Les méthodes de synthèse d’hétérocycles fonctionnalisés suscitent un vif intérêt de la part de l’industrie pharmaceutique et sont d’une grande importance pour la synthèse de produits naturels et le développement des nano-sciences. La chimie organométallique a révolutionné les approches de fonctionnalisation d’hétérocycles et actuellement le développement de méthodes alternatives aux couplages croisés basées sur la fonctionnalisation directe de la liaison C-H catalysées par un métal de transition, qui sont plus attractives en terme d’économie d’atomes et de chimioselectivité, est fortement étudié. Toutefois une réelle valorisation de ces techniques repose essentiellement sur un accroissement de la diversité et des techniques de contrôle du site de la substitution. Ce travail s’inscrit dans ce programme de développement en série oxazolique dont l’une des principales difficultés réside dans la compétitivité des positions 2 et 5 du noyau oxazole. Le projet a été centré en particulier sur l’étude de la fonctionnalisation directe régiosélective de l’oxazole-4-carboxylate d’éthyle qui a été sélectionné en raison de sa haute valeur ajoutée en synthèse totale, la modularité chimique apportée par la fonction ester et une plus grande discrimination électronique et environnementale des positions 2 et 5 par rapport à l’oxazole nu. La première partie du travail a été axée sur l’établissement d’un nouveau procédé d’hétéroarylation pallado-catalysé régiosélectif en position 2 de l’oxazole-4-carboxylate d’éthyle avec une large gamme d’(hétéro)aromatiques iodés, bromés et chlorés, basé sur l’emploi spécifique de deux ligands, le Cy-JohnPhos et la tri-o-tolylphosphine dans deux solvants, le dioxane et le toluène. Dans le cadre d’une collaboration avec le Dr Doucet de l’Université de Rennes portant sur le développement de systèmes catalytiques plus "éco-compatibles", une étude préliminaire de remplacement du toluène par le diéthylcarbonate a également été réalisée avec succès. Une procédure étendue de vinylation, de benzylation et de méthylation directes régiosélectives en position 2 de l’oxazole-4-carboxylate d’éthyle a également été développée. Les méthodologies de fonctionnalisation directes de l’oxazole-4-carboxylate d’éthyle ont ensuite été mises à profit pour accéder aux oxazoles 2-mono- et 2,5-difonctionnalisés. Trois nouvelles synthèses totales de la balsoxine, de la texaline et de l’annulonine ont ainsi pu être proposées. De plus, dans le contexte actuel du développement de nouveaux fluorophores pour la chimie de détection, un panel d’analogues DPO-4-carboxylates et POPOP-4-dicarboxylates a été obtenu. Trois analogues possédant un déplacement de Stokes amélioré tout en conservant un très bon rendement quantique ont été identifiés. La dernière partie de ce travail a été consacrée à un examen détaillé de trois paramètres du processus d’arylation directe pallado-catalysé de l’oxazole-4-carboxylate d’éthyle, la demande électronique, la force basique mesurée par incorporation de deuterium, et l’influence de la base sur la réussite du couplage. Il a permis de dégager deux modes d’activation principaux, la déprotonation/métallation ortho-dirigée (ODM) et la métallation/déprotonation concertée (CMD), dont le site d’action dépend essentiellement de la nature du solvant. / Development of versatile synthetic routes towards functionalized heterocycles is of main importance for pharmaceutical, total synthesis and materials. The organometallic chemistry has revolutionized the access to functionalized heterocycles and the development of more practical, chimioselective and atom-economy transition metal-catalyzed direct C-H functionalization methodology is currently actively examined as alternatives to the experimentally restrictive and highly used cross-coupling reactions. However, a possible valorisation of such synthetic approach in several fields of chemistry dramatically depends on the development of novel methods for controlling the site and the nature of the substitution. The project is concerned with the challenging oxazole serie for which the 2 and 5 positions are highly competitive, and has been first focused on the study of the direct C-H bond heteroarylation of