Les émulsions laitières sont des systèmes thermodynamiquement instables qui doivent résister aux contraintes technologiques (chauffage, congélation) appliquées lors de leur fabrication ou usage. Les émulsions riches en protéines de lactosérum sont particulièrement sensibles et l’emploi d’additifs alimentaires est un moyen de ralentir leur déstabilisation. Dans l’objectif d’offrir des produits 100 % lait aux consommateurs, concevoir des émulsions, riches en protéines de lactosérum, sans additifs alimentaires et stables aux traitements technologiques, constitue un réel challenge. La stratégie employée dans ce projet de thèse a été de combiner les propriétés des agrégats de protéines de lactosérum et des caséines pour stabiliser des émulsions aux cours des traitements technologiques sur une large gamme de concentration.Des émulsions ont été préparées avec des agrégats de protéines de lactosérum de structure différente et avec différents ratios agrégats/caséines. Quelle que soit leur structure, la présence d’agrégats à la surface des globules gras déstabilise l’émulsion (gélification /séparation de phase) alors que dans la phase dispersante ceux-ci sont stables aux traitements technologiques. A l’inverse, les émulsions dont la surface des globules gras est recouverte de caséines sont très stables aux traitements technologiques. Ainsi, il est possible de moduler la stabilité des émulsions riches en protéines de lactosérum aux cours des traitements technologiques en exploitant les propriétés des agrégats et des caséines et en contrôlant leur répartition entre la surface des glo / Dairy emulsions are thermodynamically unstable systems, which have to be resistant to the technological treatments (heating, freezing/thawing) applied during their manufacture or use. Whey protein-rich emulsions are particularly sensitive to technological treatments and instabilities are currently tackled by the use of non-dairy additives. With aim to offer products that are more natural to consumers (additive-free), the preparation of whey protein-rich emulsions without additive and stable during technological treatments constitutes a major challenge for dairy companies. The strategy adopted during this thesis was to combine the properties of the whey proteins aggregates and caseins in order to stabilize emulsion during technological treatments in a large range of protein concentrationsEmulsions were prepared with various whey protein aggregates and various whey protein aggregates/caseins ratio. Whatever the whey protein aggregates, their presence at the fat droplet surface destabilize the emulsions (gelation/phase separation) whereas they are stable in the continuous phase of the emulsions during technological treatments. In contrast, emulsions are extremely stable during technological treatments when caseins fully cover the fat droplet surface. The results obtained highlighted the possibility of modulating the stability during technological treatments of whey protein-rich emulsions by combining the properties of the whey protein aggregates and the caseins and by controlling their repartition between the fat droplet surface and the continuous phase of the emulsion.

Dans le lait on peut distinguer les protéines sériques et les caséines. Les protéines sériques sont des protéines globulaires qui se trouvent dans le sérum du lait et elles sont connues pour leurs propriétés fonctionnelles exceptionnelles. Quand une solution de protéines sériques est chauffée, elles perdent leur structure native et peuvent s'agréger. Elles forment des agrégats de différentes formes, tailles et densités : des cylindres, des agrégats fractals, des microgels et des agrégats fibrillaires. De l'autre côté, les caséines sont organisées dans des micelles de caséine d'un rayon environ 100-200 nm stabilisées par du phosphate de calcium colloïdal.Au cours de ce travail, nous avons cherché à comprendre comment les agrégats de protéines sériques pouvaient être utilisés en mélange avec les micelles de caséine pour obtenir et contrôler la texture de produits laitiers. Dans un premier temps, nous avons étudié le processus de « cold gelation » induit par ajout de calcium et/ou acidification d'agrégats et de microgels de protéines sériques seuls. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la fonctionnalité des agrégats dans les mélanges plus complexes avec les autres protéines laitières et en présence de minéraux. L'addition de petites quantités d'agrégats fractals dans des suspensions de micelles diminuait leur température critique de gélification, augmentait le module élastique et diminuait la synérèse des gels.Les agrégats de protéines sériques peuvent être utilisés pour modifier la viscosité des mélanges, comme gélifiant ou pour enrichir la teneur en protéine du milieu sans en augmenter la viscosité. / The proteins of milk can be divided into whey proteins and caseins. Whey proteins are compact globular proteins that are found in the aqueous phase of milk. They are well-known for their exceptional functional properties. Upon heating, individual whey proteins denature and aggregate, forming aggregates of different morphologies and sizes, such as strands, fractal aggregates, microgels and fibrillar aggregates, depending on the heating conditions. On the other hand, the caseins in milk are organized in complex protein units with a diameter of 100-200 nm called casein micelles stabilized by colloidal calcium phosphate (CCP).The current work is an endeavor to understand how whey protein aggregates might be used in mixtures with other dairy proteins, such as casein micelles, in order to get a particular texture in a dairy product. We first extended the understanding of so-called “cold gelation” of pure WPI aggregates induced by calcium and acidification and then studied how the aggregates work in more complex mixtures of proteins and minerals. Interestingly, addition of small amounts of fractal aggregates to suspensions of casein micelles has been demonstrated to decrease the critical gelation temperature, increase the elastic modulus and decrease the syneresis of the gels.The aggregates are to be used to modify the viscosity of dairy products, as a gelling agent and for protein enrichment. The properties of strands, fractal aggregates and microgels have been studied and compared. WPI aggregates might be considered as “clean label” texturizing ingredients that do not require approval from the European Food Safety Authority (EFSA).

