Les boîtes quantiques (ou Quantum Dots en anglais - QD) sont une nouvelle génération de sondes polyvalentes pour la biologie, en particulier pour l’imagerie. Pour des applications de marquage des voies intra-cellulaires, les QDs peuvent être conjugués à des biomolécules telles que des acides nucléiques ou des protéines. En partant des travaux du LPEM portant sur le développement de ligands permettant la dispersion des QDs dans l’eau et leur fonctionnalisation, une nouvelle méthode de conjugaison de l'ADN sur les QDs a été développée dans cette thèse. Cette méthode utilise les motifs présents sur les polymères des QDs pour le greffage d'ADN. Les paramètres affectant cette réaction ont été étudiés et cette stratégie de couplage a été étendue à d'autres nanoparticules et biomolécules. En partant de ces QDs-ADN, des protéines modifiées ADN ont pu être attachées aux QDs en utilisant le principe d’hybridation de l’ADN. Les propriétés des conjugués ainsi générés ont été mises en évidence en utilisant la Transferrine (QD-ADN-Tf) et ces complexes ont été étudiés in vitro et in cellulo. Ces conjugués ont ensuite été utilisés pour le suivi de la dynamique des endosomes, exploitant ainsi pleinement le potentiel des QDs pour l’imagerie directe. Dans la dernière partie, des études supplémentaires sur les facteurs influençant la «performance biologique» des QDs ont été réalisées. Pour cela, une large gamme de ligands polymères développée par le groupe a été utilisée pour sonder l'interaction de la surface des QDs avec l'interface biologique. Des expériences biochimiques et cellulaires ont permis de démontrer que les QDs revêtus de divers polymères ont des comportements différents. / Quantum dots (QD) are new generation of versatile probes for biology, particularly for bioimaging. For specific applications, QDs are conjugated to biomolecules such as nucleic acid or proteins and subsequently targeted to unique intra-cellular pathways. Building upon the state-of-the-art ligands for water-dispersible QDs developed by the lab, a novel and highly generalizable method to conjugate DNA to QD is developed in this thesis. This method employs thiols present on polymers on QDs for conjugation to maleimide-functionalized DNA. Extensive characterization of parameters affecting this reaction is carried out and the strategy is extended to other nanoparticles and biomolecules. Following this, a novel method to conjugate proteins to QD via DNA hybridization is discussed. Using a model protein Transferrin (Tf), the unique properties of thus generated QD-DNA-Tf conjugates are studied in-vitro and in-cellulo. These conjugates are subsequently used for tracking endosomal dynamics for up-to 20 minutes, exploiting the fullest potential of QDs for live imaging. In the last part, additional studies on factors affecting the ‘biological performance’ of QDs are carried out. Using a range of highly adaptable polymeric ligands developed by the group, interactions of surface-modified QDs with the biological interface are probed. Systematic biochemical and cellular experiments demonstrate that QDs coated with zwitterionic polymers have superior antifouling properties compared to poly(ethylene glycol)-based polymers and stability in diverse biological contexts.

Alors que les synapses sont des structures relativement stables, les éléments qui la composent sont, eux, en permanent échange dans le temps et dans l'espace. Les composants des densités postsynaptiques sont renouvelés avec des cinétiques caractéristiques de chaque molécule et de chaque sous compartiment synaptique. La compatibilité entre le comportement dynamique des composants de la synapse et son maintien structural et fonctionnel à long terme implique une conception de ces assemblages multimoléculaires en équilibre dynamique. De nombreux paramètres peuvent influencer la dynamique des récepteurs aux neurotransmetteurs (RNT) dans les synapses, y compris l'activité synaptique et les protéines de la matrice extracellulaire. Cependant, le rôle des cellules gliales dans ce mécanisme est inconnu. Mon travail de thèse a porté sur l'exploration d'une possible contribution de la microglie, les cellules immunitaires du système nerveux central, à la stabilité des RNT et à l'efficacité des synapses inhibitrices de la moelle épinière. Mon travail de thèse démontre pour la première fois comment et en quoi la microglie est un partenaire clé de l'équilibre dynamique qui régit la structure et la fonction de la synapse inhibitrice dans la moelle. Par conséquent, il donne un éclairage nouveau sur la façon de concevoir l'efficacité synaptique et sa régulation de façon non neurone autonome. / Whereas synapses are relatively stable structures, their molecular constituents are continuously recycled and exchanged in time and space. Each of the molecules that contribute to build synaptic structures is renewed with specific kinetics, depending on their organisation in the postsynaptic densities. The compatibility between a dynamic behaviour and a long-term maintenance of synapses implies to think synapses as multi-molecular assemblies in a dynamic equilibrium. Several parameters can influence the dynamics of receptors to neurotransmitters(RNT) at synaptic sites, including neuronal activity and extracellular matrix proteins. However,the role of glial cells in this mechanism is unknown. During my thesis work, I explored the roleof microglia, the resident immune cells of the central nervous system, on the lateral diffusion ofRNT and synaptic efficacy at spinal cord inhibitory postsynaptic densities. My work demonstrates for the first time a partnership between microglia and synapses. It shows that immune cells can take part to the regulation of synaptic strength very rapidly but also at basal state, by regulating RNT dynamics. Furthermore it identifies microglia as a key partner for a heterocellular stabilization of synaptic receptors. This work raises the intriguing possibility that the general regulation of network activity may also be explained by a fine modulation of receptors stability at the synapse controlled by microglia.