the selected ethyl oxazole-4-carboxylate which is a ready available and highly valuable in total synthesis scaffold. Moreover interestingly this model exhibits a more electronically and environmental difference between the 2 and 5 competitive sites coupling than the naked oxazole. Thus, the first part of the work lead to the development of a novel regioselective direct C-H bond heteroarylation of ethyl oxazole-4-carboxylate with broad iodo-, bromo- and chloroheteroaromatics using specifically both Cy-JohnPhos and tri-otolylphosphine ligands in dioxane and toluene as solvents. Moreover, the use of the more biodegradable diethylcarbonate as an alternative to toluene as solvent was successfully accomplished through a partnership with Dr Doucet of Université de Rennes concerned with the development of green catalysts. An extended protocol for regioselective direct C-H vinylation, benzylation and methylation of ethyl oxazole-4-carboxylate protocol was also proposed. The previous developed direct C-H heteroarylation methodologies in oxazole-4-carboxylate serie were then first applied to the preparation of 2-mono- and 2,5-difunctionalized oxazoles. Three novel total syntheses of balsoxin, texaline and annulonine, were achieved. In a current context of the designing of original fluorophores for the field of molecular interactions detection, a library of DPO-4-carboxylates and POPOP-4-dicarboxylates was prepared. Interestingly, three novel analogs exhibit a much more better Stokes-shift than DPO and POPOP references with a high-preserved quantum yield. The last part of this work was devoted to the examination of three parameters of the palladium-catalyzed direct C-H arylation in oxazole-4-carboxylate serie, the electronic demand, the basic strength measured by deuterium incorporation and its influence on the success of the direct coupling, allowed us to highlight two main activation pathways, the ortho-directed deprotonation métallation (ODM) and the concerted metallation deprotonation (CMD), that act differently and at different sites depending mainly on the nature of the solvent.

Le système nerveux central (SNC) est composé d'une population hétérogène de neurones. L'étude de leurs propriétés fonctionnelles à l'intérieur du SNC est indispensable afin de parvenir à comprendre leur rôle dans l'intégration du signal à l'intérieur d'un réseau. Pour accéder à ces informations, il est essentiel de pouvoir enregistrer de manière électrophysiologique des cellules identifiées dans le tissu intact. Ce type d'enregistrement ciblé est un défi, spécialement pour les circuits locaux de neurones. Pour prendre pleinement avantage des récentes techniques de marquages fluorescents, l'habilité à enregistrer des cellules individuelles électrophysiologiquement doit être combinée à un système de détection optique. Ce système doit être lui aussi capable de détecter les neurones sur une base individuelle profondément dans le SNC. Cette thèse fait la description d'une nouvelle microsonde optique et électrique basée sur une fibre optique à deux cœurs : un cœur optique permettant d'excitation local de la fluorescence de cellules marquées par un fluorophore et permettant aussi de collecter la fluorescence émise, et un cœur creux remplis d'électrolytes permettant l'enregistrement électrophysiologique unitaire de manière extracellulaire. Cette nouvelle approche permet la production de microsondes ayant suffisamment de résolution spatiale optique pour détecter une cellule unique : la microsonde peut être étirée pour obtenir un diamètre de pointe allant jusqu'à 6 µm, ce qui est plus petit que les corps cellulaires de la plupart des populations neuronales. La thèse présente l'évolution des différents designs de microsonde et du montage expérimental. Pour caractériser les propriétés optiques des sondes, une série d'expériences in vitro (sur des tranches cérébrales de rat) ont été réalisées ainsi qu'une série de simulations numériques. Par la suite, des expériences in vivo (sur le SNC de rat et souris) ont été faites pour identifier et enregistrer des neurones spinothalamique unitaires marqués au DiI ainsi que des neurones cérébraux de souris génétiquement modifiés pour exprimer de la GFP