Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch verändert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gefährlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gefährdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgeführt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit beschäftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Darüber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht. Aufgrund aktueller Diskussionen über die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilität des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgeführt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 für die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird hauptsächlich der Carbonsäureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung hauptsächlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die höchste Affinität zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am stärksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, lässt sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erklären. Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. Für die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zunächst verschiedene Modellsubstrate ausgewählt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Darüber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswelliasäure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilität im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigsäure zur Stopplösung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivität bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 % lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko für Arzneimittelinteraktionen dar. Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardmäßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher für jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zusätzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit für ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden können. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate für CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilität der CYP-Enzyme über 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivität verlieren, insbesondere CYP1A2. Für eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen für die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten über deren Isoenzymselektivität vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivität von zwölf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. Für Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Schöllkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabhängig die CYP-Enzyme, am stärksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C. Als In-vitro-Substrate für CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz häufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren hauptsächlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die höchste Affinität besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 hauptsächlich durch CYP3A4 katalysiert. Die höchsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden für die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. Für 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit für die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich höher. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. für Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen Fällen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie können demnach nicht für Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz für Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht möglich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit längeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist. Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierfür ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivität für die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate für weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierfür wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einführung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) führte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verstärkte die Selektivität zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat für CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden können. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit lässt sich die Proteinkonzentration minimieren. Für die überwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate können daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und können für ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings müssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung während der Inkubation zu ermöglichen. In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizität von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu können. Hierfür werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutaminsäure bei positiver Polarität mit einer vergleichbaren Signalintensität auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. Für die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, während die Toxifizierung von Paracetamol hauptsächlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auffällig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine Sättigung der Umsetzung auftrat. Durchgeführte Molekülveränderungen am Glutathion, wie die Einführung eines Dansylrestes oder eines Biotins, führten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht für eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. Für eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochauflösende Massenspektrometrie erforderlich. Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), über deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der häufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. Für die Kalibrierung wurden zunächst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgeführten diskontinuierlichen Assays stellte die häufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion während der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die höchste Aktivität. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte für die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacrynsäure, für das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivität beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgewählten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgeführt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgeprägte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie für die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der Störung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse für die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden. Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoesäure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die höchste Aktivität besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die überwiegende Zahl der ausgewählten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden. Fazit In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion können mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. Für alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Darüber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse über die Isoenzymselektivität dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivität von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können für die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die für eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinemäßig eingesetzt werden. / Drugs are biochemically transformed by different xenobiotic metabolising enzymes after their application to humans. The inhibition of these enzymes, e. g. by grapefruit juice or a coadministrated drug, especially drugs with a small therapeutic range, for example theophylline or phenprocoumon, can result in serious side effects. Especially endangered are multimorbid patients, who get a therapy with multiple drugs. To examine the metabolism of new therapeutic agents and their potential for interactions, in-vitro-experiments will be done with tissue fractions or individual enzymes. In inhibition assays the influence of the drug on the transformation of the test substrate will be investigated. A major part of this work deals with the development of methods to test the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, like cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes), glutathione S-transferases (GSTs) and carboxylesterases (CES). Thereby, a characterisation of the test substrates was performed. In addition the bioactivation of clopidogrel and the formation of reactive metabolites were investigated. Due to current discussions about the interaction between clopidogrel and omeprazole, the bioactivation of clopidogrel was investigated by LC/MS/MS analysis and recombinant CYP enzymes or human liver microsomes. Because of the instability of the active metabolite a derivatisation of the incubated samples with dimedone were carried out. The investigation shows, that the transformation to 2 oxo-clopidogrel is catalysed by several CYP enzymes. Beside CYP2C19, the enzymes CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 and CYP3A4 are involved. With selective inhibitors CYP3A4 could be identified for the formation of the active metabolite from 2-oxo-clopidogrel. In addition to the biotransformation by CYP enzymes the carboxylic acid ester of clopidogrel is mainly hydrolysed. Incubations with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases shows, that the hydrolysis of the ester is catalysed by CES1. Furthermore the metabolism of omeprazole was investigated. The results show, that the 5-hydroxylation and the 5-O-demethylation mainly is carried out by CYP2C19 and CYP2D6. Thereby omeprazole has the highest affinity to CYP2C19. In contrast, the formation of omeprazole sulfone is catalysed especially by CYP3A4. With the aid of established inhibition assays for CYP enzymes the influence of clopidogrel and omeprazole on nine different CYP enzymes was investigated. Clopidogrel inhibits CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) and CYP3A4 (IC50 = 2.8 µM). Omeprazole inhibits especially CYP2C19 (IC50 = 2 µM) and CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Subsequent, the influence of omeprazole on the formation of 2-oxo-clopidogrel was also investigated. However, the bioactivation of clopidogrel was decreased by concentrations of omeprazole higher than 10 µM. Here mostly CYP2C19 was inhibited with an IC50 value of about 100 µM. Due to the poor inhibition of CYP2C19 caused by omeprazole and the fact, that several CYP enzymes catalyse the formation of 2-oxo-clopidogrel, the loss of the pharmacological effect of clopidogrel during the simultaneous intake of omeprazole can not be explained with the inhibition of CYP2C19. A previously insufficient investigated class of xenobiotic metabolising enzymes are carboxylesterases (CES) which especially play an important role in the bioactivation of ester prodrugs. For the development of inhibition assays different artificial substrates were selected. After the incubation with human tissue fractions and recombinant carboxylesterases the metabolites were quantified via HPLC/UV-analysis. It was demonstrated that methyl 4-nitrobenzoate and mycophenolate mofetil are selectively hydrolysed by CES1. The hydrolysis of phenyl acetate, p nitrophenyl acetate and 4-methylumbelliferyl acetate was catalysed by all enzymes used. Furthermore the hydrolysis of 3-O-acetyl-11-keto--boswellic acid, which can be isolated from various Boswellia species, by CES2 was obtained. Because of the instability of the most artificial substrates in the incubation buffer, a correction with a blank value was necessary. A decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the addition of acetic acid to the termination solvent retards the hydrolysis. Afterwards the influence of the inhibitory activities of plant extracts on the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate was investigated. The results shows, that numerous plant extracts inhibits esterases of the human liver and the activity with an extract concentration of 25-50 µg/ml is widely below 50 percent. Thus the inhibition of CES caused by plant extracts is until now an unknown risk of drug interactions. Cytochrome P450 enzymes (CYP enzymes) are the most important class of xenobiotic metabolising