Münster (Westfalen), Universiẗat, Diss., 2001.

Hannover, Universiẗat, Diss., 2003.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

Stuttgart, Univ., Diss., 2005.

Darmstadt, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Das Nebennierenrindenkarzinom (ACC) ist eine sehr seltene maligne Erkrankung, die mit einer infausten Prognose vergesellschaftet ist. In Zeiten apparativ geprägter Medizin treten suspekte Befunde der Nebenniere gehäufter auf als je zuvor. Diese Nebennierenraumforderungen, die zumeist bei Bildgebungen auffallen, die aus anderen Gründen indiziert waren, werden Nebenniereninzidentalome genannt und sind meist benigne Befunde. Dennoch wird es angesichts dieser steigenden Zahl an Inzidentalomen immer wichtiger, die Entität der gefundenen Raumforderung schnell zu sichern, um die entsprechende Therapie einleiten zu können. Somit sollen das Zeitfenster bis zur Krebstherapie verkleinert und gleichsam unnötige chirurgische Eingriffe bei Patient*innen mit benignen Nebennierentumoren vermieden werden. Um die diagnostischen Schritte weiter zu verbessern, wurde in der vorliegenden Arbeit eine bioinformatische Regressionsanalyse an Steroidhormonkonzentrationen von ACC-Patient*innen und Kontrollen durchgeführt und der diagnostische Wert der berechneten Steroidsignaturen untersucht. Dabei zeigte sich im geschlechtsspezifischen Modell jeweils eine 6-Steroid-Signatur mit bester Trennschärfe zwischen benignen und malignen NN-Befunden. So konnte mit der 6-Steroid-Signatur in der männlichen Patientengruppe mit einer Sensitivität von 80% und Spezifität von 97%, in der weiblichen Patientinnengruppe mit einer Sensitivität von 78% und Spezifität von 97% die Diagnose richtig zugewiesen werden. Im Rahmen der targeted Metabolomics Untersuchung konnten Tumor-assoziierte Stoffwechselalterationen aufgezeigt werden. Eine Plasma-Metabolit-Signatur zur Differenzierung von ACCs und Nebennierenadenomen, welche die gängige Diagnostik bei der Abklärung von unklaren Nebennierentumoren erleichtern könnte, erscheint jedoch angesichts der großen Anzahl an zu bestimmenden Metaboliten - auch unter ökonomischen Gesichtspunkten - zu diesem Zeitpunkt noch nicht mit der Routine-Patient*innenversorgung vereinbar. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a very rare malignant disease and is associated with poor prognosis. Suspicious findings of the adrenal gland occur more frequently than ever before. Adrenal mass which is detected on imaging that is not performed for suspected adrenal disease is called adrenal incidentaloma. In most cases adrenal incidentalomas reveal benign findings. Malignancy is rare. Nevertheless, in view of this increasing number of incidentalomas diagnostic tools are needed to be able to initiate the appropriate therapy. In order to further improve the diagnostic steps, a bioinformatic regression analysis of steroid hormone concentrations of ACC patients and controls was carried out in the present work and the diagnostic value of the calculated steroid signatures was examined. The gender-specific model revealed a 6-steroid signature to be most discriminative between benign and malignant adrenocortical tumors. Thus, by applying the 6-steroid signature in the male patient group diagnosis could be correctly assigned with a sensitivity of 80% and specificity of 97%, in the female patient group with a sensitivity of 78% and specificity of 97%. As part of the targeted metabolomics examination, tumor-associated metabolic alterations were detected. However, a plasma metabolite signature for the differential diagnosis of adrenocortical tumors does not yet seem compatible with routine patient care regarding the large number of metabolites to be determined - also from an economic point of view.