Les substrats structurés aux échelles micrométriques et nanométriques sont intéressants pour des applications biomédicales, par exemple dans des puces à ADN/protéines, pour la miniaturisation des « lab-on-chip » ou pour préparer des implants permettant le contrôle de l'adhésion de cellules. Dans la dernière décennie des études ont montrées, que les cellules vivantes peuvent détecter la présence de nano-structures sur les substrats sur lesquels elles adhèrent. Bien que ces mécanismes soient étudiés depuis une dizaine d'années, les mécanismes fondamentaux sont encore en cours d'études. Tant pour une étude au niveau fondamental que dans le but d'applications concrètes, il est important de développer des techniques simples pour structurer des substrats sur de grandes surfaces. Nous avons réalisé une nouvelle méthode alliant un faible coût de fabrication et la biocompatibilité pour structurer et biofonctionnaliser des substrats à l'échelle nanométrique en utilisant des membranes d'alumine poreuses comme masque. Les membranes d'alumine poreuses, préparées par électrochimie, sont naturellement organisées en un réseau hexagonal sur une surface de quelques cm². Nous les utilisons comme masque pour la structuration de surfaces. Des trous réguliers sont gravés dans le substrat à travers les membranes d'alumine poreuses. Ce substrat est ensuite utilisée lors d'une application biologique : une bicouche lipidique est déposée sur le substrat structuré pour imiter les hétérogénéités de la membrane cellulaire. La mobilité de la bicouche est étudiée par corrélation de spectroscopie de fluorescence à rayon variable. Une autre série d'expériences est faite en utilisant des membranes d'alumine poreuses comme masque d'évaporation pour créer des réseaux organisés d'îlots d'organo-silanes. Deux molécules sont utilisées elles possèdent soit une fonction amine réactive soit une longue chaîne carbonée inerte. La bio-fonctionnalisation est ensuite effectuée en utilisant la fonction amine pour accrocher un anticorps. Des études sont effectuées en parallèle, sur des substrats bio-fonctionnalisés à l'échelle micrométrique grâce au micro-contact printing. Le but de cette étude est de mettre au point une biochimie de surface permettant le contrôle de l'adhésion de cellules immunitaires, avec le but de transférer ensuite la biochimie à l'échelle nanométrique. / Substrates patterned at the micro-scale and nano-scale are interesting for biomedical applications, for example, in DNA/protein nano-arrays, for miniaturized lab-on-chip applications or for making smart implants that can control adhesion of cells. In the last decade, some studies showed that living cells can detect nano-scale structures on substrates to which they adhere. Although this behaviour has been observed now for over a decade, the fundamental detection mechanism is still under investigation. Both for fundamental studies and for applications, it is important to develop facile techniques to pattern substrates on a large scale. We have realized a novel technique for patterning and bio-functionalizing substrates at the nano-scale using porous anodic alumina membranes as masks. The ordered porous anodic alumina membranes, prepared by classical electro-chemistry, are naturally organized in an hexagonal array over surface area of few square centimeters. Here we use them as mask for surface patterning. To create an array of nano holes, the substrate is dry etched through the alumina pores. In a biologically relevant application, a lipid bilayer is deposited on the patterned substrate to mimic a heterogeneous cell membrane. The mobility of the bilayer is studied by fluorescent correlation spectroscopy. In a different set of experiments, the porous alumina membranes are used as evaporation mask to create an organized array of alkyl-silane islands - either with a short carbon chain and with a reactive amine group or with a long carbon chain and non-reactive. Afterwards, biochemical functionalization is achieved by exploiting the amino-function of the amino-silane to bind an antibody. In parallel, we have started some studies of adhesion on a pattern substrate at micro-scale with immunological cells. The substrate is pattern by micro contact printing and the cell adhesion is observed by RICM. The aim of this studies is to prepare the biochemistry for the immunological cells adhesion, with the aim or transferring this to the nano-scale.

