Há um grande interesse no estudo de células-tronco em função de sua capacidade de auto-renovação e plasticidade. Estas características capacitam as células-tronco a produzirem células de diferentes linhagens que participam ativamente do processo de homeostase, da resposta à injúria e da regeneração e reparação tecidual. A polpa dental é o tecido mais estudado na Odontologia em relação a células-tronco, mas diversos estudos já mostraram a presença dessas células também na região periodontal. É importante salientar, que dependendo de sua origem, as células-tronco apresentam comportamentos diversos, especialmente no que tange ao transplante in vivo. Além disso, os microambientes onde as células-tronco residem (nichos), têm um papel fundamental no comportamento das mesmas, pois controlam aspectos essenciais como o estado de indiferenciação e a auto-renovação. Esse projeto de pesquisa teve como objetivos duas análises distintas. Na primeira, verificar se existem células-tronco mesenquimais derivadas da curetagem do alvéolo dental humano após extrações dentais. Na segunda, analisar o nicho de células-tronco nas polpas dentais de camundongos. Em comum, as duas análises se basearam no uso de marcadores previamente utilizados na literatura para o estudo de células-tronco. Como não existem marcadores únicos e específicos para a identificação dessas células, diferentes combinações desses marcadores entre si e de técnicas laboratoriais foram empregadas. No primeiro estudo, após o isolamento das células, deu-se especial atenção à sua caracterização, que foi realizada através de ensaios que avaliaram propriedades e comportamentos que sabidamente ocorrem em células-tronco. Já na segunda parte desse estudo, utilizamos a polpa dental de camundongos para a análise in vivo de nichos. Em camundongos, a localização do nicho responsável pelo crescimento continuo dos incisivos é conhecida. De uma maneira geral, nossos resultados demonstram que: 1) É possível isolar células-tronco/progenitoras a partir de tecidos curetados de alvéolo dental após extrações dentárias. Esse fato é inédito e abre novas perspectivas em termos de oportunidade de coleta e futura aplicação clínica. 2) É possível observar a diversidade populacional nas células que formam o nicho de células-tronco em polpa dental de camundongos, e através de uma organização hierárquica, propusemos um modelo para este nicho. Esse modelo servirá de base para estudos subsequentes que visem avaliar o comportamento das células que formam o nicho, quando isoladas das demais, e abrirá possibilidade para análises em outros tecidos dentais e não dentais. / There is great interest in the study of stem cells due to their ability to produce mature cells of different lineages that participate actively in the process of homeostasis, injury response, regeneration and tissue repair. The dental pulp is the most studied tissue in dentistry, but several studies have shown the presence of these cells in the periodontal tissue region. It is important to note that depending on their origin, these cells exhibit different behaviours, especially in regard to in vivo transplantation. Furthermore, the microenvironment in which these cells are found (niches) have an essential role in their behaviour as they control important aspects such as differentiation and self-renewal. This research project aimed for two distinct analyses. The first was to verify if there are mesenchymal stem cells derived from human dental socket curettage after dental extractions. The second, to analyse the stem cell niche in mouse dental pulp. In common, the two analyses were based on the use of markers previously used in the literature for the study of stem cells. As there are no specific and unique markers to identify these cells, an extensive combination of these markers among themselves, and laboratory techniques were performed. In the first study, after the isolation of the cells, special attention was given to their characterization by combining assays to evaluate stem cells properties and behaviours. In the second part of this study, we used the mouse dental pulp model for in vivo analysis of stem cell niches. In mice, the location of the niche responsible for the incisors continuous growth is known. In general our results showed that: 1) It is possible to isolate progenitor/stem cells from tissue curettage of the alveolus after tooth extractions. This fact is unprecedented and opens new perspectives for the obtention of stem cells for future clinical applications. 2) It is possible to observe the cells population diversity of the mouse dental pulp niche and through a hierarchical organization, we proposed a model for this niche. This model will provide basis for further studies aimed at evaluating the behavior of cells that form the niche, when isolated from the others, and opens the possibility for the analysis of the niche structure in other dental and non-dental tissues.