Tumors of the adrenal gland belong to the most frequent neoplasms in humans with a prevalence of 3–10 % in adults. The aim of the diagnostic workup is the identification of potentially hormone-secreting and / or malignant tumors, because most of these tumors will require surgical resection. Malignant adrenocortical carcinomas (ACC) are very rare and associated with a poor prognosis in advanced stages, therefore, an early and accurate diagnosis is crucial. Within this thesis, two liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methods for the quantification of steroids in different biomaterials were developed to improve the diagnostic workup of adrenal tumors. First, an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of cortisol and dexamethasone in serum samples after dexamethasone suppression test (DST) was developed, validated, and applied to 400 clinical samples. Newly established method-specific threshold concentrations for cortisol and dexamethasone increased DST specificity from 67.5 % to 92.4 % while preserving 100 % sensitivity. Second, an LC-MS/MS method for the quantification of eleven urinary steroids was developed and validated to improve the differentiation between ACC and adrenocortical adenomas (ACA). A decision tree requiring only two steroids was trained for classification and tested based on 24 h urine samples from 268 patients with adrenal tumor. Malignancy was excluded with a negative predictive value of 100 % in an independent validation cohort of 84 samples of 24-h urine. A newly proposed simplified diagnostic workflow with urinary steroid profiling as first tier test could obviate additional adrenal-specific imaging in 42 of 64 patients with ACA. The new DST method is already in clinical use at the University Hospital Würzburg, whereas the classification model based on urinary steroid profiling will require prospective validation in a larger cohort. / Nebennierentumoren gehören zu den häufigsten Neoplasmen beim Menschen und treten mit einer Prävalenz von 3–10 % bei Erwachsenen über 50 Jahren auf. Häufig wird die Raumforderung zufällig im Rahmen einer bildgebenden Untersuchung erkannt. Die meisten dieser sogenannten Inzidentalome sind gutartige und hormoninaktive Nebennierenrindenadenome (ACA), die keine therapeutische Intervention erfordern. Das Ziel der Nebennierentumor-Diagnostik ist die Abklärung potentieller Hormonaktivität und Malignität, denn diese Tumoren müssen zum Großteil operativ entfernt werden. Hormonaktive Tumoren können benigne oder maligne sein und sind durch die autonome Sekretion von Steroidhormonen charakterisiert. Maligne Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind sehr selten, aber aggressiv und mit einer schlechten Prognose im fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert. Da die therapeutischen Möglichkeiten für das ACC limitiert sind, ist eine schnelle und sichere Diagnostik erforderlich. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden zur Quantifizierung von Steroiden in Biomaterialien entwickelt, um damit die Diagnostik von Nebennierentumoren zu verbessern. Der 1 mg-Dexamethason-Hemmtest (DST) ist ein häufig durchgeführter Screening-Test zur Untersuchung auf autonome Cortisolsekretion. Dabei wird die Supprimierbarkeit der Cortisolsekretion durch die orale Einnahme von Dexamethason überprüft. Eine LC-MS/MS Methode zur simultanen Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason im Serum wurde entwickelt, validiert und zur Messung von 400 DST-Patientenproben genutzt. Durch methodenspezifische Schwellenwertkonzentrationen für Cortisol und Dexamethason konnte die klinische Testspezifität von 67.5 % auf 92.4 % bei unveränderter Sensitivität von 100.0 % erhöht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der Unterscheidung von ACC und ACA. Dafür wurde eine LC-MS/MS Methode zur Quantifizierung von elf Steroiden im Urin entwickelt und validiert. Über die Messung von 24 h Sammelurinproben von 268 Nebennierenrindentumor-Patienten wurde ein Klassifikationsmodell, das auf nur zwei Steroiden basiert, trainiert und getestet. Sowohl die analytische Methode als auch das Klassifikationsmodell wurden hinsichtlich Robustheit und Zeiteffizienz optimiert, um sich möglichst gut in die klinische Routine implementieren zu lassen. Außerdem lag der Fokus auf einer einfachen, nachvollziehbaren und direkten Datenauswertung und -interpretation. Als ein Hauptergebnis konnte Malignität in einer unabhängigen Validierungskohorte von 84 Patienten mit einem negativen prädiktiven Wert von 100 % ausgeschlossen werden. Nach einem vereinfachten diagnostischen Schema mit der Urin-Steroid-Analytik als erstem Screening-Test könnte bei 42 von 64 Patienten mit ACA auf eine zusätzliche nebennierenspezifische Bildgebung verzichtet werden. Des Weiteren wurden erstmals Spontanurinproben als Surrogatmatrix für 24 h Sammelurin in der Validierungskohorte getestet. Dabei unterschied sich der positive prädiktive Wert der Spontanurine mit 86.7 % kaum von den 87.5 % der 24-h Sammelurine, während auch mit Spontanurin ein negativer prädiktiver Wert von 100 % erzielt werden konnte, was einen wichtigen Schritt in die Richtung einer vereinfachten Probensammlung darstellt. Sowohl die simultane Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason als auch die 24-h Urin-Steroid-Methode haben ihre Eignung für die klinische Routineanwendung bewiesen. Der Transfer der Urinmethode auf den deutlich einfacheren Spontanurin erfordert jedoch eine prospektive Validierung in einer größeren Patientenkohorte. Die neue DST-Methode wurde bereits im September 2021 in die klinische Routine am Universitätsklinikum Würzburg eingeführt.

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In Deutschland werden jährlich über 40 Millionen männliche Eintagsküken aus Legelinien aufgrund vorrangig wirtschaftlicher Interessen getötet. Dies stellt sowohl ein ethisches als auch ein tierschutzrechtliches Problem dar (ANON. 2006, IDEL 2007). Gerade vor dem Hintergrund aktueller politischer Entscheidungen (MUNLV NRW 2013, NI MELV 2014) besteht ein Bedarf an Alternativen zur Tötung männlicher Eintagsküken. Verschiedene Lösungsansätze wie z. B. das Zweinutzungshuhn (ICKEN et al. 2013) oder aber die Mast männlicher Geschwisterhühner (KAUFMANN und ANDERSSON 2013) sind derzeit aus ökonomischen und ökologischen Gründen nicht flächendeckend realisierbar. Eine weitere Möglichkeit bietet die In-ovo-Geschlechtsbestimmung. Hierbei wird das embryonale Geschlecht bereits vor dem Schlupf identifiziert; nachfolgend können die Eier mit männlichen Embryonen aussortiert werden. Um sowohl ethischen als auch tierschutzrechtlichen Aspekten Genüge zu tun, sollte die Geschlechtsidentifikation dabei vor Einsetzen des embryonalen Schmerzempfindens stattfinden (Tag 10 + 12 h der Bebrütung; CLOSE et al. 1997). Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer verlässlichen Methode zur In-ovo-Geschlechtsbestimmung anhand geschlechtsspezifischer Differenzen im Hormongehalt der Allantoisflüssigkeit sieben bis zehn Tage alter Hühnerembryonen. Nachfolgend wurde der Einfluss der Geschlechtsbestimmung auf die embryonale Entwicklung, Schlupferfolg, Aufzucht sowie die Leistungsparameter der adulten Tiere analysiert. Im Rahmen der ersten Teilstudie erfolgte die Beprobung von n = 750 Eiern des Braunlegehybrids Lohmann Brown (LB, Lohmann Tierzucht GmbH, Deutschland). Der minimalinvasiven Entnahme von Allantoisflüssigkeit folgte die Untersuchung auf 17β-Östradiol (E2), Östronsulfat (E1S) und Testosteron mittels an das Haushuhn angepassten Enzymimmunoassays (ELISA). Es konnten sowohl für E2 als auch für E1S signifikante (p < 0,01) geschlechtsspezifische Differenzen in der Allantoisflüssigeit von neun und zehn Tage alten Embryonen nachgewiesen werden. Die Testosteronkonzentration hingegen zeigte an keinem der untersuchten Tage geschlechtsabhängige Unterschiede und erwies sich somit für die In-ovo-Geschlechtsbestimmung als ungeeignet. Die statistische Auswertung ergab, dass die Bestimmung von E1S eine frühere und genauere Geschlechtsidentifikation ermöglicht als die von E2. Der für E1S festgelegte Grenzwert erreicht bei neun Tage alten Embryonen eine 86%ige Sensitivität und 83%ige Spezifität. In der zweiten Teilstudie wurde die zuvor etablierte Technik der Geschlechtsbestimmung mittels E1S an 8 + 4 h (n = 2420) und 9 + 4 h (n = 2850) Tage alten Embryonen der Herkunft LB sowie an n = 150 9 + 4 h alten Embryonen des Weißlegehybrids Lohmann Selected Leghorn (LSL, Lohmann Tierzucht GmbH, Deutschland) überprüft. Das Geschlecht der 8 + 4 h Tage alten Embryonen konnte zu 84 % korrekt identifiziert werden. Dieser Wert stieg bei 9 + 4 h Tage alten Embryonen auf 98 % (LB) bzw. 100 % (LSL) an. Im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollgruppe (n = 5258) wurde die Schlupfrate durch die Entnahme von Allantoisflüssigkeit um 1,4 - 3,5 (LB) bzw. 12,7 Prozentpunkte (LSL) reduziert. Nachfolgend wurden 150 Tiere der Versuchsgruppe und 80 Tiere der Kontrollgruppe für eine Aufzuchtperiode von 17 Wochen eingestallt. Hierbei zeigten sich hinsichtlich des Körpergewichtes signifikante (p < 0,05) Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe in Woche 4 und 6, wobei die Zunahmen in der Versuchsgruppe geringer waren. Anschließend wurde die Leistung von 120 Tieren der Versuchsgruppe und 60 Tieren der Kontrollgruppe bis Lebenswoche 33 bezüglich Legeleistung, Eigewicht, Körpergewicht sowie Futterverbrauch analysiert. Bei keinem der untersuchten Parameter konnten signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden (p > 0,05). Die Resultate der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine verlässliche Geschlechtsbestimmung in ovo bei 9 + 4 h Tage alten Hühnerembryonen mithilfe einer Bestimmung der E1S-Konzentration in der Allantoisflüssigkeit möglich ist; zudem ist die beschriebene Methode bei verschiedenen Legelinien anwendbar. Die Entnahme von Allantoisflüssigkeit führt zwar zu einer minimalen Reduktion der Schlupfrate, bei adulten Legehennen kommt es jedoch zu keiner Beeinträchtigung der Produktionsleistung. Demnach erfüllt das etablierte Verfahren alle Grundvoraussetzungen für eine Anwendung in kommerziellen Brütereien. Da die Geschlechtsbestimmung vor Einsetzen des embryonalen Schmerzempfindens erfolgt, kann sie somit als Grundlage für eine ethisch vertretbare Alternative zum Töten männlicher Eintagsküken angesehen werden. / In Germany about 40 million day-old male chicks are culled each year predominantly because of economic reasons. From the animal welfare as well as the ethical point of view this is a problematic situation (ANON. 2006, IDEL 2007). Particularly with regard to current political decisions (MUNVL NRW, NI MELV 2014) alternatives to the culling of male day-old chicks are required. Different approaches such as a dual-purpose breed (ICKEN et al. 2013) or the fattening of male layer-hybrids (KAUFMANN and ANDERSSON 2013) are not ubiquitous marketable at present due to economic and ecological reasons. In ovo sexing represents another option; the embryonic gender is determined before hatch and the eggs containing male embryos can be eliminated subsequently. To comply with ethical and animal welfare aspects, the sexing should take place before the onset of embryonic pain perception (embryonic day 10 + 12 h; CLOSE et al. 1997). Aim of this thesis was the development of a reliable method for in ovo gender identification with the help of sex-specific differences in the hormone concentration of the allantoic fluid of seven to ten day old chick embryos. Subsequently, the influence of gender identification on embryonic development, hatching rate, rearing as well as production performance of the adult hens was analysed. Within the first study n = 750 eggs of the brown layer-hybrid Lohmann Brown (LB; Lohmann Tierzucht GmbH, Germany) were sampled for allantoic fluid. After the minimally invasive withdrawal the allantoic fluid was analysed via enzyme immunoassays (ELISA) adapted to domestic chicken for 17β-oestradiol (E2), oestrone sulphate (E1S) and testosterone. With regard to E2 and E1S, significant (P < 0.01) sex-specific differences were observed in the allantoic fluid of nine and ten day old embryos. Testosterone on the other hand displayed no gender-related variances on any of the analysed days. Therefore, it proved to be unsuitable for gender identification using the method applied in this study. Statistical analysis showed that the analysis of E1S allows an earlier and more accurate sexing than the E2-assay. The limit value determined for E1S has a sensitivity of 86 % and a specificity of 83 % for nine day old embryos. The previously established method for gender identification via E1S detection in the allantoic fluid was verified with a larger number of samples in the second study. The allantoic fluid of day 8 + 4 h (n = 2420) and day 9 + 4 h (n = 2850) old LB embryos as well as n = 150 day 9 + 4 h old embryos of the white layer-hybrid Lohmann Selected Leghorn (LSL; Lohmann Tierzucht GmbH, Germany) was analysed. For day 8 + 4 h old embryos the sex was correctly identified in 84 %. The accuracy of gender prediction increased for day 9 + 4 h old embryos up to 98 % (LB) and 100 % (LSL). Compared to an untreated control group (n = 5258) sampling of allantoic fluid reduced the hatching rate by 1.4 - 3.5 (LB) and 12.7 points of percentage (LSL). In the following, 150 animals of the experimental group and 80 animals of the control group were reared for a period of 17 weeks. With regard to the body weight significant differences (P < 0.05) were observed in weeks 4 and 6, with the animals of the experimental group having a lower body weight. Subsequently the production performance of 120 hens from the experimental and 60 hens from the control group was analysed up to an age of 33 weeks. With respect to egg production, egg weight, body weight and feed consumption no significant differences (P > 0.05) were observed between the groups. The results of this thesis demonstrate that a reliable in ovo sexing of day 9 + 4 h old chicken embryos is possible via the measurement of E1S in the allantoic fluid; additionally the method is not limited to a certain layer strain. The sampling of allantoic fluid reduces the hatching rate only marginally. The production performance of adult hens on the other hand is not affected. Therefore, the described technique fulfils all the basic requirements for an alternative method to the culling of day-old male layer chicks. Because gender identification takes place before the onset of embryonic pain perception it can serve as the basis for an ethical alternative to the culling of male day-old chicks from layer-hybrids.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.