Stem cell niches are specialized signalling microenvironments that allow maintenance of the stem cells. According to the traditional model of the stem cell niche, the niche signalling input is integrated by a cell towards a binary decision between stemness and differentiation. I have studied the regulation of somatic cyst stem cell (CyCS) proliferation in the testicular stem cell niche of Drosophila melanogaster by performing the DamID screen for targets of the transcriptional regulator Zfh1, a shared target of Jak/STAT and Hedgehog niche signalling. I have found that Zfh1 binds to the regulatory regions of kibra and salvador, tumour suppressors of the Hippo/Yorkie pathway, and downregulates them, restricting Yorkie activity to the Zfh1 positive CySCs. Clonal inactivation of the Hippo pathway is sufficient for CySC proliferation, but does not affect their differentiation ability. I therefore proposed a different stem cell niche model, whereby the niche signalling directly “micromanage” stem cell behavior, not involving the cell fate decision making.

Stem cell niches are specialized signalling microenvironments that allow maintenance of the stem cells. According to the traditional model of the stem cell niche, the niche signalling input is integrated by a cell towards a binary decision between stemness and differentiation. I have studied the regulation of somatic cyst stem cell (CyCS) proliferation in the testicular stem cell niche of Drosophila melanogaster by performing the DamID screen for targets of the transcriptional regulator Zfh1, a shared target of Jak/STAT and Hedgehog niche signalling. I have found that Zfh1 binds to the regulatory regions of kibra and salvador, tumour suppressors of the Hippo/Yorkie pathway, and downregulates them, restricting Yorkie activity to the Zfh1 positive CySCs. Clonal inactivation of the Hippo pathway is sufficient for CySC proliferation, but does not affect their differentiation ability. I therefore proposed a different stem cell niche model, whereby the niche signalling directly “micromanage” stem cell behavior, not involving the cell fate decision making.

The local microenvironment of hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow -referred to as stem cell niche- is thought to regulate the balance of stem cell maintenance and differentiation by a complex interplay of extrinsic signals including spatial constraints, extracellular matrix (ECM) components and cell-cell interactions. To dissect the role of niche ECM components, a set of well-defined matrix biomolecular coatings including fibronectin, laminin, collagen IV, tropocollagen I, heparin, heparan sulphate, hyaluronic acid and co-fibrils of collagen I with heparin or hyaluronic acid were prepared and analyzed with respect to adhesive interactions of human CD133+ HSCs in vitro. ECM molecule dependent adhesion areas as well as fractions of adherent HSCs were assessed by reflection interference contrast microscopy and differential interference contrast microscopy. HSCs, so far mostly classified as suspension cells, exhibited intense adhesive interactions with fibronectin, laminin, collagen IV, heparin, heparan sulphate, and collagen I based co-fibrils. An integrin mediated adhesion on fibronectin and a L-selectin mediated adhesion on heparin pointed to specific interactions based on different adhesion mechanisms. As a consequence of HSC adhesion to molecules of the vascular and the endosteal regions, both regions were confirmed as possible stem cell niches and adhesive signals were suggested as potential regulators of stem cell fate. Furthermore, the impact of a spatially organized ECM on the HSC behavior was analyzed by single cell tracking. These studies required the development of engineered three-dimensional, ECM coated microcavities with the option for single cell tracking. A semi-automated cell-tracking tool was established to accelerate data access from time-lapse image