Les Tunneling nanotubes (TNT) sont des protrusions cellulaires à base d'actine qui médient la communication cellulaire en transférant des cargos cellulaires. Les différents types de communication intercellulaires sont de plus en plus considérés comme des cibles potentielles pour le traitement de différentes maladies, telles que les maladies infectieuses liées aux virus et bactéries, les cancers ou les maladies neurodégénératives. Des études récentes ont mis en évidence un mécanisme de propagation d'agrégats protéiques ressemblant à la propagation du prion dans diverses maladies neurodégénératives non infectieuses telles que la maladie d'Alzheimer (AD), la démence frontotemporelle (FTD), la maladie de Parkinson (PD) et la maladie de Huntington. Ces maladies se caractérisent par l'accumulation de protéines mal repliées dans le cerveau des patients. Ainsi, on peut envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour bloquer la propagation des protéines anormales dans tout le cerveau. Il a été démontré que les TNT pourraient jouer un rôle essentiel dans la propagation des agrégats de prions au sein du système nerveux central (SNC) et périphérique. Par conséquent, l'étude du mécanisme de la formation de TNT pourrait fournir de nouvelles idées sur le mécanisme de propagation de la maladie et de nouvelles cibles thérapeutiques. L'objectif de ma thèse était d'étudier le rôle du transfert des agrégats de protéines par les TNT entre les cellules et d'étudier le mécanisme de formation des TNT. Dans notre laboratoire, nous avons déjà montré que les TNT permettent le transfert de prions entre les cellules. Dans la première partie de mon doctorat, j'ai confirmé que les transferts d'agrégats de prions entre les cellules de CAD neuronales se faisaient par les TNT à l'intérieur de vésicules endocytiques (Zhu et al., 2015). De plus, en collaboration avec un collègue, nous avons fourni des preuves que les agrégats de prions pourraient être transférés entre des astrocytes primaires et des neurones et que ce transfert était médié par un contact cellulaire (Victoria et al., 2016). J'ai également collaboré à une autre étude où nous avons montré que les agrégats d'α-synucléine (caractéristiques de la maladie de Parkinson) peuvent être transférés entre les cellules à l'intérieur des lysosomes, et que ce transfert intercellulaire est médié par les TNT (Abounit et al., 2016). Dans mon deuxième projet, afin d'étudier le mécanisme de la formation de TNT, j'ai effectué un crible à haut débit pour les Rab GTPase. J'ai trouvé que Rab8 et Rab11 peuvent favoriser la formation des TNT, et que les cascades Rab8-VAMP3, Rab11-ERM et Rab8-Rab11 sont impliquées dans la formation des TNT. Mes données suggèrent que la polymérisation de l'actine et le trafic de membranes sont impliqués dans la formation des TNT. Ces résultats permettent d'éclairer le mécanisme de la formation des TNT et de fournir des preuves moléculaires que les Rab GTPases régulent ce processus. / Tunneling nanotubes are actin-based cell protrusions that mediate cell-to-cell communication by transferring cellular cargos. The different types of intercellular communication are increasing by being considered as potential targets for the treatment of various diseases, such as infectious diseases linked to viruses and bacteria, cancers or neurodegenerative diseases. Recent studies have highlighted a prion-like mechanism of propagation of protein misfolding in a variety of common, non-infectious, neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Frontotemporal dementia (FTD), Parkinson’s disease (PD), and Polyglutamine (PolyQ) diseases, which are characterized by the accumulation of misfolded proteins in the brain of patients. Thus, new therapeutic strategies to block propagation of protein misfolding throughout the brain can be envisaged. It has been shown that TNTs might play a critical role in spreading of prion aggregates within the CNS and from the periphery. Therefore, the study of mechanism of TNT formation could provide new insights on the mechanism of disease propagation and novel therapeutic targets. The aim of my thesis was to study the role of TNT-mediate protein aggregates transfer between cells and to investigate the mechanism of TNT formation. In our lab, we already reported TNT mediate prion transfer between cells. In the first part of my PhD, I further confirmed that prion aggregates transfer between neuronal CAD cells through TNT inside endocytic vesicles (Zhu et al., 2015). Furthermore in collaboration with a colleague, we provided evidences that prion aggregates could transfer between primary astrocytes and neurons and the transfer was mediated by cell-to-cell contact (Victoria et al., 2016). I also collaborated to another study where we showed that α-synuclein aggregates (Parkinson’s disease) can transfer between cells inside lysosomes, and the intercellular transfer is mediated by TNTs (Abounit et al., 2016).In my second project, in order to investigate the mechanism of TNT formation, I performed a High-content screening of Rab GTPase. I found that Rab8 and Rab11 can promote TNT formation, that Rab8-VAMP3, Rab11-ERM and Rab8-Rab11 cascades are involved in TNT formation. My data suggests that both actin polymerization and membrane trafficking are involved in TNT formation. These results help to shed light on the mechanism of TNT formation, and provide molecular evidences that Rab GTPases regulate this process.

La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.