Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El valle de Aconcagua es una de las principales zonas agrícolas ubicada en la región de Valparaíso, Chile. La minería del cobre y el empleo de agroquímicos que contienen cobre, ha provocado un incremento en la concentración de este metal en este sector. La presencia de cobre en los suelos disminuye la biomasa y la actividad metabólica bacteriana provocando un menor rendimiento de los procesos biogeoquímicos en los que las bacterias participan. Esto conlleva a una pérdida de la fertilidad de los suelos agrícolas y daños en el ecosistema. En esta tesis se postula que la presencia de cobre en altas concentraciones en los suelos agrícolas de la región de Valparaíso provoca una disminución en la diversidad de las comunidades bacterianas y un incremento de bacterias tolerantes al metal. Para esto se analizaron suelos del valle de Aconcagua que presentaron altas concentraciones de cobre (379, 520 y 784 mg/kg) y un suelo sin contaminación con cobre (control) correspondiente al valle de Casablanca (20 mg/kg). Se determinó el número de bacterias heterótrofas y bacterias tolerantes a cobre (0,8 mM) mediante técnicas de cultivo. Se caracterizaron las cepas bacterianas más tolerantes a este metal. Se determinó la diversidad y riqueza de las comunidades bacterianas de los suelos del valle de Aconcagua y Casablanca mediante la técnica de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). Los resultados obtenidos indican que el número de bacterias heterótrofas fue similar en los suelos analizados. Sin embargo, el número de bacterias heterótrofas tolerantes a cobre fue significativamente mayor en los suelos contaminados que en el suelo control. De las 92 cepas aisladas cinco presentaron alta tolerancia a cobre (CMI entre 3,1 - 4,7 mM). Las cinco cepas seleccionadas, C21, O4, O12, A32 y A55 presentaron el gen copA que codifica la enzima oxidasa multicobre que confiere resistencia a cobre. O12, A32 y A55 exhibieron resistencia a 17 mM de níquel y presentaron el gen nccA que codifica una de las proteínas que forma parte de la bomba de eflujo que otorga resistencia a níquel. Los aislados C21 y O4 presentaron tolerancia a cromato (4,3 mM). Las cepas O12 y A32 presentaron plásmidos que podrían estar involucrados en la resistencia a metales pesados. La velocidad de crecimiento de la cepa O12 por la presencia de cobre (0,8 y 2,4 mM) no fue afectada. Por otra parte, la riqueza y el índice de diversidad (H) no mostraron diferencias significativas entre las comunidades de los suelos contaminados y el control (p>0,05). La tolerancia a altas concentraciones de metales pesados de las cepas aisladas de los suelos con alto contenido de cobre indica que la presencia de este metal en los suelos ejerce una presión selectiva en las comunidades bacterianas. Esta presión selectiva tiene como consecuencia un aumento en la tolerancia a cobre en las comunidades bacterianas. / The Aconcagua valley, located in the Valparaiso region, is one of the main agricultural areas of Chile. Copper mining and the massive use of copper agrochemicals has led to an increase of copper concentration in soils. Copper reduces biomass and bacterial metabolic activity in soils. Therefore, copper reduces agricultural soils fertility and causes ecosystem damage. This thesis postulates that copper at high concentrations in agricultural soils decreases the bacterial community diversity and increases copper-tolerant bacteria. Soils from the Aconcagua valley with high concentrations of copper (379, 520 y 784 mg/kg) and a soil from the Casablanca valley (20 mg/kg) were analyzed. Heterotrophic bacteria and copper-tolerant bacteria from soils were determined by culture-dependent techniques. Copper resistant bacteria were isolated. Strains with high copper-tolerance were further characterized. The diversity and abundance of bacterial communities in Aconcagua and Casablanca valleys soils were determined by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The number of heterotrophic bacteria was similar in all soils. The number of copper-tolerant heterotrophic bacteria was significantly higher in copper-contaminated soils than in control soils. 92 bacterial strains were isolated. Five strains, C21, O4, O12, A32, and A55, showed high resistance to copper (MIC 3.1 - 4.7 mM). These 5 strains possess the copA gene that encodes CopA, a protein related to copper resistance. The strains O12, A32 and A55 showed tolerance to nickel (17 mM) and possessed the nccA gene that encodes the protein NccA confering resistance to this metal. Strains C21 and O4 were tolerant to chromate (4.3 Mm). Plasmids ware detected in isolates O12 and A32, which may encode heavy metal resistance genes. The growth rate of strain O12 was not affected by the presence of copper (0,8 mM and 2,4 mM). The richness and diversity index (H) indicated no significant differences between communities from copper-contaminated soils and control soil (<0,05). The copper tolerant strains isolated from contaminated soils suggest selective pressure of copper to bacterial communities. The selective pressure of copper increased copper tolerance of bacterial communities.

Memoria para optar al Título Profesional de: Ingeniero Agrónomo / Se evaluó el potencial fitoacumulador de ballica (Lolium perenne L.) y/o trébol blanco (Trifolium repens L.) para ofrecer una alternativa de limpieza de sitios contaminados con cobre. Se realizó un ensayo con suelos de la V Región (Valparaíso) de Chile cultivados con vid de mesa (Vitis vinifera L.) que mostraban un alto (TB: bajos rendimientos de V. vinifera), bajo (TA: altos rendimientos de V. vinifera) e intermedio (TM: rendimientos medios de V. vinifera) nivel de Cu (DTPA) disponible (140, 40 y 90 mg kg-1, respectivamente). Durante el año 2013 y en invernadero, cada suelo (cinco repeticiones) fue sembrado con L. perenne y/o T. repens en macetas. Después de ocho meses las plantas fueron cosechadas para obtener la masa de materia seca y los contenidos de Cu tanto en los tejidos aéreos como radicales de las plantas. Así también, se determinaron los contenidos de Cu disponible, intercambiable y total de los suelos. Para las condiciones iniciales de CuDTPA intermedio y alto (TM y TB), el metal fue acumulado principalmente a nivel de raíces en los cultivos individuales y la combinación de ellos, pero ballica y ballica+trébol fueron más eficientes en cuanto a la absorción de Cu. Si bien las especies vegetales son capaces de remover el metal de los suelos, los contenidos de Cu al final del ensayo permanecieron altos (hasta 50 mg kg-1 de Cu disponible), denotando la necesidad de realizar estudios de más largo plazo y de verificar que estos resultados se repitan a nivel de campo. / To assess their potential as copper phytoaccumulators in soils and to offer a cleanup alternative of contaminated sites, ryegrass (Lolium perenne L.) and/or white clover (Trifolium repens L.) were used. The study was conducted with soil from the 5th Region (Valparaíso) of Chile cultivated with table grapes (Vitis vinifera L.) and showing a high (TB: low yields of V. vinifera), low (TA: high yields of V. vinifera) and intermediate (TM: medium yields of V. vinifera) levels of available Cu (DTPA). During 2013 and in a greenhouse assay, each soil (five replications) was sowed with L. perenne and/or T. repens in pots. After eight months plants were harvested to obtain dry matter and Cu contents in plant aerial and root tissues. Available, exchangeable and total Cu were measured also in soils. Under initial high and intermediate levels of CuDTPA conditions (TB and TM), metal was accumulated mainly at roots level in single and combined crops, but single ryegrass and ryegrass+clover were more efficient in the Cu uptake. Although species are able to remove metal from soils, the Cu contents at the end remained high (up to 50 mg kg-1 of available Cu), indicating that long-term trials are necessary and confirm these results at field level.