Há um grande interesse no estudo de células-tronco em função de sua capacidade de auto-renovação e plasticidade. Estas características capacitam as células-tronco a produzirem células de diferentes linhagens que participam ativamente do processo de homeostase, da resposta à injúria e da regeneração e reparação tecidual. A polpa dental é o tecido mais estudado na Odontologia em relação a células-tronco, mas diversos estudos já mostraram a presença dessas células também na região periodontal. É importante salientar, que dependendo de sua origem, as células-tronco apresentam comportamentos diversos, especialmente no que tange ao transplante in vivo. Além disso, os microambientes onde as células-tronco residem (nichos), têm um papel fundamental no comportamento das mesmas, pois controlam aspectos essenciais como o estado de indiferenciação e a auto-renovação. Esse projeto de pesquisa teve como objetivos duas análises distintas. Na primeira, verificar se existem células-tronco mesenquimais derivadas da curetagem do alvéolo dental humano após extrações dentais. Na segunda, analisar o nicho de células-tronco nas polpas dentais de camundongos. Em comum, as duas análises se basearam no uso de marcadores previamente utilizados na literatura para o estudo de células-tronco. Como não existem marcadores únicos e específicos para a identificação dessas células, diferentes combinações desses marcadores entre si e de técnicas laboratoriais foram empregadas. No primeiro estudo, após o isolamento das células, deu-se especial atenção à sua caracterização, que foi realizada através de ensaios que avaliaram propriedades e comportamentos que sabidamente ocorrem em células-tronco. Já na segunda parte desse estudo, utilizamos a polpa dental de camundongos para a análise in vivo de nichos. Em camundongos, a localização do nicho responsável pelo crescimento continuo dos incisivos é conhecida. De uma maneira geral, nossos resultados demonstram que: 1) É possível isolar células-tronco/progenitoras a partir de tecidos curetados de alvéolo dental após extrações dentárias. Esse fato é inédito e abre novas perspectivas em termos de oportunidade de coleta e futura aplicação clínica. 2) É possível observar a diversidade populacional nas células que formam o nicho de células-tronco em polpa dental de camundongos, e através de uma organização hierárquica, propusemos um modelo para este nicho. Esse modelo servirá de base para estudos subsequentes que visem avaliar o comportamento das células que formam o nicho, quando isoladas das demais, e abrirá possibilidade para análises em outros tecidos dentais e não dentais. / There is great interest in the study of stem cells due to their ability to produce mature cells of different lineages that participate actively in the process of homeostasis, injury response, regeneration and tissue repair. The dental pulp is the most studied tissue in dentistry, but several studies have shown the presence of these cells in the periodontal tissue region. It is important to note that depending on their origin, these cells exhibit different behaviours, especially in regard to in vivo transplantation. Furthermore, the microenvironment in which these cells are found (niches) have an essential role in their behaviour as they control important aspects such as differentiation and self-renewal. This research project aimed for two distinct analyses. The first was to verify if there are mesenchymal stem cells derived from human dental socket curettage after dental extractions. The second, to analyse the stem cell niche in mouse dental pulp. In common, the two analyses were based on the use of markers previously used in the literature for the study of stem cells. As there are no specific and unique markers to identify these cells, an extensive combination of these markers among themselves, and laboratory techniques were performed. In the first study, after the isolation of the cells, special attention was given to their characterization by combining assays to evaluate stem cells properties and behaviours. In the second part of this study, we used the mouse dental pulp model for in vivo analysis of stem cell niches. In mice, the location of the niche responsible for the incisors continuous growth is known. In general our results showed that: 1) It is possible to isolate progenitor/stem cells from tissue curettage of the alveolus after tooth extractions. This fact is unprecedented and opens new perspectives for the obtention of stem cells for future clinical applications. 2) It is possible to observe the cells population diversity of the mouse dental pulp niche and through a hierarchical organization, we proposed a model for this niche. This model will provide basis for further studies aimed at evaluating the behavior of cells that form the niche, when isolated from the others, and opens the possibility for the analysis of the niche structure in other dental and non-dental tissues.

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Asciutti_AugustoCesarSpadaccia_M.pdf: 1128451 bytes, checksum: ed87729f9d44f5ffd0d06e755272756f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Introdução: Durante o desenvolvimento e a vida adulta de um organismo, células troncoindiferenciadas, capazes de dar origem a um ou mais tipos celulares, proliferam e se diferenciam para, tanto produzir os tecidos de um organismo em desenvolvimento, quanto repor células perdidas pelo envelhecimento, doença ou injúria. Essas células residem em um nicho especializado contendo células diferenciadas e elementos responsáveis por manter o estado predominantemente quiescente. Acredita-se que as células tronco da próstata contribuam para o desenvolvimento de câncer através da desregulação dos elementos do nicho. ps20 é um elemento secretado por células musculares lisas da próstata, o qual demonstra capacidade de