sequences. From this analysis it was possible to reveal the genealogy, localization, morphology and migration of single HSCs over a time period of 4 days. A decreased cycling frequency was observed depending on the HSC localization in the spatially constraining microcavities. Besides the revealed impact of spatial constraints on HSC fate, the newly engineered ECM-coated microcavity setup and the semi-automated cell tracking tool provide new options to study the cell fate in engineered microenvironments at single cell level for other cell types ex vivo. / Die lokale Mikroumgebung von Blutstammzellen (BSZ) im Knochenmark, bezeichnet als Stammzellnische, reguliert das Gleichgewicht von Stammzellerhaltung und -differenzierung durch ein komplexes Zusammenspiel von extrinsischen Signalen wie räumliche Beschränkungen, Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und Zell-Zell Wechselwirkungen. Um die Rolle der EZM-Komponenten zu analysieren, wurden definierte Beschichtungen von Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, monomerem Kollagen I, Heparin, Heparan Sulphat, Hyaluronsäure und Co-Fibrillen aus Kollagen I und Heparin oder Hyaluronsäure hergestellt und in vitro bezüglich der adhäsiven Wechselwirkungen von humanen CD133+ BSZ untersucht. Die Adhäsionsflächen und der Anteil adhärenter Zellen wurden in Abhängigkeit von der EZM-Beschichtung mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und Differentieller Interferenz Kontrast Mikroskopie bestimmt. BSZ, bisher als Suspensionszellen definiert, zeigten intensive adhäsive Wechselwirkungen mit Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, Heparin, Heparan Sulphat und den Co-Fibrillen. Eine Integrin abhängige Adhäsion auf Fibronektin und eine L-Selektin abhängige Adhäsion auf Heparin, wiesen auf spezifische Wechselwirkungen hin, die auf unterschiedlichen Mechanismen basieren. Aufgrund der Adhäsion von BSZ sowohl zu Molekülen der vaskulären als auch der endostealen Knochenmarkregion, wurden beide Bereiche als mögliche Stammzellnische bestätigt. Adhäsive Signale sind potentielle Regulatoren der Stammzellentwicklung. Im Weiteren wurde der Einfluss einer räumlich beschränkenden EZM auf das Verhalten der BSZ durch Einzelzellverfolgung untersucht. Diese Studien erforderten die Entwicklung von dreidimensionalen EZM-beschichteten Mikrokavitäten, die das Verfolgen einzelner Zellen ermöglichten. Es wurde ein halbautomatischer Algorithmus für die Zellverfolgung etabliert, um die Datengenerierung von den Zeitreihenaufnahmen zu beschleunigen. Die Analysen ermöglichten Aussagen über die Genealogie, Lokalisierung, Morphologie und Migration einzelner BSZ während einer Analysenzeit von 4 Tagen. Eine verringerte Zellteilungsaktivität wurde in Abhängigkeit von der BSZ Lokalisierung innerhalb der räumlich einschränkenden Mikrokavitäten festgestellt. Neben diesen Erkenntnissen bieten die entwickelten Mikrokavitäten und die etablierte Einzelzellverfolgung neue Möglichkeiten auch andere Zelltypen auf Einzelzellniveau ex vivo zu untersuchen.

The local microenvironment of hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow -referred to as stem cell niche- is thought to regulate the balance of stem cell maintenance and differentiation by a complex interplay of extrinsic signals including spatial constraints, extracellular matrix (ECM) components and cell-cell interactions. To dissect the role of niche ECM components, a set of well-defined matrix biomolecular coatings including fibronectin, laminin, collagen IV, tropocollagen I, heparin, heparan sulphate, hyaluronic acid and co-fibrils of collagen I with heparin or hyaluronic acid were prepared and analyzed with respect to adhesive interactions of human CD133+ HSCs in vitro. ECM molecule dependent adhesion areas as well as fractions of adherent HSCs were assessed by reflection interference contrast microscopy and differential interference contrast microscopy. HSCs, so far mostly