enzymes. To investigate the influence of these enzymes due to new active substances standardised in vitro interaction studies will be performed. Thus the Food and Drug Administration (FDA) has suggested several drugs as test substrates for each CYP isoform. Additional artificial substrates are used in such studies. The metabolites of these substrates are fluorescent and therefore they are suitable for high-throughput screening analysis in multiwell plates. In this work, a series of artificial substrate (derivatives of coumarin and harmane) were investigated to their applicability as substrates for CYP inhibition assays. After the development of methods to detect the metabolites, which was done by LC/MS/MS- or HPLC/fluorescence analysis, the CYP isoforms for the transformation of the substrates were identified. With the aid of CYP enzymes and human liver microsomes the Km values were determined. The stability testing of the CYP enzymes during 60 min shows, that they strongly lose their activity at 37 °C, especially CYP1A2. For the maximum reaction velocity, a NADPH concentration of 1 mM was sufficient. The investigation of 14 standard substrates shows, that the majority was metabolised by a single CYP enzyme. The amodiaquine N-deethylation, the tolbutamide hydroxylation, the chlorzoxazone 6-hydroxylation and the 4 nitrophenole 2-hydroxylation were catalysed by several CYP isoforms. As positive control of the inhibition assays and for the identification of the CYP enzymes, which are involved in the metabolism, the FDA has also proposed several inhibitors. For many inhibitors there are no data of the selectivity to the CYP isoforms published. Therefore the inhibitory activity of 12 inhibitors with 9 different CYP enzymes by the established assays was investigated. All inhibitors inhibited the previously described CYP enzymes. For furafylline (CYP1A2), tranylcypromine (CYP2A6), clopidogrel (CYP2B6), montelukast (CYP2C8), sulfaphenazole (CYP2C9), quinidine (CYP2D6) and ketoconazole (CYP3A4) a concentration was found, which inhibited only one CYP enzyme. For quercetin, nootkatone, diethyldithiocarbamic acid, sertraline and ticlopidine an inhibition of several CYP enzymes was discovered. With the CYP inhibition assays liver toxic plant extracts of e. g. Tussilago farfara (coughwort) or Chelidonium majus (celandine) were investigated. All extracts inhibited the CYP enzymes concentration dependent, most intensive the enzymes of subfamily CYP2C. Coumarin derivatives are often used as in vitro substrates for CYP inhibition assays because of their high fluorescence. In this work 18 O-alkylated and O-benzylated derivatives of 7-hydroxycoumarin, 7-hydroxy-4-methylcoumarin and 7-hydroxy-4-trifluoromethylcoumarin were synthesised and the transformation due to several CYP enzymes was investigated with primarily optimised LC/LC/fluorescence-based assays. On the O-dealkylation of coumarin derivatives CYP1A2, CYP2B6 were mainly participated and to a lower extent CYP2C19, CYP2D6 and CYP2E1. The highest affinity had the substrates to CYP1A2. Debenzylations were catalysed mainly by CYP1A2 and CYP3A4. The highest reaction velocities were observed for the debenzylation of 7-benzyloxy-4-methylcoumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) and 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min). For 7-methoxy-4-trifluoromethylcoumarin (MFC) the conversion rate for the O-demethylation with CYP1A2 and CYP2B6 in comparison with CYP2C9 was explicitly higher. So MFC and 7-ethoxy-4-trifluoromethylcoumarin (EFC) are suitable substrates especially for CYP2B6. All analysed 7-alkyloxycoumarin derivatives are no selective substrates. Thus they cannot be used for inhibition studies with human liver microsomes. Also their application for the simultaneous determination of the inhibition of several CYP enzymes in one sample (cocktail assay) is not possible. The LC/MS-based analysis after the incubation of the coumarin derivatives showed, that beside the O dealkylated metabolites several hydroxylated metabolites are formed. In many cases the O-dealkylated metabolite is not the main metabolite, especially by derivatives with longer alkyl chains. An aim of our group is the development of new in vitro substrates for the investigation of the inhibition of CYP enzymes with improved kinetic and analytical properties. The basic structure is -carboline, because -carboline derivatives show a strong fluorescence. It is known about the natural product harmine, that it will be O demethylated by CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 and CYP2D6. Due to modifications of the harmane structure, the CYP isoform selectivity for the O-dealkylation should increase and substrates should receive for further CYP enzymes. For this, our working group synthesised e. g. 2-benzyl-7-benzyloxyharmane (BBH), 2-benzyl-7-methoxyharmane (BMH), 7-methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harmane (MCBH) and 2 methyl-7-methoxyharmane (MMH). In this work LC/LC/fluorescence- and LC/MS/MS methods were developed for quantification of the generated O dealkylated metabolites. The introduction of a benzyl residue at the phenolic hydroxyl group of harmol (BBH) caused a metabolism due to CYP3A4. The substitution with a carboxybenzyl residue on the indole nitrogen (MCBH) increased the selectivity to the subfamily CYP2C. With the methylation of the pyridine nitrogen a selective substrate for CYP2D6 was obtained. So this substrate is usable with human liver microsomes. Due to the high reaction velocity of MMH in comparison with other substrates of CYP2D6, the concentration of the protein can be minimized. The Km values of the CYP enzymes, which predominantly catalysed the O dealkylation of the harmane derivatives, were determined. The investigation of several CYP inhibitors showed, that with the new substrates comparable IC50 values to the standardised substrates were received. The harmane derivatives are suitable for the detection of the inhibition of important CYP enzymes. They are alternative substrates to the previously existing fluorescent substrates. With an adjustment of the pH value after incubation, the metabolites can be fluorimetrically detected in multiwell plates. So