dans leurs cellules GABAergiques. Cette thèse présente aussi un critère spatial optique et électrophysiologique afin de confirmer la co-détection de cellules unitaire. Cette nouvelle microsonde ouvre de larges possibilités pour les enregistrements électrophysiologiques in vivo en donnant accès, en parallèle, aux signaux optiques unicellulaires. / The central nervous system is composed of heterogeneous populations of neurons. Studying their functional properties in the intact central nervous system (CNS) is key to be able to understand their respective role in signal processing within entire networks. To achieve this, it is essential to be able to record electrophysiologically from identified neurons in the intact tissue. Recording from identified cells types in vivo has remained a challenge, especially for local circuit neurons. Novel fluorescent labeling techniques open new possibilities on that front. To take full advantage of these recent developments, the ability to record electrophysiological signals from single neurons must be combined with optical detection of individual cells deep into CNS tissue. Here it describe the development of a novel microprobe based on a dual core optical fiber: an optical core that excites locally fluorescent labeled cells and collects back the fluorescence, and an electrolyte filled hollow core that performs classical extracellular single unit electrophysiological measurements. In contrast to previous solutions, this novel design allows production of microprobes with sufficient optical resolution for single cell detection: the microprobes could be pulled down to tips sizes of 6 µm, which is smaller than the cell body diameter of most neuron populations. It is presented the evolution of the microprobe design and the experimental setup. To characterize the optical properties of the probes, it is showed a series of in vitro experiments and numerical simulations. Then, it is presented in vivo experiment to identify and record single spinal neurons labeled retrogradely with fluorescent dyes as well as single GABAergic interneurons expressing GFP in the brain of transgenic mice. It's also established a spatial criterion to correlate optical and electrophysiological signals, confirming co-detection of single cells. This novel microprobe vastly expands possibilities for in vivo electrophysiological recording by providing parallel access to single cell optical monitoring.

La cartographie optique est une technique qui permet de mesurer l'activité électrique transmembranaire dans les tissus excitables avec une haute résolution spatiale et temporelle et d'une manière non invasive en utilisant des sondes fluorescentes sensibles au potentiel membranaire. Récemment, les cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) ont été introduites et adoptées par plusieurs laboratoires comme un modèle puissant pour l'étude des maladies affectant des tissus inaccessibles. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie héréditaire neuromusculaire incurable qui touche plusieurs organes, notamment le cœur. Dans ce projet de maitrise, des monocouches de hiPSC dérivées en cardiomyocytes ont été générées à partir d'un individu sain (CTRL), un patient DM1-1300 et un patient DM1-300, afin d'étudier les manifestations de la DM1 au niveau cardiaque. Les monocouches de hiPSC-CM ont été marquées par une sonde sensible au voltage (di-4-ANEPPS). Le potentiel membranaire a été ensuite cartographié à l'aide d'un macroscope à épifluorescence de haute résolution spatiale et temporelle. Des cartes isochrones de l'activation ont été générées. Les durées des potentiels d'action (DPA₉₀, ₅₀), les vitesses de conduction (CV) ainsi que le temps de dépolarisation (TRise) ont été mesurés. De plus, plusieurs tests pharmacologiques ont été effectués afin de valider nos résultats obtenus par notre système d'imagerie, ainsi que la fiabilité de notre modèle in vitro. Nous avons produit un tissu cardiaque qui a démontré les mêmes caractéristiques que les cardiomyocytes natifs à différentes drogues. Ce modèle in vitro s'est avéré un bon candidat pour de futures études sur les propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques des cellules