classified as suspension cells, exhibited intense adhesive interactions with fibronectin, laminin, collagen IV, heparin, heparan sulphate, and collagen I based co-fibrils. An integrin mediated adhesion on fibronectin and a L-selectin mediated adhesion on heparin pointed to specific interactions based on different adhesion mechanisms. As a consequence of HSC adhesion to molecules of the vascular and the endosteal regions, both regions were confirmed as possible stem cell niches and adhesive signals were suggested as potential regulators of stem cell fate. Furthermore, the impact of a spatially organized ECM on the HSC behavior was analyzed by single cell tracking. These studies required the development of engineered three-dimensional, ECM coated microcavities with the option for single cell tracking. A semi-automated cell-tracking tool was established to accelerate data access from time-lapse image sequences. From this analysis it was possible to reveal the genealogy, localization, morphology and migration of single HSCs over a time period of 4 days. A decreased cycling frequency was observed depending on the HSC localization in the spatially constraining microcavities. Besides the revealed impact of spatial constraints on HSC fate, the newly engineered ECM-coated microcavity setup and the semi-automated cell tracking tool provide new options to study the cell fate in engineered microenvironments at single cell level for other cell types ex vivo. / Die lokale Mikroumgebung von Blutstammzellen (BSZ) im Knochenmark, bezeichnet als Stammzellnische, reguliert das Gleichgewicht von Stammzellerhaltung und -differenzierung durch ein komplexes Zusammenspiel von extrinsischen Signalen wie räumliche Beschränkungen, Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und Zell-Zell Wechselwirkungen. Um die Rolle der EZM-Komponenten zu analysieren, wurden definierte Beschichtungen von Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, monomerem Kollagen I, Heparin, Heparan Sulphat, Hyaluronsäure und Co-Fibrillen aus Kollagen I und Heparin oder Hyaluronsäure hergestellt und in vitro bezüglich der adhäsiven Wechselwirkungen von humanen CD133+ BSZ untersucht. Die Adhäsionsflächen und der Anteil adhärenter Zellen wurden in Abhängigkeit von der EZM-Beschichtung mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und Differentieller Interferenz Kontrast Mikroskopie bestimmt. BSZ, bisher als Suspensionszellen definiert, zeigten intensive adhäsive Wechselwirkungen mit Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, Heparin, Heparan Sulphat und den Co-Fibrillen. Eine Integrin abhängige Adhäsion auf Fibronektin und eine L-Selektin abhängige Adhäsion auf Heparin, wiesen auf spezifische Wechselwirkungen hin, die auf unterschiedlichen Mechanismen basieren. Aufgrund der Adhäsion von BSZ sowohl zu Molekülen der vaskulären als auch der endostealen Knochenmarkregion, wurden beide Bereiche als mögliche Stammzellnische bestätigt. Adhäsive Signale sind potentielle Regulatoren der Stammzellentwicklung. Im Weiteren wurde der Einfluss einer räumlich beschränkenden EZM auf das Verhalten der BSZ durch Einzelzellverfolgung untersucht. Diese Studien erforderten die Entwicklung von dreidimensionalen EZM-beschichteten Mikrokavitäten, die das Verfolgen einzelner Zellen ermöglichten. Es wurde ein halbautomatischer Algorithmus für die Zellverfolgung etabliert, um die Datengenerierung von den Zeitreihenaufnahmen zu beschleunigen. Die Analysen ermöglichten Aussagen über die Genealogie, Lokalisierung, Morphologie und Migration einzelner BSZ während einer Analysenzeit von 4 Tagen. Eine verringerte Zellteilungsaktivität wurde in Abhängigkeit von der BSZ Lokalisierung innerhalb der räumlich einschränkenden Mikrokavitäten festgestellt. Neben diesen Erkenntnissen bieten die entwickelten Mikrokavitäten und die etablierte Einzelzellverfolgung neue Möglichkeiten auch andere Zelltypen auf Einzelzellniveau ex vivo zu untersuchen.