they are usable for high throughput screening. However, the fluorescence properties have to be improved for a continuous determination of the metabolite during the incubation. The pharmaceutical industry is interested in the detection of reactive metabolites to predict a potential liver toxicity of new drug candidates. For this purpose the test compounds will be incubated with human liver microsomes and the reactive metabolites will be trapped with glutathione. To optimise the LC/MS/MS analysis, the fragmentation of such adducts was investigated with standard substances. At positive polarity, all glutathione adducts showed a loss of pyroglutamic acid with comparable peak intensity. Therefore the detection of this fragment with a neutral loss scan is most practicable. With the aid of the screening method first drugs were investigated from which reactive metabolites are known. CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 were identified for the bioactivation of clozapine. The toxification of acetaminophen is mainly catalysed by CYP1A2 and CYP3A4. Conspicuous was the fact, that there was no saturation of the reaction velocity with increasing concentration of acetaminophen. Changes of the glutathione molecule like the introduction of a dansyl or a biotin residue do not seriously improve the detection of the reactive metabolites. Also it was shown, that the reaction of the labelled glutathione derivatives by GSTs is significantly reduced. With the developed screening methods many false positive signals were observed. So this method was not applicable for the investigation of extracts from liver toxic plants. For a definite and fast identification of signals as glutathione adducts the high resolution mass spectrometry is required. Another class of xenobiotic metabolising enzymes are glutathione S-transferases (GSTs). About their inhibition caused by drugs and plant extracts only a few information can be found in the literature. For the development of inhibition assays well known substrates like 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, 4-nitroquinoline N-oxide, 1,2 dichloro-4-nitrobenzene and 4-nitrobenzyl chloride were used. The metabolites were quantified by HPLC/UV- and LC/MS/MS analysis in contrast to the often used photometry. For the calibration of the methods first the appropriate glutathione conjugates were synthesised from the substrates. A problem of the discontinuous assays was the often arising non enzymatic reaction of the substrates with glutathione. With a decrease of the pH value of the incubation buffer from 7.4 to 6.5 and the reduction of incubation temperature from 37 °C to 25 °C the velocity of the non enzymatic reaction extensively slows down. The non enzymatic reaction in the samples after incubation could stopped by the addition of oxidants. For all substrates the cytosolic fraction showed the highest activity of all tested human liver tissue fractions. During the development of the assays the glutathione concentration, the protein concentration and the incubation time were optimised. The Km and Vmax values for the conversion of the substrates were determined. The also synthesised glutathione conjugate of ethacrynic acid was used as positive control, for that the IC50 values were determined with every substrate. Thereby the pH value of the incubation buffer and the incubation temperature influence the measured inhibitory activity. Following drugs, selected natural products and about 50 plant extracts were screened for the inhibition of GSTs with human liver cytosol and 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, that was conjugated with the highest conversion rate of all substrates. Of the natural products the distinctive inhibition of biflavonoids was noticeable. Nearly all tested plant extracts inhibits GSTs. A strong inhibition of the GSTs showed extracts from Cinnamomum cassia (cinnamomum), which is non-competitive. Furthermore an important inhibition caused by extracts from e. g. Hamamelis virginiana (witch hazel) or Krameria triandra (ratanhia) were observed. Here IC50 values between 5 and 30 µg/ml were obtained. A comparison of different methods for the detection of the metabolite 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione demonstrated, that photometry is not suitable for the investigation of the inhibition by plant extracts because of the interference caused by the plant matrix. With HPLC/UV- and the LC/MS/MS methods the metabolite could selectively be determined and reproducible results for the inhibition of GSTs by plant extracts were obtained. Besides GSTs the influence of glutathione reductase (GR) was also investigated in this work. An HPLC-based assay was developed, where the reduced glutathione has been derivatised with 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) and the resulted mixed disulfide of glutathione and 5-thio-2-nitrobenzoic acid has been quantified. For the examination of the inhibition by plant extracts, human liver cytosol was applied, which has the highest activity of all human liver tissue fractions. In comparison with GSTs, the GR was hardly inhibited by most of the selected plant extracts. A notable inhibition could only be obtained by extracts of Juglans regia (walnut). Conclusion In this work, many in vitro methods for the investigation of the inhibition of CYP enzymes and further xenobiotic metabolising enzymes like CES or GSTs were developed. On the basis of the selective HPLC-based quantification with UV-, fluorescence- or MS detection, samples with a complex matrix can be measured. For all assays the conditions for incubation were optimised and the kinetic parameters of many substrates were determined. In addition important information about the selectivity of isoenzymes was received. The suitability of the developed assays was demonstrated with standard inhibitors. Finally, the inhibitory activity of numerous plant extracts were determined, which effect on xenobiotic metabolising enzymes was previously unknown. The developed methods in this work are routinely applicable for the investigation of drug metabolism and the inhibition of xenobiotic metabolising enzymes, which are required for the marketing authorization.

Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites. miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed. In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices). / Dynamische Wechselwirkungen und deren Veränderungen sind wichtige Themen der aktuellen Forschung in Bioinformatik und Systembiologie. Diese Promotionsarbeit konzentriert sich auf zwei besonders dynamische Aspekte der zellulären Anpassung: miRNA und Metabolite. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und Megakaryozytopoese, und die Thrombozyten miRNAs helfen uns, grundlegende Mechanismen der Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Die Arbeit analysiert die potentielle Rolle von miRNAs bei der Proteintranslation, der Thrombozytenlebensdauer sowie der Apoptose von Thrombozyten und ermöglichte die Identifizierung von beteiligten Signalwegen und möglicher regulatorischer Schlüsselmoleküle. Darüber hinaus wurden entsprechende miRNA / Ziel-mRNAs in murinen Thrombozyten systematisch gesammelt. Zudem wurden wichtige miRNAs, die am Aortenaneurysma beteiligt sein könnten, durch ähnliche Techniken vorhergesagt. Die klinische Relevanz von miRNAs als Biomarker, und resultierende potentielle Therapeutika, etwa über eine gewebsspezifische Beeinflussung der Genexpression bei Herz-Kreislauf Erkrankungen wird ebenfalls diskutiert. In einem zweiten Teil der Dissertation wird die Bedeutung der Entwicklung wissenschaftlicher Softwarelösungen für die Stoffwechselmodellierung aufgezeigt, mit einer Software-Feature-Analyse wurden verschiedene Softwarelösungen in der Bioinformatik verglichen. Wir vorgeschlagen dann den "Butterfly"-Ansatz, um effiziente wissenschaftliche Software-Programmierung zu implementieren. Mit diesem Ansatz wurden für die quantitative Stoffflussanalyse mit Isotopomeren effiziente Software-Anwendungen und ihre Datenverwaltung entwickelt: LS-MIDA ermöglicht eine einfache und effiziente Analyse, die Software "Isotopo" ermöglicht mit einem leistungsfähigeren Algorithmus und einer Datenbank, eine noch effizientere Analyse von Stoffwechselflüssen, zum Beispiel in pathogenen Bakterien (Salmonellen, Listerien). Alle drei Ansätze wurden bereits veröffentlicht (siehe Appendix).

Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob der Stoffwechsel kolorektaler Karzi-nomzellen geeignete Targetstrukturen für mögliche therapeutische Ansätze aufweist. In Krebszellen induziert sowohl der Warburg-Effekt bei Normoxie als auch die anaerobe Glykolyse bei Hypoxie eine massive Bildung von Laktat. Wird die Krebszelle dauerhaft daran gehindert, die für die Glykolyse notwendi-gen Reduktionsäquivalente NADH+H+ mit Hilfe der Laktatdehydrogenase zu reoxidieren und/oder Laktat über die Transporter MCT1 und MCT4 nach außen zu schleusen, dann löst diese Kombination aus Mangelsituation und intrazellulärer Ansäuerung den apoptotischen Zelltod aus. Für die Situation in vivo ist entscheidend, dass auch Zellen von Normalgeweben zwar Laktat in Hypoxie bilden, dies jedoch keine vorherrschende physiologische Situation darstellt. Die Hemmstoffe Natriumoxamat (NaOx) für die Laktatdehydrogenase und α-Cyano-4-Hydroxycinnamat (αCHC) für MCT1 und MCT4 wurden an den sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 und WiDr untersucht. Zusätzlich wurde der Glukoseverbrauch und die Laktatbildung bestimmt und die Funktion der Atmungskette überprüft. Die IC50-Werte für 5-FU, NaOx und αCHC wurden bestimmt und danach NaOx in einer Konzentration von 40x10-3 mol/L, αCHC in einer Konzentration von 2x10-3 mol/L und 5-FU in einer Konzentration von 5x10-6 mol/L eingesetzt. Die Zellen wurden bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % Sauerstoff für bis zu 120 Stunden inkubiert. Die Funktion der Atmungskette in den Mitochondrien der kolorektalen Karzi-nomzellen wurde u. a. durch Bestimmung wichtiger Kenngrößen wie dem P:O Quotienten und des respiratorischen Kontrollindex (RKI) nachgewiesen. Fünf der sechs Karzinomzelllinien wiesen im Vergleich zur Kontrollzelllinie J774 einen verringerten P:O-Quotienten und respiratorischen Kontrollindex (RKI) auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Mitochondrien dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zwar verringert war, aber nicht vollständig aufgehoben. Dieses Ergebnis stützt die allgemein akzeptierte Auffassung, dass die meisten Tumore über funktionelle Mitochondrien verfügen. Durch die Analyse des Glukosestoffwechsels wurden die sechs kolorektalen Zelllinien, die einen unterschiedlich stark ausgeprägten glykolytischen Phänotyp aufwiesen, nach der Stärke der Laktatbildung bei 5 % Sauerstoff in drei Kategorien eingeordnet. Zudem wurde für jede der sechs Zelllinien die Expression von LDH-A, LDH-B sowie MCT-1 und MCT-4 auf Proteinebene nachgewiesen. Wesentliches Ziel der Untersuchungen war die Überprüfung des antiprolife-rativen Potentials der beiden Inhibitoren NaOx und αCHC einzeln oder in Kombination mit 