Pax7 is essential for the function of muscle satellite cells. It was previously determined that Pax7 methylation is essential for its transcriptional activity and function in satellite cells. We investigated whether Pax7 displays other post-translational modifications playing a role in its function. By mass spectrometry using immunoprecipitated FLAG-Pax7, we identified two lysine residues (K105 and K193) within the Pax7 protein that are acetylated. Pax7 transcriptional activity was monitored using a luciferase reporter under the control of Myf5, a Pax7 target gene. Treatment with Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, increased significantly luciferase activity, but this activity was progressively loss when the created Pax7 mutants (K105R, K193R) were introduced. This suggests that acetylation plays a role in Pax7 transcriptional activity. To identify the acetyltransferase modulating Pax7 activity, we used a candidate approach. Myst1 is expressed in muscle satellite cells. Myst1 is known for its interaction with Wdr5 and MLL1/2, a known Pax7 partner. We detected an interaction between Pax7 and Myst1 by co-immunoprecipitation in fibroblasts and in primary myoblasts. Myst1 knockdown decreases Pax7 acetylation status suggesting Myst1 as Pax7’s acetylase. Myst1 siRNA knockdown negatively impacts many Pax7’s target genes as well as primary myoblast proliferation. Moreover, primary myoblasts treated with siMyst1 express higher levels of MyoD. In satellite cells Myst1 reduction through siRNA knockdown significantly reduces satellite cells progenitor expansion as well as increases MyoD expression. In all, Myst1 modulating Pax7 activity through acetylation represents a novel mechanism in muscle stem cell biology.

Human pluripotent stem cells are increasingly used for cell-based regenerative therapies worldwide, with the use of embryonic and induced pluripotent stem cells as potential treatments for a range of debilitating and chronic conditions. However, with the level of chromosomal aneuploidies the cells may generate in culture, their safety for therapeutic use could be in question. This study aimed to develop sensitive and high-throughput assays for the detection and quantification of human pluripotent stem cell aneuploidies, to assess any changes in their positioning in nuclei, as well as investigate the possible roles of lamins in the accumulation of aneuploidies. Using Droplet Digital PCR™, we optimised the detection of aneuploid cells in a predominantly diploid background. An assay was established for the sensitive detection of up to 1% of mosaicism and was used for the monitoring of low-level chromosome copy number changes across different cell lines, conditions and passages in the human pluripotent stem cells. In addition, fluorescence in-situ hybridisation was used to map genes ALB and AMELX on chromosomes 4 and X, respectively, in karyotype-stable chromosome X aneuploid lymphoblastoid cell lines. Our results demonstrated significant alternations in the gene loci positioning in the chromosome X aneuploid cell lines. Using the same established method, the positioning of ALB and AMELX was monitored, alongside the genomic instability with ddPCR™, in the different human pluripotent stem cell lines, conditions and passage. We demonstrated a highly plastic nuclear organisation in the pluripotent stem cells with many changes occurring within a single passage. Furthermore, these results were not exclusive to a single cell line or condition, regardless of the presence or absence of feeder cells and of passage number, and the flexibility of the chromatin organisation remained throughout the duration of the study. We demonstrated high levels of genomic instability with recurrent gains and losses in the AMELX copy number in the human embryonic stem cells during the course of our study, however no significant changes in their gene loci positioning from these abnormalities were observed. xvi | P a g e Additionally, we observed reduced levels of lamin B2 in the aneuploid lymphoblastoid cell lines and complete loss in some hPSC samples. Our results support recent findings that suggest a link between lamin B2 loss and the formation of chromosome aneuploidies in cell culture. In conclusion, our data demonstrates several key novel findings. Firstly, we have established a sensitive technique for the detection of up to 1% mosaicism, which to our knowledge is the most sensitive assay currently available. Secondly, we showed significant changes in the gene loci positioning between aneuploid and diploid cell lines. Thirdly, utilising our novel ddPCR™ assay, we demonstrated the karyotypical instability of hPCSs with consistent gains and/or loses of gene copy numbers in a short period of time in culture. When studying the effects of different growth conditions, we showed that the karyotypical instability was not exclusive to a single condition or a combination of conditions, and what is more, the karyotypical abnormalities detected were not observed to change the gene positioning of hPSCs significantly, with the genome organisation remaining plastic. Finally, our results support a potential association of lamin B2 loss and karyotypical instability. We conclude that more sensitive and robust techniques need to be readily used by clinicians for the screening of potential therapeutic hPSCs.

Hepatozyten sind von großer Bedeutung in Klinik und Forschung. Da sie derzeit nicht kultiviert werden können wird vielfach versucht sie aus Vorläuferzellen zu generieren. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von zwei Stammzelllinien in einem xenogenen Transplantationsmodell mit immundefizienten Mäusen untersucht. Verwendet wurden Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut und vordifferenzierte humane Monozyten, sogenannte Neohepatozyten. Es wurden jeweils 750.000 dieser Zellen in die Leber von NOD/SCID-Mäusen transplantiert und die Lebern im Verlauf explantiert. Die Identifikation der transplantierten Zellen im Gewebeschnitt gelang durch den Membranfarbstoff CM-DiI. Zur genetischen Charakterisierung wurde eine in situ Hybridisierung mit human- bzw. mausspezifischen Gensonden etabliert. So konnten die transplantierten Zellen sicher in den Mauslebern detektiert werden. Im Weiteren wurde immunhistochemisch humanes Albumin in Mauslebern nachgewiesen. Humanes Albumin diente als Differenzierungsmarker und zeigt eine Entwicklung der transplantierten Zellen in Richtung Hepatozyten an. Interessanterweise wurden bei der Analyse beider Zelllinien zwei Typen Humanalbumin-positiver Zellen beobachtet: Typ I Zellen traten meist in Gruppen auf, waren kleiner als Hepatozyten und trugen einen dichten, dezentral gelegenen Kern. Sie lagen im Parenchym oder in kleineren Gefäßen und waren in der Lage, wie Hepatozyten, Glycogen und Eisen zu speichern. Typ II Zellen traten einzeln auf und glichen in ihrer Form exakt den Hepatozyten. Durch die Kombination von Immunhistochemie und in situ Hybridisierung konnten die Humanalbumin-positiven Zellen genetisch charakterisiert werden. Typ I Zellen trugen einen menschlichen Kern. Ihre Entstehung kann durch Teildifferenzierung der Stammzellen erklärt werden. Typ II Zellen wiesen einen Mauskern auf. Ein möglicher Entstehungsmechanismus ist der horizontale Gentransfer nach Zerfall der transplantierten Zellen im Zuge einer Immunreaktion. Der formale Nachweis eines solchen Phänomens steht noch aus.

Hepatozyten sind von großer Bedeutung in Klinik und Forschung. Da sie derzeit nicht kultiviert werden können wird vielfach versucht sie aus Vorläuferzellen zu generieren. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von zwei Stammzelllinien in einem xenogenen Transplantationsmodell mit immundefizienten Mäusen untersucht. Verwendet wurden Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut und vordifferenzierte humane Monozyten, sogenannte Neohepatozyten. Es wurden jeweils 750.000 dieser Zellen in die Leber von NOD/SCID-Mäusen transplantiert und die Lebern im Verlauf explantiert. Die Identifikation der transplantierten Zellen im Gewebeschnitt gelang durch den Membranfarbstoff CM-DiI. Zur genetischen Charakterisierung wurde eine in situ Hybridisierung mit human- bzw. mausspezifischen Gensonden etabliert. So konnten die transplantierten Zellen sicher in den Mauslebern detektiert werden. Im Weiteren wurde immunhistochemisch humanes Albumin in Mauslebern nachgewiesen. Humanes Albumin diente als Differenzierungsmarker und zeigt eine Entwicklung der transplantierten Zellen in Richtung Hepatozyten an. Interessanterweise wurden bei der Analyse beider Zelllinien zwei Typen Humanalbumin-positiver Zellen beobachtet: Typ I Zellen traten meist in Gruppen auf, waren kleiner als Hepatozyten und trugen einen dichten, dezentral gelegenen Kern. Sie lagen im Parenchym oder in kleineren Gefäßen und waren in der Lage, wie Hepatozyten, Glycogen und Eisen zu speichern. Typ II Zellen traten einzeln auf und glichen in ihrer Form exakt den Hepatozyten. Durch die Kombination von Immunhistochemie und in situ Hybridisierung konnten die Humanalbumin-positiven Zellen genetisch charakterisiert werden. Typ I Zellen trugen einen menschlichen Kern. Ihre Entstehung kann durch Teildifferenzierung der Stammzellen erklärt werden. Typ II Zellen wiesen einen Mauskern auf. Ein möglicher Entstehungsmechanismus ist der horizontale Gentransfer nach Zerfall der transplantierten Zellen im Zuge einer Immunreaktion. Der formale Nachweis eines solchen Phänomens steht noch aus.

Cell therapy is a novel potential approach to treat many diseases including diabetes. Embryonic stem cells have been examined in various diabetic and non-diabetic heart studies. However, the role of pancreas transcription factor 1 alpha (ptfla) over expressing embryonic stem (ES) cells has not been defined. We hypothesize that transplanted over expressing ptfla-ES cells in streptozotocin (STZ) induced diabetic mice will attenuate cardiac hypertrophy, fibrosis, and improve cardiac function. In this investigation we divided C57/bl6 mice into three groups: Control, STZ, and STZ + ptflaES cells. Diabetes was induced with STZ (lO0mg/kg, body weight), with two separate injections on day 1 (D1) and D2. Following STZ injections, mice were transplanted with 1.2 million ptfla-ES cells in three days. Control group received normal saline. After injections, animals were examined for glucose levels, cardiac hypertrophy, fibrosis, and heart function. Our data shows that glucose levels were significantly increased following STZ injections, suggesting diabetes, and this increase was reversed with transplanted ptfl a-ES cell. Our H&E qualitative data suggest that there was increase in cardiac hypertrophy in STZ-induced diabetic animals compared with control. Moreover, Massan's trichrome staining shows increased amount of cardiac fibrosis in STZ-induced diabetic animals compared with control. This data suggests that animals have developed diabetic cardiomyopathy. Interestingly, the increased cardiac hypertrophy and fibrosis was attenuated in the animals transplanted with ptfl a-ES cells. Furthermore, cardiac function examined by echocardiography was reduced in the STZ treated animals which was reversed following ptfla-ES cell treatment. In conclusion, our data suggests that