cardiaques. L'étude effectuée sur la DM1 a révélé une réduction de la CV chez les patients DM1-1300, ainsi qu'une augmentation des TRise comparativement au CTRL. La DM1 altère l'excitabilité des cardiomyocytes, probablement en affectant le fonctionnement des différents canaux ioniques et jonctions intercellulaires indispensables à la conduction cardiaque. / Optical mapping is an imaging technique widely used to measure membrane potential of excitable tissues with high spatial and temporal resolution and in a non-invasive manner using voltage sensitive dyes (VSD). Recently, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been introduced and adopted by several laboratories as a powerful model to study many diseases affecting inaccessible tissues. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an incurable hereditary neuromuscular disease that affects several organs, including the heart. In this project, monolayers of hiPSC-derived cardiomyocytes were generated from a healthy individual (CTRL) and from two DM1 patients (DM1-1300 and DM1-300), in order to study the cardiac manifestations of DM1. The hiPSC-CM monolayers were loaded with the VSD di-4-ANEPPS, and the membrane potential was then mapped using a high spatial and temporal resolution epifluorescence macroscope. Isochronal activation maps were generated. The action potential durations (APD₉₀, ₅₀), the conduction velocities (CV) as well as the depolarization rise times (TRise) were measured. In addition, several known drugs were tested in order to validate the results obtained using our optical mapping system, as well as the reliability of our in vitro model. We were able to produce a cardiac tissue that has demonstrated the same characteristics as native cardiomyocytes to different drug tests. This in vitro model has proven to be an excellent candidate for future studies on the electrophysiological and pharmacological properties of the heart. The optical mapping of DM1 cardiomyocytes monolayers has revealed a reduction of CV in hiPSC-CM DM1-1300, as well as a prolonged TRise compared to CTRL. DM1 appears to alter the excitability of cardiomyocytes probably by affecting the functioning of various ion channels and gap junctions involved in the cardiac conduction.

Les techniques de fluorescence sont très puissantes pour l'étude des processus biologiques. Les applications de ces techniques requièrent une amélioration constante des sondes fluorescentes, avec un intérêt particulier pour les sondes sensibles à l'environnement. Le but de ce travail était de caractériser et d'appliquer de nouvelles sondes fluorescentes pour l'étude des biomembranes. A cet effet, deux familles de sondes ont été pris en compte. La première famille (F2N12S, F46NS et F66NS) est basée sur le fluorophore 3- hydroxyflavone, qui est caractérisé par une émission duale due à une réaction de transfert de proton à l'état excité. Ces sondes permettent la caractérisation des propriétés de leur environnement par le rapport d'intensité de leurs deux bandes (N*/T*). La seconde famille est basée sur le fluorophore hautement solvatochromique Rouge Nil (NR12S), présentant une seule bande d'émission permettant une mesure ratiométrique à partir des deux bords du spectre. Les propriétés de ces sondes ont été caractérisées dans des modèles lipidiques, puis dans ses membranes plasmiques de cellules eucaryotes vivantes en utilisant diverses techniques de fluorescence (la spectroscopie de fluorescence, la microscopie et la cytométrie de flux). Par la suite, ces sondes ont été utilisées pour l'étude de l'ordre lipidique membranaire en réponse à divers stimuli. Ces sondes sont capables de mettre en évidence et suivre les changements de la membrane plasmique de la cellule au cours de l'apoptose. En outre, nous avons mis au point une nouvelle application de la sonde NR12S, qui est lesuivi de l'ordre lipidique des compartiments endocytaires au cours de la maturation des endosomes. Par conséquent, les sondes fluorescentes membranaires décrites apparaissent comme de bons outils pour caractériser les propriétés physico-chimiques de la membrane et la relation entre la phase lipidique et les phénomènes physiologiques comme l'apoptose et l'endocytose.

Les travaux de cette thèse portent sur l'élaboration et l'étude de sondes fluorescentes construites autour d'un squelette iminophénol, permettant ainsi d'accéder à un panel de composés absorbants et émettant sur une large gamme spectrale {UV, visible, proche infrarouge) et présentant des propriétés optiques remarquables : des coefficients d'absorption importants,des rendements quantiques élevés et de grands déplacements de Stockes. Des voies synthétiques simples et efficaces ont permis la constitution d'un catalogue de fluorophores modulables sur une large gamme du spectre électromagnétique. En particulier, la fluorescence liée à un phénomène de transfert de proton intramoléculaire dans l'état excité {ESIPT) a fait l'objet d'une grande partie des travaux. Une autre partie conséquente de ce travail de thèse concerne la synthèse et l'étude de complexes de bore luminescents. Les ligands sont rigidifiés par un atome de bore trivalent de configuration tétraédrique, ce qui permet une modulation des propriétés optiques des composés ainsi qu'une augmentation du rendement quantique de fluorescence. / Projects of this thesis focus on development and photophysical studies of new fluorescent probes built around an iminophenol skeleton, providing access to a panel of compounds absorbing and emitting over a broad spectral range {UV, visible, near infrared) and having excellent optical properties: significant absorption coefficients, high quantum yields and large Stokes shifts. Simple and efficient synthetic routes allowed the creation of a catalog of fluorophores emitting on a wide range of the electromagnetic spectrum. The fine tuning of the absorption and emission wavelength of the fluorescent dyes were achieved by the substitution of different electro-attracting or -donating groups. ln particular, fluorescence due to an excited state intramolecular proton transfer process {ESIPT) has been studied. Syntheses and studies of boron complexes have also been achieved. Ligands are coordinated to a trivalent boron fragment, allowing a modulation of the optical properties and leading to highly luminescent B{lll) complexes.

Ces travaux de thèse concernent la synthèse et l’étude des propriétés optiques de fluorophores organiques appliqués à la détection de deux biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer : la protéine kinase C (PKC) et les fibrilles de peptides amyloïdes Aβ42. La détection de la PKC est réalisée à l’aide de dyades comprenant un émetteur de type boradiazaindacène (BODIPY) relié de manière covalente à un inhibiteur de cette enzyme. Ces composés obtenus via une synthèse multi-étape présentent des coefficients d’absorption molaires et des rendements quantiques de fluorescence en solution importants. Ces sondes ont ensuite été utilisées en cytométrie de flux par la société Amoneta Diagnostics afin de détecter la PKC en surface des globules rouges et d’évaluer le potentiel de ces sondes dans le diagnostic de la maladie d’Alzheimer par test sanguin. Pour la détection des fibrilles de peptides amyloïdes, deux séries de fluorophores de la famille des 2-(2’-hydroxyphényl)-benzoxazoles ont été étudiées. Ces molécules présentent un phénomène de transfert de proton intramoléculaire à l’état excité (ESIPT) qui leur confère des propriétés optiques remarquables, telles que d’importants déplacements de Stokes et une émission duale. Enfin, un test de détection in vitro a été mis au point. Une interaction entre ces fluorophores et les fibrilles amyloïdes a pu être observée permettant la détection de ces peptides en solution. / This research concerns the synthesis and photophysical studies of organic fluorescent probes applied to the detection of two Alzheimer’s disease biomarkers: the protein kinase C and fibrils of amyloid Aβ42 peptides. PKC detection is achieved by dyads composed of boradiazaindacene dye (BODIPY) covalently linked to an inhibitor of this enzyme. These compounds afforded by a multistep synthesis display high molar absorption coefficients and quantum yields in solution. These probes were then used in flow cytometry by Amoneta Diagnostics to detect PKC on the surface of red blood cells in order to asses the potential of these molecules for the diagnostic of Alzheimer’s disease by blood test. Two series of fluorophores from the 2-(2’-hydroxyphenyl)-benzazole family have been studied for the detection of amyloid fibrils. These molecules display an excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) phenomenon which confer them remarkable optical properties such as important Stokes shifts and dual emission. Finally, an in vitro detection test has been developed. Interactions between these dyes and amyloid fibrils has been observed, allowing the detection of these peptides in solution.