5-FU bei den tumorspezifischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 %. Die Kombination aus NaOx und αCHC induzierte bei 1 % Sauerstoff nach 9 Tagen in Kultur zytotoxische Effekte und war damit so wirksam wie 5x10-6 mol/L 5-FU. Die Zugabe von 5-FU zur Kombination aus NaOx und αCHC führte zu keiner Steigerung des zelltoxischen Effektes. Die beiden Inhibitoren NaOx und αCHC waren für SW620 Zellen weniger wirksam als für Zellen der anderen fünf Zelllinien. Das mehr „oxidative“ Profil von SW620 Zellen (bester P:O-Quotient, geringste Laktatbildung bei 5 % und 1 % Sauerstoff; zudem die höchsten IC50-Werte für NaOx und αCHC) könnte erklären, warum die beiden Stoffwechselinhibitoren, die einen glykolytischen Phänotyp (starke Bildung von Laktat) erfordern, für SW620 Zellen von geringerer Wirksamkeit waren. Für die Hemmstoffe NaOx und αCHC wurden zytostatische bzw. zytotoxische Effekte in kolorektalen Karzinomzellen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Krebszellen auf einen ungehinderten glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind. Für beide Hemmstoffe wurde ebenfalls gezeigt, dass sie auch bei tumorre-levanten Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % wirksam sind. / The aim of the thesis was to investigate whether the metabolism of colorectal carcinoma cells can provide suitable target structures for possible therapeutic approaches. Both the Warburg effect, in the case of normoxia, and anaerobic glycolysis, in the case of hypoxia, induce a massive production of lactate in cancer cells. If a cancer cell can be permanently prevented from reoxidising reduction equivalents NADH+H+ with the help of lactate dehydrogenase, which is necessary for glycolysis, and/or the removal of lactate via the transporters MCT1 and MCT4 can be inhibited, then this combination of a deficiency and intracellular acidification results in the apoptotic death. As far as the in vivo situation is concerned, it is crucial that cells from normal tissue also produce lactate in hypoxia, but that this does not constitute a predominant physiological situation. Sodium oxamate (NaOx), an inhibitor for the lactate dehydrogenase and α-cyano-4-hydroxy cinnamate (αCHC), an inhibitor for MCT 1 and MCT 4 were examined in the six human colorectal carcinoma cell lines Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 and WiDr. In addition, glucose consumption and lactate production were determined as well as the function of the respiratory chain. The half maximal inhibitory concentration (IC50) for 5-FU, NaOx, and αCHC was determined and NaOx was used in a concentration of 40x10-3 mol/L, αCHC in a concentration of 2x10-3 mol/L and 5-FU in a concentration von 5x10-6 mol/L. The cells were incubated for up to 120 hours at tumour physiological concentrations of oxygen of 5% and 1%. The respiratory chain function in the mitochondria of colorectal carcinoma cells was verified by determining the P:O quotient and the respiratory control index (RCI), two important parameters for respiratory chain function. Five of the six carcinoma cell lines showed a reduced P:O quotient and respiratory control index (RCI), when compared to control cell line J774. These results indicate that the mitochondria of these cells were malfunctioning, but not fully defective. This finding supports the generally accepted view that most tumours possess functional mitochondria. By analysing the glucose metabolism of the six colorectal cell lines, which showed varying degrees of glycolytic phenotype,these cells were ranked into three categories according to the amount of lactate production at 5% oxygen. Moreover, the expression of LDH-A, LDH-B and MCT-1 and MCT-4 at protein level was confirmed for each of the six cell lines. The main focus of the work was to verify the antiproliferative potential of the two inhibitors NaOx and αCHC alone and in combination with 5-FU in the presence of tumour-specific oxygen concentrations of 5% and 1%. At 1% oxygen the combination of NaOx and αCHC induced cytotoxic effects after 9 days of culture, making it as effective as 5x10-6 mol/L 5-FU. The addition of 5-FU to the combination of NaOx and αCHC did not increase the cell-toxic effect. NaOx and αCHC were less effective for SW620 cells then in the other five cell lines. The more "oxidative" profile of SW620 cells (best P:O quotient, least amount of lactate production at 5% and 1% oxygen, and the highest IC50 values for NaOx and αCHC) might explain why the two metabolism inhibitors, which require a glycolytic phenotype (strong lactate production) were less effective in SW620 cells. Cytostatic or cytotoxic effects of the inhibitors NaOx and αCHC were demon-strated in colorectal carcinoma cells. This indicates that cancer cells are de-pendent on a functioning glycolytic metabolism. Both inhibitors were also effective in the presence of tumour-relevant oxygen concentrations of 5% and 1%.

