Optical microscopy is a cornerstone of biomedical research. Advances in optical techniques enable specific, high resolution, sterile, and biologically compatible imaging. In particular, beam shaping has been used to tailor microscopy techniques to enhance microscope performance. The aim of this Thesis is to investigate the use of novel beam shaping techniques in emerging optical microscopy methods, and to apply these methods in biomedicine. To overcome the challenges associated with high resolution imaging of large specimens, the use of Airy beams and related techniques are applied to light-sheet microscopy. This approach increases the field-of-view that can be imaged at high resolution by over an order of magnitude compared to standard Gaussian beam based light-sheet microscopy, has reduced phototoxicity, and can be implemented with a low-cost optical system. Advanced implementations show promise for imaging at depth within turbid tissue, in particular for neuroscience. Super-resolution microscopy techniques enhance the spatial resolution of optical methods. Structured illumination microscopy is investigated as an alternative for electron microscopy in disease diagnosis, capable of visualising pathologically relevant features of kidney disease. Separately, compact optical manipulation methods are developed with the aim of adding functionality to super-resolution techniques.

Neutrophile sind die häufigsten weißen Blutkörperchen im menschlichen Blut. Sie bilden die erste Verteidigungslinie und töten eindringende Krankheitserreger ab. Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Strukturen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen und mit zytotoxischen Proteinen dekoriert sind. NETs können Mikroben in vitro und in vivo einfangen und abtöten, sind aber auch für verschiedene Krankheiten verantwortlich. Frühere Studien haben eine spezifische Gruppe von 20-50 Neutrophilenproteinen identifiziert, die an NETs gebunden sind und von denen einige eine mikrobizide Wirkung haben. Wie diese Proteine an die NETs binden, wie sie interagieren und wie die Bindung ihre antimikrobielle Aktivität beeinflusst, ist noch nicht bekannt. In dieser Dissertation habe ich die Verteilung von acht neutrophilen Proteinen und Nukleosomen auf NETs mit Hilfe der Superauflösungsmikroskopie untersucht. Es wurden drei unabhängige Techniken mit Auflösungen von mehr als 90 nm verwendet. Die Nukleosomen bildeten auf den NETs periodische Cluster mit deutlich größeren Abständen im Vergleich zum kondensierten Chromatin. Drei NET-Proteine waren ebenfalls in periodischen Clustern auf den NETs lokalisiert und zwei von ihnen waren stark mit Nukleosomen kolokalisiert. Alle anderen analysierten Proteine zeigten keine Muster der Bindung an NETs. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Bindung von Proteinen an NETs zumindest teilweise spezifisch ist und teilweise durch Wechselwirkungen mit Nukleosomen vermittelt wird. Die erfolgreiche Einführung der superauflösenden Mikroskopie für schwierige NET-Proben in Kombination mit einem vorgeschlagenen rekonstituierten NET-System eröffnet neue Möglichkeiten für das Verständnis der molekularen Mechanismen der NET-Bildung und der Protein-Protein-Interaktion bei der NET-vermittelten Abtötung. / Neutrophils are the most abundant human white blood cell in circulation. They are the first line of defense and kill invading pathogens. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are weblike structures composed of decondensed chromatin decorated with cytotoxic proteins. NETs can trap and kill microbes in vitro and in vivo, but also mediate several diseases. Previous studies identified a specific set of 20-50 neutrophil proteins bound to NETs, several with microbicidal activity. It remains unknown how these proteins bind to NETs, how they interact and how binding influences their anti-microbial activity. In this dissertation, I studied the distribution of eight neutrophil proteins and nucleosomes on NETs using super-resolution microscopy. Three independent techniques with resolutions larger than 90nm were used. Nucleosomes formed periodic clusters on NETs, with significantly larger spacing compared to condensed chromatin. Three NET proteins also localized in periodic clusters on NETs and two of them strongly co-localized with nucleosomes. All other proteins analyzed showed no patterns binding to NETs. Taken together, these findings demonstrate that, at least some, protein binding to NETs is specific and in part mediated by interactions with nucleosomes. The successful introduction of super-resolution microscopy to the challenging NET samples in combination with a proposed reconstituted NET system opens new possibilities to understand the molecular mechanisms behind NET formation and protein-protein interaction in NET mediated killing.