Acute myeloid leukemia (AML) presents the deadliest form of blood cancer which leads to abrupt, premature deaths. Current therapeutic treatment options in AML are unspecific, resulting in high relapse rates and poor clinical responses in patients. Therapy-resistant, stem cell-like AML cells are believed to be protected by proximal stromal cells in their microenvironment, the leukemic stem cell niche. In part A of this work, an innovative first-of-its-kind arrayed endoribonuclease-prepared siRNA (esiRNA) screen was established for the targeted identification of stromal-derived, AML-supportive genes. Immortalized bone-marrow derived mesenchymal stromal cells (SCP-1) were subjected to individual esiRNA-mediated target gene knockdowns (KD) and subsequently cocultured with AML cell lines MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 and HL-60. AML proliferation and therapy resistance to cytostatic agents Cytarabine or Daunorubicin and tyrosine kinase inhibitor Midostaurin were assessed in direct cocultures. In SCP-1, several secreted, membrane-associated and intracellular molecules were identified which, upon esiRNA-mediated KD, resulted in proliferation inhibition and enhanced treatment response of cocultured AML cells. Carbonic anhydrase 9 (CA9), a stabilizer of intracellular pH, was identified as a supportive factor in proliferation and resistance of leukemic cells to Daunorubicin treatment whilst CA9-KD exerted only a comparably low toxicity in SCP-1 cells. Excitingly, published data by Chen and colleagues (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) indicated an upregulation of CA9 in hypoxic ex vivo cultures of leukemic cells, measured an anti-leukemic effect of pharmacological CA9 inhibition and identified a synergistic effect on leukemic cells via combinatorial treatment of CA9-inhibition and Cytarabine under hypoxic culture conditions. Taken together, an arrayed esiRNA screen identified CA9 and other stromal-derived factors which potentially open up new avenues for selective therapeutic treatments targeting the leukemic microenvironment in AML. Currently, preclinical leukemia research relies on artificial suspension cultures of AML cells and highly sophisticated, patient-derived xenograft (PDX) mouse models that are marked by suboptimal translation of findings of PDX experiments into the clinic. Recent developments in complex three-dimensional (3D) hydrogel star-shaped poly(ethylene glycol) (starPEG)-heparin cocultures of leukemic and stromal cells of human origin showed promising results in proliferation and drug response studies. Therefore, in part B of this work, a high throughput screening (HTS)-compatible 3D hydrogel culture setup of human stromal cells was established in 384-well plates. Implementation of design of experiments (DoE) enabled an efficient, cost-effective optimization of hydrogel monocultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Optimized culture conditions favored angiogenic sprouting of hydrogel-embedded HUVECs which responded to angiogenic inhibitors Axitinib, AZD4547 and Bevacizumab in a dose-dependent manner. A coculture with bone marrow derived MSCs altered the angiogenic network formation of endothelial CD31+ vessel-like structures. The hydrogel coculture was further stabilized by extensive hydrogel degradation and ECM deposition of MSCs. Stromal MSC networks were illustrated as highly interconnected and elongated F-Actin filament structures (CD31- F-Actin+) that were closely associating with CD31+ F-Actin+ endothelial vessel-like structures. Excitingly, the established 3D hydrogel HTS platform of primary human stromal cells enables future addition of patient-derived leukemic cells for targeted leukemic vulnerability screens in an ex vivo cell culture model of the perivascular stem cell niche. / Akute myeloische Leukämie (AML) gilt als die tödlichste Form der Blutkrebserkrankungen, welche untherapiert zum abrupten, vorzeitigen Tod führt. Etablierte therapeutische Verfahren der AML sind unspezifisch, welche durch heterogene Behandlungseffekte gekennzeichnet sind und zu hohen Rückfallquoten führen. Man vermutet, dass therapie-resistente, stammzellähnliche leukämische Zellen von proximal residierenden Stromazellen in ihrem Mikromilieu, in der sogenannten leukämischen Stammzellnische, vor