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, die Frage zu beantworten, ob es nach einer einmaligen Gabe eines Glucocorticoidpräparates (Dexamethason-21-isonicotinat, Voren-Suspension) zu Veränderungen der Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten und der Monozyten bei Kühen im postpartalen Zeitraum kommt. Weiterhin sollte die Wirkung der Glucocorticoide in der Zeit von der Geburt bis 14 Tage p.p. auf hämatologische und klinisch-chemische Parameter bei diesen Tieren untersucht werden. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der klinischen Untersuchungen und die Krankheitsinzidenz im Zeitraum bis acht Wochen p.p. erfasst. Dazu wurden 103 Kühe in die Untersuchung einbezogen, von denen 52 Tiere innerhalb von 12 Stunden nach dem Kalben eine Dexamethasoninjektion (2 mg/100kg KM Voren) erhielten. Die Phagozytoseleistung der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten und der Monozyten wurde am Tag der Geburt (Tag eins) und zwei Tage p.p. (Tag drei) bei 34 Tieren bestimmt, von denen 17 Kühe als Versuchsgruppe und ebenso viele als Kontrollgruppe dienten. Für die Untersuchung wurde das Testkit zur quantitativen Bestimmung der Phagozytoseaktivitä von Moozyten und Granulozyten der Firma OPREGEN Pharma, Heidelberg verwendet. Es handelt sich hierbei um eine in vitro Technik, bei der der prozentuale Anteil der monozyten und Granulozyten (Aufnahme von Escherischia coli), die phagozytieren und die Phagozytoseaktivität (Anzahl der aufgenommenen Bakterien pro Zelle und Zeiteinheit) dieser Zellen bestimmt wurde. Die prozentualen Anteile der phagozytierenden neutrophilen Granulozyten stiegen in der Versuchsgruppe (75,57 % auf 86,49 %) und der Kontrollgruppe (77,23 % auf 80,04 %) an. Auch die Phagozytoseaktivität der neutrophilen Granulozyten stieg in Versuchsgruppe (2006 auf 2681) und Kontrollgruppe (1968 auf 2289) an. Bei beiden Parametern wies die Versuchsgruppe deutlichere Anstiege auf. Der Anstieg des prozentualen Anteils phagozytierender neutrophiler Granulozyten war signifikant (p < 0,05). Die Untersuchung der Phagozytoseparameter der Monozyten zeigte in der Kontrollgruppe einen Abfall sowohl des prozentualen Anteils (65,97 % auf 63,26 %) als auch der Phagozytoseaktivität (1262 auf 1220), während beide Parameter in der Versuchsgruppe anstiegen (63,39 % auf 69,51 % / 1144 auf 1379), was statistisch jedoch nicht gesichert werden konnte. Die Haptoglobinkonzentrationen zeigten in den Gruppen einen ähnlichen Verlauf. Nur am Tag 14 konnte ein signifikanter Gruppenunterschied nachgewiesen werden. Der Anti-Lipid-A-IgG-Antikörper-Titer stieg in beiden Gruppen im Untersuchungszeitraum an. Signifikante Gruppenunterschiede wurden nicht nachgewiesen. Die Parameter der klinischen Untersuchung zeigten keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Auch die tägliche Milchmenge und die Jahresmilchleistung wiesen keinen Einfluss der Glucocorticoidapplikation auf. Die Inzidenz der postpartalen Erkrankungen zeigte keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Das Differentialblutbild und die klinisch-chemischen Parameter lassen den gesicherten stoffwechselstabilisierenden Einfluss des Dexamethasons erkennen. Auf diese Weise wird die Abwehrfunktion der Kühe indirekt positiv durch die Glucocorticoide unterstützt. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass eine einmalige Glucocorticoidapplikation im Zeitraum bis 12 Stunden p.p. die Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten sowie der Monozyten nicht negativ beeinflusst. Deutlich nachweisbar sind die stabilisierenden Wirkungen der Glukokortikoide auf den Stoffwechsel. Durch die Untersuchung wird belegt, dass keine negativen Auswirkungen auf die Krankheitsinzidenz und die Laktationsleistung bei einer einmaligen Applikation zu befürchten sind. Aus diesem Grund erscheint es möglich die positiven Effekte z. B. auf den Stoffwechsel, besonders in dieser für Hochleistungstiere kritischen Phase, zu nutzen. / The study was meant to show if a single injection of dexamethasone (Dexamethason-21-isonicotinat, Voren-Suspension) would lead to changes in phagocytic activity of neutrophils and monocytes in peripartal cows. Additionally the influence of the glucocorticoid on haematological and clinic-chemical parameters was measured. Furthermore the results of clinical examinations and the incidence of diseases during eight week after parturition were estimated. The study was performed on 103 cows, 52 of these received an intramuscular injection of dexamethason within 12 hours after parturition (dexamethason-group), the 51 other cows were untreated as control (control-group). The phagocytic activity was measured in 34 cows (17 after treatment with dexamethason and 17 cows of the control group) on day 1 (parturition) and day 3. The phagocytic activity was estimated by measuring two parameters: overall percentage of monocytes and granulocytes showing phagocytosis and individual cellular phagocytic activity (number of bacteria per cell). From day 1 to day 3 the percentage of phagocytic granulocytes increased in the dexamethasone–group from 75,57 % to 86,49 % and in the control-group from 77,23 % to 80,04 %. The cellular phagocytic activity of granulocytes also increased in the dexamethasone-group from 2006 to 2681 and in the control group from 1968 to 2289 between days 1 and 3. The differences between days 1 and 3 were more prominent in both parameters in the dexamethasone-group. The percentage of phagocytic neutrophils increased significantly (P < 0,05). In the control-group, the phagocytic activity decreased in monocytes in the percentage (from 65,97 % to 63,26 %) as well as in the cellular phagocytic activity (from 1262 to 1220). In comparison, both parameters increased in monocytes in the dexamethasone-group (percentage: from 63,39 % to 69,51 %, cellular activity: from 1144 to 1379) between days 1 and 3. All changes in phagocytic activity of monocytes were not statistically significant. The concentrations of haptoglobin show a similar pattern in both groups, only on day 14 a significant difference occured. The anti-lipid-A- IgG-antibody-titre increased in both groups during the study period. Between both groups significant differences were not observerd neither in anti-lipid-A-IgG-antibody-titre nor in the clinical parameters. The application of dexamethasone did not show any influence on the milk yield or on the incidence of diseases in the peripartal period. On the other hand the effects of the glucocorticoid on the metabolic parameters and on the differential white blood cell count was remarkable. The results of the present study show that a single injection of glucocorticoids within 12 hours after parturition did not influence the phagocytic activity of neutrophils and monocytes negatively. The beneficial effects of a single injection on the metabolism is remarkably given without negative effects on milk yield or incidence of diseases. Therefore, it seems possible to benefit from the outstanding effects of glucocorticoids on metabolism (glucose, free fatty acids, bilirubin) in this critical early postpartal period in high yielding cows.

Freie Universiẗat, Diss.--Berlin, 2006. / Literaturverz. S. 173-200.

Zugl.: Berlin, Techn. Univ., Diss., 2009

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2009.

Zugl.: Leipzig, Univ., Diss., 2009

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2007

Humboldt-Univ., Diss.--Berlin, 2006.