Les techniques de fluorescence sont très puissantes pour l'étude des processus biologiques. Les applications de ces techniques requièrent une amélioration constante des sondes fluorescentes, avec un intérêt particulier pour les sondes sensibles à l’environnement. Le but de ce travail était de caractériser et d'appliquer de nouvelles sondes fluorescentes pour l’étude des biomembranes. A cet effet, deux familles de sondes ont été pris en compte. La première famille (F2N12S, F46NS et F66NS) est basée sur le fluorophore 3- hydroxyflavone, qui est caractérisé par une émission duale due à une réaction de transfert de proton à l’état excité. Ces sondes permettent la caractérisation des propriétés de leur environnement par le rapport d’intensité de leurs deux bandes (N*/T*). La seconde famille est basée sur le fluorophore hautement solvatochromique Rouge Nil (NR12S), présentant une seule bande d'émission permettant une mesure ratiométrique à partir des deux bords du spectre. Les propriétés de ces sondes ont été caractérisées dans des modèles lipidiques, puis dans ses membranes plasmiques de cellules eucaryotes vivantes en utilisant diverses techniques de fluorescence (la spectroscopie de fluorescence, la microscopie et la cytométrie de flux). Par la suite, ces sondes ont été utilisées pour l’étude de l’ordre lipidique membranaire en réponse à divers stimuli. Ces sondes sont capables de mettre en évidence et suivre les changements de la membrane plasmique de la cellule au cours de l'apoptose. En outre, nous avons mis au point une nouvelle application de la sonde NR12S, qui est lesuivi de l’ordre lipidique des compartiments endocytaires au cours de la maturation des endosomes. Par conséquent, les sondes fluorescentes membranaires décrites apparaissent comme de bons outils pour caractériser les propriétés physico-chimiques de la membrane et la relation entre la phase lipidique et les phénomènes physiologiques comme l'apoptose et l'endocytose. / Fluorescence techniques are powerful tools for studying biological processes. Therefore, the need for improved fluorescent probes used with these techniques continuously increases. The task of the present work was to characterize and to apply new fluorescent probes for biomembrane studies. For this purpose, two families of environment-sensitive probes have been considered. The first family is based on the 3-hydroxyflavone fluorophore (F2N12S, F46NS and F66NS). These dyes undergo an excited state intramolecular proton transfer reaction leading to their dual emission, highly sensitive to the environment. These probes allow the characterization of their environment properties through the ratio of intensities of their two bands (N*/T*) and present improved properties compared to F2N12S. The second family is based on the highly solvatochromic Nile Red fluorophore, exhibiting one emission band allowing a ratiometric measurement between its blue- and red-parts. We focused on one representative probe NR12S, which is a close structural analogue of F2N12S. The probe properties were characterized in lipid models, and in plasma membranes of living cells using a variety of fluorescence techniques (fluorescence spectroscopy, microscopy and flow cytometry). NR12S was then applied to study the lipid order in cell plasma membranes and its changes in response to several stimuli. Interestingly, this probes can evidence and monitor changes in the cell plasma membrane during apoptosis. Moreover, one novel application of the fluorescent membrane probe NR12S was the monitoring of lipid order in endocytic compartments during the maturation of endosomes. Thus, the described fluorescent membrane probes appear as powerful tools to determine the physico-chemical properties of the membrane and the relationship between lipid phase and physiological phenomena, such as apoptosis and endocytosis.

Le développement de sondes moléculaires fluorescentes pour le suivi ex vivo de phénomènes biologiques (communication nerveuse, par exemple) est en plein essor. Dans cette optique, des dérivés fluorescents de cyclotrivératrylènes (CTV), cavitands propices à la complexation de petites molécules organiques, ont été synthétisés. La stratégie utilisée consiste à introduire des groupements électro-donneurs et électro-attracteurs conjugués sur chaque unité aromatique du CTV afin d’avoir des systèmes de type « push-pull ». L’extension de la conjugaison entre les groupements électro-attracteurs et électro-donneurs a été envisagée afin d’améliorer les propriétés spectroscopiques des sondes. Des réactions de couplage organométallique de Sonogashira, ainsi que des cycloadditions alcynes-azotures catalysées par le cuivre (CuAAc), ont été conduites sur le squelette CTV dans ce but. La caractérisation spectroscopique des différentes sondes fluorescentes développées a été réalisée en milieu organique et en conditions physiologiques, pour celles dont la solubilité le permettait. L’étude des propriétés de reconnaissance de ces dernières, pour des ammoniums d’intérêt biologique (tels que les neurotransmetteurs, acétylcholine, dopamine et dérivés) en conditions physiologiques, a également été menée par spectrofluorimétrie, ainsi que par d’autres techniques (RMN, calorimétrie). La formation d’assemblages moléculaires en milieu aqueux a également été mise en évidence (expériences de diffusion dynamique de la lumière, microscopie électronique en transmission), pour certaines sondes lors de ce travail. / The development of fluorescent probes for the ex vivo detection of biological phenomena (neuronal communication, for example) presents a growing interest. In this context, fluorescent cyclotriveratrylene (CTV) derivatives have been developed, as these cavitands are known to complex small organic molecules. The strategy used to get interesting spectroscopic properties, was to introduce conjugated electron-donating and electron-withdrawing groups on each aromatic unit of the CTV (leading to “push-pull” systems). To improve the spectroscopic properties of the probes, the conjugation between the electron-donating and the electron-withdrawing groups was extended. Hence, the Sonogashira organometalic coupling reaction and the copper catalyzed cycloaddition directly on CTV skeleton were used. The spectroscopic characterization of the new fluorescent probes synthesized was done, in organic solvent but also in physiological conditions when the solubility permits it. The recognition studies for biological ammoniums, such as neurotransmitters (acetylcholine, dopamine, and derivatives) were performed in physiological conditions by spectrofluorimetry but also other methods (like MNR or micro-calorimetry). The formation of molecular assemblies was also observed (by dynamic light scattering and transmission electron microscopy) during this work with some of the probes.

Dans le système nerveux central, le principal effecteur de la voie de transduction de l'AMPc<br />est la protéine kinase activée par l'AMPc (PKA). L'activation de la PKA est impliquée dans de<br />nombreux processus comme la modulation de l'excitabilité neuronale par phosphorylation de<br />canaux ioniques, de l'homéostasie cellulaire par phosphorylation de cibles cytosoliques et de la<br />régulation génique par phosphorylation de facteurs de transcription. La régulation de l'activité de la<br />PKA ainsi que son activation spatiale et temporelle sont des paramètres indispensables à la<br />compréhension des mécanismes cellulaires à l'origine des effets de cette voie de seconds messagers.<br />Faute d'approches méthodologiques adaptées, très peu d'études se sont intéressées à la dynamique<br />spatiale et temporelle, à la spécificité et à la régulation de l'activité de la PKA dans les neurones.<br />Grâce aux sondes fluorescentes codées génétiquement, il est possible maintenant d'avoir<br />accès à ces paramètres. A l'aide d'un vecteur viral, nous avons fait exprimer une sonde sensible à<br />l'activité PKA (sonde AKAR pour A-kinase activity reporter) dans des préparations de neurones en<br />tranches. Cette sonde utilise le principe du transfert d'énergie par résonance (FRET) et permet de<br />mesurer par imagerie ratiométrique l'activité kinase de la PKA. Nous avons montré que la sonde<br />AKAR2, exprimée dans les neurones, modifie son spectre d'émission en réponse à une stimulation<br />de la voie AMPc. L'utilisation d'une sonde mutante, dont le site de phosphorylation a été modifié,<br />démontre que les changements observés dans le spectre d'émission de la sonde AKAR2 sont bien<br />attribuables à une phosphorylation.<br />Dans une première partie, nous avons étudié la phosphorylation de protéines cibles de la<br />PKA dans différents compartiments subcellulaires en réponse à différentes stimulations<br />extracellulaires. La phosphorylation de la sonde AKAR2, nous a permis de suivre en temps réel<br />l'activité de la PKA dans le cytosol. Afin de mesurer l'activité de la PKA dans le noyau, nous avons<br />adressé la sonde AKAR2 en utilisant un signal de localisation nucléaire (NLS). Enfin, la mesure de<br />l'activité de la PKA à la membrane a été réalisée grâce à l'étude de la phosphorylation des canaux<br />responsables du courant de l'AHP lente (IsAHP). Nous avons montré que la phosphorylation des<br />canaux ioniques est plus rapide que la phosphorylation des cibles cytosoliques, elles-mêmes plus<br />rapide que la phosphorylation des protéines nucléaires. De plus, nous avons montré que l'activité de<br />la PKA stimulée par l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est différente de<br />l'activation directe des adénylyl cyclases (AC). En effet, l'activation de la PKA résultant de la<br />stimulation des RCPG produit des amplitudes de phosphorylation plus faible de la sonde AKAR2<br />dans le cytosol et le noyau.<br />Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle des phosphodiestérases de type 4<br />(PDE4) dans la régulation des réponses β-adrénergiques. L'inhibition des PDE4 produit une<br />activation de la PKA dans les neurones traduisant ainsi une activité tonique des AC. Nous montrons<br />également que l'inhibition des PDE4 permet de potentialiser l'activité de la PKA en réponse à de<br />faibles concentrations d'agonistes β adrénergiques. Cette famille de PDEs, en dégradant l'AMPc,<br />participe donc à la régulation et la propagation des signaux PKA dans les neurones.<br />Enfin, au cours de ma thèse, je me suis également intéressé au γ-hydroxybutyrate (GHB)<br />composé qui est utilisé pour soigner certains troubles du sommeil et provoque chez le rat<br />l'apparition de signes comportementaux et de tracés encéphalographiques similaires à ceux observés<br />chez l'humain lors de crises d'épilepsie de type absence. L'ensemble de ces effets du GHB passe<br />probablement par une action sur la boucle thalamocorticale mais les mécanismes cellulaires à leurs<br />origines sont inconnus. Nous avons montré grâce à l'utilisation d'enregistrements<br />électrophysiologiques, que les courants post-synaptiques inhibiteurs sont beaucoup moins sensibles<br />au GHB que les courants post-synaptiques excitateurs et les courants potassiques à rectification<br />entrante (GIRK). Cette différence de sensibilité serait à l'origine d'un déséquilibre de la balance<br />excitation/inhibition reçue par les neurones thalamocorticaux ce qui participerait à la genèse d'une<br />activité oscillante du potentiel membranaire de ces neurones.

Les travaux réalisés dans le cadre de la thèse avaient pour but la synthèse de nouveaux fluorophores basés sur les unités BODIPYs et hydroxyphényl-s-triazines. Pour être utilisées comme sondes efficaces dans des applications en chimie et en biologie, les chromophores doivent présenter une forte brillance et des rendements quantiques de fluorescence élevés, une modulation aisée de ses propriétés optiques ainsi qu'une bonne stabilité chimique et photochimique. Une stratégie originale et efficace a été développée pour l'obtention de dérivés d'o-hydroxyphényl-s-triazine. Ces derniers présentent des déplacements de Stokes anormalement élevés ayant pour origine un transfert de proton intramoléculaire ultrarapide à l'état excité (ESIPT). L'extension du système π-conjugué sur les différentes plateformes de départ a été réalisée par couplages pallado-catalysés et/ou condensation de Knoevenagel, permettant ainsi d'accéder à une large gamme spectrale en absorption et en émission. Le développement d'une nouvelle voie de synthèse à permis l'obtention d'oligo-BODIPYs par couplage oxydant réalisé en associant PIFA et un acide de Lewis. Toutes les propriétés photophysiques des nouvelles sondes ont été étudiées et ont fait l'objet de discussions détaillées.