therapeutischen Behandlungen geschützt werden. In Teil A dieser Arbeit wurde ein innovativer, neuartiger Screen basierend auf Endoribonuklease-generierten kleinen, interferierenden Ribonukleinsäuren (esiRNAs) für eine gezielte Identifikation von AML-supportiven, stromalen Faktoren etabliert. Immortalisierte, mesenchymale Stromazellen aus dem Knochenmark (SCP-1) wurden in einem Array mit spezifischen esiRNAs transfiziert, um esiRNA-basierende inhibierende Effekte (Knockdown) auf die Genexpression von Zielgenen in SCP-1 zu studieren und indirekte Auswirkungen auf Proliferationsrate und Therapieresistenz von kokultivierten leukämischen Zelllinien, MV4-11, OCI-AML3, MOLM-13 und HL-60, bei Behandlung mit Cytarabin, Daunorubicin und Midostaurin, zu studieren. Mehrere sezernierte, membranständige und intrazelluläre Faktoren wurden in SCP-1 identifiziert, deren esiRNA-vermittelter Knockdown zu einer Proliferationsminderung sowie verstärkten Toxizitätseffekten von applizierten Therapeutika in Leukämiezellen führten. Beispielhaft wurde Carboanhydrase (CA9), ein Enzym welches den intrazellularen pH einer Zelle stabilisert, als Target identifiziert. Ein Knockdown von CA9 in SCP-1 resultierte in einer Proliferationsminderung von kokultivierten Leukämiezellen, welche des Weiteren in einer Behandlung mit Daunorubicin verstärkt abgetötet wurden. Publizierte Daten von Chen et al. (Blood, 2017, Vol. 130, Suppl. 1, 2521) zeigten, dass CA9 in hypoxischen ex vivo Kulturen in leukämischen Zellen hochreguliert war und, dass dessen pharmakologische Inhibition einen anti-leukämischen Effekt aufwies. Zudem wurde ein synergistischer Therapieffekt, bei einer Kombinationstherapie mit einem CA9-Inhibitor und Cytarabin, auf AML Zellen in hypoxischer Zellkultur festgestellt. Zusammenfassend wurden in einem esiRNA-Screen CA9 und weitere stromal-exprimierte Faktoren identifiziert, die das Potential besitzen neuartige Therapiestrategien zu ermöglichen, welche auf die leukämische Stammzellnische als Zielstruktur ausgerichtet sind. In der präklinischen Forschung von hämatologischen Erkrankungen werden vorrangig artifizielle zweidimensionale Suspensionskulturen von Leukämiezellen verwendet oder ausgefeilte, patienten-derivierende Xenograft (PDX) Mausmodelle eingesetzt. Bedauerlicherweise weisen Erkenntnisse aus Mausmodellen eine geringe Translationseffizienz in die klinische Forschung auf. Neuste Entwicklungen mit komplexen, dreidimensionalen Hydrogelkulturen, bestehend aus sternförmigem Polyethylenglykol (starPEG) und Heparin, von stromalen und leukämischen Zellen humanen Ursprungs zeigten vielversprechende Ergebnisse in präklinischen Proliferations- und Vulnerabilitätsstudien. Daher wurde in Teil B dieser Arbeit ein hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Kultursystem von humanen Stromazellen in Hydrogelen entwickelt. Per statistischer Versuchsplanung wurde eine effiziente, kostengünstige Optimierung von etablierten Hydrogelkulturen für die Hochdurchsatz-kompatible Kultur von humanen venösen Endothelzellen aus Nabelschnuren (HUVECs) durchgeführt. Optimierte Kulturbedingungen führten zur Angiogenese von Hydrogel-eingebetteten HUVECs, welche des Weiteren auf die Angiogenese-Inhibitoren Axitinib, AZD4547 und Bevacizumab in einer konzentrationsabhängigen Weise mit verminderter Bildung von gefäßähnlichen Strukturen reagierten. Eine Kokultur von HUVECs mit primären, mesenchymalen Stromazellen aus dem Knochenmark (MSCs) beeinflusste die Bildung von CD31+ gefäßähnlichen Strukturen. Die Hydrogel-Kokultur wurde des Weiteren durch verstärkte Degradation des Hydrogels und Deposition von Komponenten der extrazellulären Matrix via MSCs verändert und dadurch zusätzlich stabilisiert. Geformte Netzwerkstrukturen von MSCs und HUVECs wurden mittels F-Actin Färbung identifiziert, wodurch ersichtlich wurde, dass Strukturen von MSCs (CD31- F-Actin+) in enger räumlicher Distanz zu HUVEC Strukturen (CD31+ F-Actin+) gebildet wurden. Spannenderweise ermöglicht die, in dieser Arbeit etablierte, Hochdurchsatz-kompatible Kokultur von humanen Stromazellen die Möglichkeit auch leukämische Zellen in die Hydrogelmatrix einzubetten. Eine humane AML-Stroma Kokultur in Hydrogelen wird gezielte Vulnerabilitätsscreens von AML Zellen in einem komplexen ex vivo Zellkulturmodel der perivaskulären Stammzellnische ermöglichen.