-dirigée (ODM) et la métallation/déprotonation concertée (CMD), dont le site d'action dépend essentiellement de la nature du solvant.

Les boîtes quantiques (ou Quantum Dots en anglais - QD) sont une nouvelle génération de sondes polyvalentes pour la biologie, en particulier pour l’imagerie. Pour des applications de marquage des voies intra-cellulaires, les QDs peuvent être conjugués à des biomolécules telles que des acides nucléiques ou des protéines. En partant des travaux du LPEM portant sur le développement de ligands permettant la dispersion des QDs dans l’eau et leur fonctionnalisation, une nouvelle méthode de conjugaison de l'ADN sur les QDs a été développée dans cette thèse. Cette méthode utilise les motifs présents sur les polymères des QDs pour le greffage d'ADN. Les paramètres affectant cette réaction ont été étudiés et cette stratégie de couplage a été étendue à d'autres nanoparticules et biomolécules. En partant de ces QDs-ADN, des protéines modifiées ADN ont pu être attachées aux QDs en utilisant le principe d’hybridation de l’ADN. Les propriétés des conjugués ainsi générés ont été mises en évidence en utilisant la Transferrine (QD-ADN-Tf) et ces complexes ont été étudiés in vitro et in cellulo. Ces conjugués ont ensuite été utilisés pour le suivi de la dynamique des endosomes, exploitant ainsi pleinement le potentiel des QDs pour l’imagerie directe. Dans la dernière partie, des études supplémentaires sur les facteurs influençant la «performance biologique» des QDs ont été réalisées. Pour cela, une large gamme de ligands polymères développée par le groupe a été utilisée pour sonder l'interaction de la surface des QDs avec l'interface biologique. Des expériences biochimiques et cellulaires ont permis de démontrer que les QDs revêtus de divers polymères ont des comportements différents. / Quantum dots (QD) are new generation of versatile probes for biology, particularly for bioimaging. For specific applications, QDs are conjugated to biomolecules such as nucleic acid or proteins and subsequently targeted to unique intra-cellular pathways. Building upon the state-of-the-art ligands for water-dispersible QDs developed by the lab, a novel and highly generalizable method to conjugate DNA to QD is developed in this thesis. This method employs thiols present on polymers on QDs for conjugation to maleimide-functionalized DNA. Extensive characterization of parameters affecting this reaction is carried out and the strategy is extended to other nanoparticles and biomolecules. Following this, a novel method to conjugate proteins to QD via DNA hybridization is discussed. Using a model protein Transferrin (Tf), the unique properties of thus generated QD-DNA-Tf conjugates are studied in-vitro and in-cellulo. These conjugates are subsequently used for tracking endosomal dynamics for up-to 20 minutes, exploiting the fullest potential of QDs for live imaging. In the last part, additional studies on factors affecting the ‘biological performance’ of QDs are carried out. Using a range of highly adaptable polymeric ligands developed by the group, interactions of surface-modified QDs with the biological interface are probed. Systematic biochemical and cellular experiments demonstrate that QDs coated with zwitterionic polymers have superior antifouling properties compared to poly(ethylene glycol)-based polymers and stability in diverse biological contexts.