inibir o crescimento da linhagem de células prostáticas cancerígenas PC3 em cultura. Evidências sugerem uma possível relação entre ps20 com a adesão celular. No entanto, seu funcionamento é pouco conhecido. Objetivos: Analisar o efeito do silenciamento do gene WFDC1/ps20 sobre o comportamento das células p63+ e arquitetura tecidual durante o desenvolvimento prostático pós-natal. Materiais e métodos: Próstatas ventrais de ratos Wistar recém nascidos foram cultivadas sobre membranas flutuantes permeáveis, na presença de RNA de interferência para reduzir a expressão de ps20. Os órgãos foram cultivados por sete dias e em seguida analisados através da contagem da formação de estruturas epiteliais, colorações histológicas, imunohistoquímica e PCR em Tempo Real. Resultados: O silenciamento de WFDC1/ps20 levou a uma redução de 36% na quantidade de mRNA de WFDC1/ps20. Foi observada redução no número de pontas de ductos epiteliais entre o segundo e quarto dia cultura e entre o quarto e sétimo dia. A análise histológica revelou ductos com ramificação reduzida e com as pontas mais dilatadas, em resposta a redução de WFDC1/ps20. Foi observada polarização celular prejudicada e cavitação reduzida. A imunohistoquímica para p63 revelou que os níveis reduzidos de ps20 promoveram a concentração das células p63+ nas pontas dilatadas dos ductos epiteliais. Real Time PCR revelou que o silenciamento do gene WFDC1/ps20 promoveu um aumento de nove vezes na quantidade do mRNA de MMP9.Discussão: O silenciamento de WFDC1/ps20afetou o desenvolvimento prostático com um efeito sem ambiguidade no comportamento das células basais p63+, como representado pelo seu acumulo nas pontas dos ductos e diminuição ao longo dos ductos estendidos. O tratamento também prejudicou a polarização de células luminais e comprometeu a cavitação.O conteúdo elevado de mRNA de MMP9 pode estar relacionado com o acumulo da proteína e a degradação descontrolada da matriz extracelular ao redor pontas dos ductos, levando ao fenótipo dilatado. Como a degradação correta da matriz em locais específicos é requerida para a formação do ponto de ramificação, é sugerido que a ps20 regula o balanço da atividade de MMP9 necessária durante o desenvolvimento prostático. Essa ideia coloca o sistema uPA/uPAR acima da regulação e ativação de MMP9.Conclusões:A redução deWFDC1/ps20comprometeu a morfogênese em ramos, polarização das células epiteliais e cavitação. Esses aspectos estão associados com a desestabilização do comportamento das células p63+, como sugerido pelo seu acumulo nas pontas dilatadas e diminuição do compartimento de células basais ao longo dos ductos estendidos / Abstract: Introduction: During the development and adult life of an organism, undifferentiated stem cells, capable of giving rise to one or more cell types in an adult organism, proliferate and differentiate to both produce the tissues of an developing organism and replace cells lost by aging, disease or injury. These cells reside in a specialized niche containing differentiated cells and elements responsible for maintaining their predominantly quiescent state. Prostate stem cells are believed to contribute to cancer development via deregulation of niche elements. ps20 is a protein secreted by prostate smooth muscle cells which was shown to inhibit the growth of prostatic PC3 cancer cell line in culture. Evidences exist favoring a possible relationship between ps20 and cell adhesion. However its functioning is still poorly known. Objectives: Analyze the effect of the silencing of the WFDC1/ps20 gene in the behavior of p63-positive cells and tissue architecture during the post-natal prostatic development. Materials and methods: Ventral prostate of newborn Wistar rats were cultured on floating permeable membranes, in the presence of small interference RNA to reduce ps20 expression. The organs were cultured for seven days, and then analyzed by counting of epithelial structures formation, histological and immunohistochemical staining and Real Time PCR. Results: The silencing of WFDC1/ps20 led to a 36% reduction in WFDC1/ps20 mRNA amount. It was observed reduction in the number of epithelial duct tips between the second and fourth day of culture, and between the fourth and seventh day. Histological analysis revealed reduced branching and dilated tips in response toWFDC1/ps20knocking down. It was observed hindered polarization and reduced cavitation. Immunohistochemistry for p63 revealed that reduced levels of ps20 promoted the concentration of p63+ cells at the enlarged ductal tips. Real Time PCR revealed that the knocking down the WFDC1/ps20 gene promoted a 9-fold increase in the amount of MMP9 mRNA. Discussion: The silencing of WFDC1/ps20affected prostate development with an unambiguous effect on p63+ cells behavior, as represented by their accumulation at the ductal tips and depletion along the extended ducts. The treatment also hampered the differentiation of luminal cells and compromised cavitation. The increased MMP9 mRNA content might be correlated with the accumulation of the protein and uncontrolled degradation of the extracellular matrix around the duct tips, leading to the dilated phenotype. Since the correct degradation of the matrix in specific sites is required for the branch point formation we suggest that ps20 regulates the balance for MMP9 activity required during prostate development. This idea places the uPA/uPAR system upstream of MMP-9 regulation and activation. Conclusions: The reduction in the WFDC1/ps20expressioncompromised branching morphogenesis, epithelial cell polarization and cavitation. These aspects are associated with a destabilization of p63+cell behavior, as suggested by their accumulation at the dilated tips and depletion from the basal cell compartment along the extended ducts / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural