Neisseria gonorrhoeae are Gram-negative bacteria with diplococcal shape. As an obligate human pathogen, it is the causative agent of gonorrhoea, a sexually transmitted disease. Gonococci colonize a variety of mucosal tissues, mainly the urogenital tract in men and women. Occasionally N. gonorrhoeae invades the bloodstream, leading to disseminated gonococcal infection. These bacteria possess a repertoire of virulence factors, which expression patterns can be adapted to the environmental conditions of the host. Through the accumulation of antibiotic resistances and in absence of vaccines, some neisserial strains have the potential to spread globally and represent a major public health threat. Therefore, it is necessary to understand the exact molecular mechanisms underlying the successful infection and progression of gonococci within their host. This deeper understanding of neisserial infection and survival mechanisms is needed for the development of new therapeutic agents. In this work, the role of host-cell sphingolipids on the intracellular survival of N. gonorrhoeae was investigated. It was shown that different classes of sphingolipids strongly interact with invasive gonococci in epithelial cells. Therefore, novel and highly specific clickable sphingolipid analogues were applied to study these interactions with this pathogen. The formation of intra- and extracellular sphingosine vesicles, which were able to target gonococci, was observed. This direct interaction led to the uptake and incorporation of sphingosine into the neisserial membrane. Together with in vitro results, sphingosine was identified as a potential bactericidal reagent as part of the host cell defence. By using different classes of sphingolipids and their clickable analogues, essential structural features, which seem to trigger the bacterial uptake, were detected. Furthermore, effects of key enzymes of the sphingolipid signalling pathway were tested in a neutrophil infection model. In conclusion, the combination of click chemistry and infection biology made it possible to shed some light on the dynamic interplay between cellular sphingosine and N. gonorrhoeae. Thereby, a possible “catch-and-kill” mechanism could have been observed. / Neisseria gonorrhoeae ist ein Gram-negatives Bakterium, welches als Diplokokke vorkommt. Als ein ausschließliches Humanpathogen sind Neisserien der Erreger für die sexuell übertragbare Infektionskrankheit Gonorrhö. Gonokokken besiedeln eine Vielzahl von Schleimhäuten, jedoch hauptsächlich den Urogenitaltrakt bei Männern und Frauen. Gelegentlich kann N. gonorrhoeae in die Blutbahn invadieren, was zu einer disseminierten Infektion führen kann. Diese Bakterien verfügen über ein Repertoire an Virulenzfaktoren, deren Expressionskombination den Umgebungsbedingungen des Wirts angepasst werden können. Durch die Anhäufung von Antibiotikaresistenzen und durch das Fehlen eines Impfstoffes, besteht die Gefahr, dass spezielle Neisserienstämme sich weltweit verbreiten und daher eine ernstzunehmende Bedrohung des Menschen sind. Daher ist es notwendig die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der erfolgreichen Infektion und Ausbreitung der Gonokokken im Wirt genauestens zu verstehen. Das detaillierte Wissen über die Neisserieninfektion und Überlebensmechanismen ist nötig für die Entwicklung neuer Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Sphingolipiden der Wirtszelle auf das intrazelluläre Überleben von N. gonorrhoeae untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Klassen von Sphingolipiden stark mit invasiven Gonokokken in Epithelzellen interagieren. Um dies zu tun, wurden neue und hochspezifische clickbare Sphingolipidanaloge eingesetzt, um deren Interaktionen mit diesem Pathogen zu studieren. Die Formation von intra- als auch extrazellulären Sphingosinvesikeln, welche Gonokokken gezielt erreichten, konnte beobachtet werden. Diese direkte Interaktion führte zu einer Aufnahme und Einbau des Sphingosins in die Neisserienmembran. Zusammen mit in vitro Ergebnissen, konnte Sphingosin als potenzieller und antibakterieller Bestandteil des zellulären Abwehrsystems identifiziert werden. Weiterhin wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Sphingolipidklassen und deren clickbaren Analoge wichtige Strukturen erkannt, die die bakterielle Aufnahme auslösen. Des Weiteren wurden die Auswirkungen von Schlüsselenzymen des Sphingolipidsignalwegs in einem Infektionsmodell mit Neutrophilen getestet. Abschließend ist zu sagen, dass die Kombination aus Click Chemie und Infektionsbiologie es ermöglicht hat, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen zellulären Sphingosin und N. gonorrhoeae zu beleuchten. Dadurch konnte ein möglicher „catch-and-kill”-Mechanismus entdeckt werden.

Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is an obligate human pathogen which causes live-threatening sepsis and meningitis. The fatality rate after meningococcal infection is high and surviving patients often suffer from severe sequelae. To cause meningitis, N. meningitidis must overcome the endothelium of the blood-brain barrier. The bacterium achieves this through the interaction with endothelial surface receptors leading to alternations of the cellular metabolism and signaling, which lastly results in cellular uptake and barrier traversal of N. meningitidis. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that belongs to the class of sphingolipids and regulates the integrity of the blood-brain barrier through the interaction with its cognate receptors S1P receptors 1-3 (S1PR1-3). In this study, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to generate a time-resolved picture of the sphingolipid metabolism in a brain endothelial cell line (hCMEC/D3) upon meningococcal infection. Among various changes, S1P was elevated in the cellular compartment as well as in the supernatant of infected hCMEC/D3s. Analysis of mRNA expression in infected hCMEC/D3s with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) revealed that the increase in S1P could be attributed to the enhanced expression of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1). Antibody-based detection of SphK1 protein or phosphorylation at SphK1 residue Serine 225 in hCMEC/D3 plasma membrane fractions via Western Blot revealed that N. meningitidis also induced SphK1 phospho-activation and recruitment to the plasma membrane. Importantly, recruitment of SphK1 to the plasma membrane increases the probability of substrate encounter, thus elevating SphK activity. Enhanced SphK activity was also reflected on a functional level, as detected by a commercially available ATP depletion assay used for measuring the enzymatic activity of SphK. Infection of hCMEC/D3 cells with pilus-deficient mutants resulted in a lower SphK activation compared to the N. meningitidis wild type strain. hCMEC/D3 treatment with pilus-enriched protein fractions showed SphK activation similar to the infection with living bacteria and could be ascribed to pilus interaction with the membrane-proximal domain of cellular surface receptor CD147. Inhibition of SphK1 or SphK2 through pre-treatment with specific inhibitors or RNA interference reduced uptake of N. meningitidis into hCMEC/D3 cells, as measured with Gentamicin protection assays. Released S1P induced the phospho-activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) via S1PR2 activation, whose expression was also increasing during infection. Furthermore, S1PR2 blockage had a preventive effect on bacterial invasion into hCMEC/D3 cells. On the contrary, activation of S1PR1+3 also reduced bacterial uptake, indicating an opposing regulatory role of S1PR1+3 and S1PR2 during N. meningitidis uptake. Moreover, SphK2 inhibition prevented inflammatory cytokine expression as well as release of interleukin-8 after N. meningitidis infection. Taken together, this study demonstrates the central role of S1P and its cognate receptors S1PR1-3 in the pathophysiology of meningococcal meningitis. / Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein obligat humanpathogenes Bakterium, welches lebensbedrohliche Sepsis und Meningitis auslöst. Die Todesrate nach einer Meningokokkeninfektion ist hoch und überlebende Patienten leiden oft unter gravierenden Folgeschäden. N. meningitidis muss zuerst das Endothel der Blut-Hirn-Schranke überwinden, um Meningitis auslösen zu können. Das Bakterium erzielt dies durch die Interaktion mit endothelialen Rezeptoren, welche den zellulären Metabolismus und die zellulären Signalwege beeinflusst und letztlich zur zellulären Aufnahme von N. meningitidis und zur Überwindung der Barriere führt. Sphingosine 1-phosphat (S1P) ist ein Lipidmediator, der zur Klasse der Sphingolipide gehört und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch die Interaktion mit den zugehörigen S1P Rezeptoren 1-3 (S1PR1-3s) beeinflusst. In dieser Arbeit wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS/MS) genutzt, um ein zeitlich aufgelöstes Bild des Sphingolipidmetabolismus in einer Hinendothelzelllinie (hCMEC/D3) nach Meningokokkeninfektion zu generieren. Neben zahlreichen Veränderungen zeigte sich ein Anstieg von S1P im zellulären Kompartiment und im Überstand von infizierten hCMEC/D3 Zellen. Die Analyse der mRNA Expression in infizierten hCMEC/D3 Zellen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) offenbarte, dass der Anstieg von S1P auf eine erhöhte Expression der S1P-bildenden Sphingosinkinase 1 (SphK1) zurückzuführen war. Die ntikörperbasierte Detektion des Proteins SphK1 oder dessen Phosphorylierung an Serin 225 in den Membranfraktionen von hCMEC/D3 Zellen mittels Western Blot zeigte, dass N. meningitidis außerdem die Phospho-Aktivierung und Membrantranslokation von SphK1 induzierte. Die Plasmamembrantranslokation von SphK1 erhöht die Wahrscheinlichkeit auf das Substrat Sphingosine zu treffen und verstärkt somit die SphK-Aktivität. Die erhöhte SphK-Aktivität zeigte sich auch auf funktioneller Ebene, wie mittels eines ATP-Verbrauchs-Assays zur Messung der SphK-Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Infektion von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-defizienten Mutanten resultierte in einer geringeren SphK-Aktivierung im Vergleich zum Wildtypstamm. Die Behandlung von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-aufgereinigten Fraktionen zeigte eine SphK-Aktivierung, die mit der Aktivierung durch lebende Bakterien vergleichbar war und der Interaktion des Pilus mit der membranproximalen Domäne des zellulären Oberflächenrezeptors CD147 zugeordnet werden konnte. Die Inhibition von SphK1 und SphK2 durch die Vorbehandlung mit spezifischen Inhibitoren oder RNA-Interferenz reduzierte die Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen, wie mittels Gentamicin Protection Assay nachgewiesen wurde. Das freigesetzte S1P induzierte die Phospho-Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) durch die Aktivierung von S1PR2, welcher während der Infektion vermehrt exprimiert wurde. Die Blockierung von S1PR2 hatte einen präventiven Effekt auf die bakterielle Invasion in hCMEC/D3 Zellen. Im Gegenzug reduzierte die Aktivierung von S1PR1+3 ebenfalls die bakterielle Aufnahme, was auf eine gegensätzliche regulatorische Rolle von S1PR1+3 und S1PR2 während der Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen hindeutet. Darüber hinaus verhinderte die Inhibition von SphK2 die Expression von inflammatorischen Cytokinen sowie die Freisetzung von Interleukin-8 nach Infektion mit N. meningitidis. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die zentrale Rolle von S1P und den zugehörigen Rezeptoren S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis.