Fission yeast Srk1 kinase is essential for cellular responses to extracellular stimuli. It is activated downstream of the MAPK Spc1 and participates in controlling mitotic entry by directly phosphorylating and inhibiting Cdc25 phosphatase during the normal cell cycle and also in response to osmotic stress. Following phosphorylation, Cdc25 is exported out of the nucleus. Heat stress caused by a temperature shift from 25°C to 36°C, which is within the normal temperature tolerance of fission yeast, temporarily inhibits nuclear division in wildtype cells. The same response is seen in cells deleted for the Pyp1 and Pyp2 phosphatases which normally serve to down regulate the Spc1 stress response. I have shown that the transient block in nuclear division caused by temperature shifts within the physiological range does not occur in srk1- cells but instead there is a stimulation of mitosis and cell division in response to the heat stress. This pattern of mitotic stimulation is phenocopied in cdc25-9a cells where nine putative Srk1 phosphorylation sites on Cdc25 are changed to alanine. Cells lacking srk1, however, display the same cell cycle progression pattern as the wildtype cells in response to osmotic stress. This experiment clearly distinguishes separate pathways for these two stress responses. Also, Cdc25 is found to be phosphorylated after a mild heat stress and seems to be exported out of the nucleus. These data indicate that Srk1 kinase plays the central role in regulating mitotic entry in response to mild heat stress by negatively regulating the Cdc25 tyrosine phosphatase. Thus my work highlights the role of Srk1 kinase in cell cycle regulation and is consistent with the Spc1 MAPK cascade linking the G2/M transition to extracellular stress. This response to mild heat stress is important because temperature sensitive mutants are frequently used in fission yeast research and this work shows that a temperature shift from 25°C to 36°C, which is within the physiological growth range, can trigger a stress response. / Thesis (Master, Biology) -- Queen's University, 2011-07-28 09:34:52.164

Les cèl·lules de llevat, al igual que les cèl·lules eucariotes d'organismes superiors, responen a situacions d'estrès extracel·lular activant la via de les MAP quinases, les quals transdueixen el senyal activant l'expressió de gens necessaris per a mantenir l'homeostasi cel·lular.Evidències experimentals recents ens indiquen que la nova quinasa Srk1, identificada en el nostre grup en cèl·lules de llevat, participa tant en la resposta a estrès cel·lular com en la regulació del cicle cel·lular (López-Avilés S, Grande M, Gonzalez M, Helgesen AL, Alemany V, Sánchez-Piris M, Bachs O, Millar JB, and Aligue R (2005). Inactivation of the Cdc25 phosphatase by the stress-activated Srk1 kianse in fission yeast. Mol Cell, 17, 49-59). Pel que fa al paper de la Srk1 en el cicle cel·lular normal, hem descrit que actua inhibint la transició g2/M mitjançant la fosforilació inhibidora de la fosfatsa CDc25, promovent la seva unió a una proteïna 14-3-3 (Rad24 en S. pombe) i la seva posterior exclusió del nucli tal i com s'havia descrit per a la quinasa de checkpoint Chk1. Pel que fa al paper de la Srk1 en resposta a estrès, estudis paral·lels duts a terme pel grup de la Dra. Quinn van descriure que la Srk1 és fortament induïda en resposta a estrès i que sota aquestes condicions és fosforilada de manera depenent de la MAPK Sty1. Amb la finalitat de determinar la naturalesa d'aquesta fosforilació i la seva rellevància en la resposta a estrès vam realitzar una sèrie d'assajos de fosforilació in vitro que demostren que la Srk1 és fosforilada i activada en la T463 per la MAP quinasa Sty1. A més a més, hem observat que l'activitat i estabilitat de la Srk1 depèn de la presència de la MAP quinasa, ja que en absència de Sty1 la Srk1 no és activa i es degrada via proteasoma. Per altra banda, hem establert el paper de la Srk1 en resposta a estrès: és la responsable d'aturar el cicle cel·lular en la transició G2/M per tal d'evitar que les cèl·lules continuin dividint-se fins que s'hagin adaptat a l'estrès imposat. Aquesta funció la realitza a través de la fosforilació de la Cdc25, promovent la seva unió a Rad24 i exclusió del nucli. A més a més, hem descrit que la fosforilació de la Srk1 per la MAPK és necessària per a que les cèl·lules responguin correctatment a l'estrès.Finalment, experiments recents indiquen un nou paper de la Srk1 controlant negativament la via de les MAP quinases de resposta a estrès. Hem observat que en absència de Srk1, Sty1 es manté fosforilada durant períodes de temps molt més llargs, fet que suggereix un paper en el mecanisme de silenciament de la via un cop la font d'estrès ha desaparegut o la cèl·lula s'ha adaptat a ella. Els nostres resultats indiquen que la Srk1 fosforila la T225 de la MAPKK Wis1 afectant la seva unió amb la MAPK Sty1, de manera que s'afavoreix la defosforilació per les fosfatses Pyp1 i Pyp2 i s'evita una possible reactivació de la via que resultaria tòxica per a la cèl·lula. / Activation and regulation of the Srk1 kinase in stress response in Schizosaccharomyces pombeControl of cell cycle progression by stress-activated protein kinases (SAPKs) is essential for cell adaptation to extracellular stimuli. The Schizosaccharomyces pombe SAPK Sty1/Spc1 orchestrates general changes in gene expression in response to diverse forms of cytotoxic stress. Here we show that Sty1/Spc1 is bound to its target, the Srk1 kinase, when the signaling pathway is inactive. In response to stress, Sty1/Spc1 phosphorylates Srk1 at threonine 463 of the regulatory domain, inducing both activation of Srk1 kinase, which negatively regulates cell cycle progression by inhibiting Cdc25, and dissociation of Srk1 from the SAPK, which leads to Srk1 degradation by the proteasome.Moreover, we have found a possible role for the Srk1 kinase in the inhibition of the MAPK pathway through a negative feedback mechanism. As srk1 gene is highly induced in response to several types of stress in a Sty1-dependent manner, it seems to be necessary to downregulate the pathway. Our results suggest that Srk1 phosphorylates Wis1 at threonine 225 to impair its binding with the MAPK Sty1, in order to avoid the reactivation of the stress response pathway. Therefore, Sty1 will be dephosphorylated and inactivated by the tyrosine phosphatases Pyp1 and Pyp2. The importance of these results lays on the inactivation of a MAPK pathway by a kinase.