La microscopie optique est un outil indispensable pour la recherche de la neurobiologie et médecine qui permet l’étude des cellules dans leur environnement natif. Les processus sous-cellulaires restent néanmoins cachés derrière les limites de la résolution optique, ce qui rend la résolution des structures plus petites que ~300nm impossible. Récemment, les techniques de la localisation des molécules individuelles (SML) ont permis le suivi des protéines de l’échelle nanométrique grâce à l’ajustement des molécules uniques à la réponse impulsionnelle du système optique. Ce processus dépend de la quantité de lumière recueilli et rend ces techniques très sensibles aux imperfections de la voie d’imagerie, nommé des aberrations, qui limitent l’application de SML aux cultures cellulaires sur les lamelles de verre. Un système commercial d’optiques adaptatives est implémenté pour compenser les aberrations du microscope, et un flux de travail est défini pour corriger les aberrations dépendant de la profondeur qui rend la 3D SML possible dans les milieux biologiques complexes. Une nouvelle méthode de SML est présentée qui utilise deux objectifs pour détecter le spectre d’émission des molécules individuelles pour des applications du suivi des particules uniques dans 5 dimensions (x,y,z,t,λ) sans compromis ni de la résolution spatiotemporelle ni du champ de vue. Pour faciliter les analyses de manière quantitative des Go de données générés, le développement des outils biochimiques, numériques et optiques est présenté. Ensemble, ces approches ont le but d’amener l’imagerie quantitative des molécules uniques dans les échantillons biologiques complexes / Optical microscopy is an indispensable tool for research in neurobiology and medicine, enabling studies of cells in their native environment. However, subcellular processes remain hidden behind the resolution limits of diffraction-limited optics which makes structures smaller than ~300nm impossible to resolve. Recently, single molecule localization (SML) and tracking has revolutionized the field, giving nanometer-scale insight into protein organization and dynamics by fitting individual fluorescent molecules to the known point spread function of the optical imaging system. This fitting process depends critically on the amount of collected light and renders SML techniques extremely sensitive to imperfections in the imaging path, called aberrations, that have limited SML to cell cultures on glass coverslips. A commercially available adaptive optics system is implemented to compensate for aberrations inherent to the microscope, and a workflow is defined for depth-dependent aberration correction that enables 3D SML in complex biological environments. A new SML technique is presented that employs a dual-objective approach to detect the emission spectrum of single molecules, enabling 5-dimensional single particle imaging and tracking (x,y,z,t,λ) without compromising spatiotemporal resolution or field of view. These acquisitions generate ~GBs of data, containing a wealth of information about the localization and environment of individual proteins. To facilitate quantitative acquisition and data analysis, the development of biochemical, software and hardware tools are presented. Together, these approaches aim to enable quantitative SML in complex biological samples.

L’identification de biomarqueurs des maladies mentales telles que l’autisme, la schizophrénie ou la maladie d’Alzheimer, est d’une importance capitale non seulement pour établir un diagnostic objectif, mais aussi pour suivre l’effet des traitements. La création et le maintien de fonctions neuronales sub-cellulaires, telle que la plasticité synaptique, sont fortement dépendants du transport intraneuronal, essentiel pour acheminer d’importants composants à des positions spécifiques. Un transport actif défaillant semble être partiellement responsable d’anomalies de la plasticité synaptique et de la morphologie neuronale présentes dans de nombreuses maladies neuropsychiatriques. Cette thèse décrit (i) la mise au point d’une méthode de quantification du transport intraneuronal reposant sur le suivi de nanoparticules de diamants fluorescents (fNDs); (ii) l’application de cette technique simple et faiblement invasive à l’analyse fonctionnelle de variants génétiques associés à des maladies neuropsychiatriques. Ce manuscrit comporte quatre chapitres. Le premier détaille l’architecture polygénique complexe des maladies mentales et démontre la pertinence d’étudier le transport intraneuronal. Les deuxième et troisième chapitres sont dédiés à la méthode et détaillent les stratégies d’internalisation des fNDs, les outils de quantification du transport intraneuronal et la validation de la technique. La forte brillance, la photo-stabilité parfaite et l’absence de toxicité cellulaire font des fNDs un outil de choix pour étudier la dynamique du transport intraneuronal sur une durée d’observation de plusieurs heures avec une haute résolution spatiotemporelle et une bonne puissance statistique. Enfin, dans le quatrième chapitre, nous appliquons cette nouvelle méthode d’analyse fonctionnelle pour étudier l’effet de variants génétiques associés à l’autisme et à la schizophrénie. Pour cela, nous utilisons des lignées de souris transgéniques ayant une faible surexpression des gènes MARK1 et SLC25A12, ainsi que des AAV-shRNA pour induire une haplo-insuffisance du gène AUTS2. Notre méthode de diagnostic moléculaire s’avère suffisamment sensible pour déceler des variations fines de la dynamique du transport intraneuronal, ouvrant la voie à de futurs développements en nanomédecine translationnelle. / The identification of molecular biomarkers of brain diseases as diverse as autism, schizophrenia and Alzheimer’s disease, is of crucial importance not only for an objective diagnosis but also to monitor response to treatments. The establishment and maintenance of sub-cellular neuronal functions, such as synaptic plasticity, are highly dependent on intracellular transport, which is essential to deliver important materials to specific locations. Abnormalities in such active transport are thought to be partly responsible for synaptic plasticity and neuronal morphology impairment found in many neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. This thesis reports (i) the development of a quantification technic of intraneuronal transport based on fluorescent nanodiamonds (fNDs) tracking; (ii) the application of this simple and minimally invasive approach to the functional analysis of neuropsychiatric disease-related genetic variants.This manuscript falls into four chapters. The first one details the complex polygenic architecture of mental disorders and demonstrates the disease relevance of monitoring the intraneuronal transport. The second and the third chapters are dedicated to the nanodiamond-tracking assay and describe the fNDs internalisation strategies, the spatiotemporal quantitative readouts and the validation of the technic. The high brightness, the perfect photostability and the absence of cytotoxicity make fNDs a tool of choice to perform high throughput long-term bioimaging at high spatiotemporal resolution. Finally, in the fourth chapter, we apply this new functional analysis method to study the effect of genetic variants associated to autism and schizophrenia. We established transgenic mouse lines in which MARK1 and SLC25A12 genes were slightly overexpressed, and AAV-shRNA to induce AUTS2 gene haploinsufficiency. Our molecular diagnosis assay proves sufficiently sensitive to detect fine changes in intraneuronal transport dynamic, paving the way for future development in translational nanomedicine.

Au cours de ce travail de thèse expérimental, nous nous sommes intéressés à l’étude de la localisation nucléaire et nucléolaire de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Des études antérieures menées au laboratoire avaient mis en évidence une très forte accumulation de la NC dans les nucléoles. Ce compartiment nucléaire est connu pour être ciblé par de nombreux virus afin de promouvoir leur réplication. Des expériences de microscopie électronique avaient révélé la structure complexe du nucléole et montré qu’il est composé de trois sous-compartiments : les centres fibrillaires, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire dans lesquels se déroule la synthèse des ribosomes. Afin de caractériser la localisation de la NC dans ces trois sous-compartiments, nous avons développé une approche de microscopie optique à haute résolution permettant d’obtenir des images à deux couleurs avec une résolution spatiale améliorée. Pour cela, nous avons mis au point un protocole qui permet d’utiliser simultanément une protéine fluorescente photocommutable et un fluorophore organique introduit par immunomarquage. Après avoir minimisé les aberrations optiques et corrigé les dérives mécaniques inhérentes au montage, nous avons visualisé simultanément la localisation de la NC surexprimée dans des cellules HeLa avec des marqueurs spécifiques des trois sous-compartiments nucléolaires (immunomarquage). La microscopie de fluorescence à haute résolution a permis de résoudre pour la première fois les différents compartiments et de montrer que la NC se localise préférentiellement dans le compartiment granulaire. Finalement, des expériences préliminaires avec des cellules vivantes ont permis de mettre en évidence que la NC est transportée de manière active dans le noyau et qu’elle pourrait interagir directement avec des protéines nucléolaires / During this experimental thesis work, we investigated the nuclear and nucleolar localization of the nucleocapsid protein (NC) of HIV-1. Previous studies performed in our laboratory evidenced a strong accumulation of NC in a subnuclear structure called nucleolus. Playing role in multiple cellular processes, nucleolus is often targeted by viruses to promote their replication. Electron microscopy revealed three nucleolar components (fibrillar centers, dense fibrillar component and granular component) associated to specific steps of the ribosome biogenesis. To characterize the distribution of the NC in these three sub-compartments and therefore shed light on the nucleolar localization of NC during the replication cycle, we developed a high-resolution optical microscopy approach. After having minimized the optical aberrations and corrected the mechanical drifts inherent to the imaging setup, the NC-mEos2 fusion protein overexpressed in HeLa cells was visualized simultaneously with immunolabeled nucleolar markers. The use of high-resolution fluorescence microscopy enabled us to resolve for the first time the three nucleolar compartments and to demonstrate the preferential localization of NC in the granular compartment of nucleolus. Finally, preliminary experiments performed with living cells showed that NC is actively transported in the nucleus and therefore may interact directly with nucleolar proteins.

La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.

Les récepteurs glutamatergiques de type N-Méthyl-D-Aspartate (RNMDA) jouent un rôle majeur dans de nombreux processus physiologiques, et leur implication dans la physiopathologie de certains troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie est suggérée par un robuste faisceau de données cliniques et précliniques. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à une telle dérégulation des RNMDA restent inexpliqués. La diffusion membranaire, mécanisme de contrôle spatial et temporel de la distribution des RNMDA à la surface des neurones, constitue un puissant régulateur de la transmission synaptique. Mon projet de thèse repose ainsi sur l’hypothèse originale qu’une altération de la diffusion de surface des RNMDA jouerait un rôle central dans l’émergence de troubles psychotiques. Afin d‘explorer cette piste, j’ai étudié l’impact de molécules aux propriétés psychomimétiques (i.e induisant un état psychotique) sur la diffusion de surface des RNMDA. Les résultats obtenus au cours de ma thèse démontrent que des molécules psychomimétiques, aux modes d’action distincts (antagonistes du RNMDA et autoanticorps anti-RNMDA), perturbent la diffusion membranaire ainsi que la localisation synaptique des RNMDA, conduisant à terme à des défauts de transmission glutamatergique. Mon travail de thèse propose donc qu’un défaut de diffusion membranaire des RNMDA conduirait à des altérations fonctionnelles pouvant contribuer à l’émergence de troubles psychotiques. L’ensemble de mon travail apporte ainsi un regard nouveau sur la mécanistique des troubles psychotiques et ouvre la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques. / Glutamatergic N-Methyl-D-Aspartate receptors (NMDAR) play a key role in many physiological processes, and their implication in the pathophysiology of several neuropsychiatric disorders is now well established. Multiple lines of evidence converge towards a dysregulation of the NMDAR in psychotic disorders such as schizophrenia (SCZ). However, the molecular and cellular deficits underlying NMDAR dysfunction remain misunderstood. By tightly controlling NMDAR synaptic localization, surface trafficking represents a powerful regulator of synaptic transmission. Could an alteration of NMDAR surface trafficking underlie NMDAR dysfunction and contribute to the emergence of psychotic disorders? To tackle this question, my PhD project aimed at investigating the impact of different psychotomimetic molecules on NMDAR surface trafficking. In the first part of my project, I explored the impact of NMDAR autoantibodies (NMDAR-Ab) from SCZ and healthy subjects. My results revealed that NMDAR-Ab from SCZ patients rapidly disturb NMDAR synaptic trafficking and distribution, through a loss of NMDAR-EphrinB2 receptor interaction, eventually preventing the induction of synaptic plasticity. In the second part of my PhD project, I showed that psychotomimetic NMDAR antagonists also alter NMDAR synaptic mobility and localization. Downregulation of PSD proteins expression prevented NMDAR antagonists-induced deficits, suggesting that such alterations ensue from modifications of NMDAR intracellular interactions. Taken together, these results demonstrate that psychotomimetic molecules profoundly impact NMDAR surface trafficking, supporting a pathogenic role of this unsuspected process in the emergence of psychotic symptoms.