Thesis (M.S. )--University of Tennessee Health Science Center, 2007. / Title from title page screen (viewed on July 28, 2008). Research advisor: Dr. Isaac O. Donkor, Ph.D. Document formatted into pages (xii, 80 p. : ill.). Vita. Abstract. Includes bibliographical references (p. 65-80).

Orientadores: Felix Guillermo Reyes Reyes, Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nunes_KatiaSantosDamacena_M.pdf: 1068510 bytes, checksum: 7643c5a3077803dd36a9801db74845bb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A aquicultura é hoje o setor de produção mundial de alimentos que apresenta o maior crescimento. Compreende todas as formas de criação de animais e cultivo de plantas aquáticas em água doce, salobra e marinho. Um grande constrangimento para o setor são os surtos de doenças, com uma estimativa global de perdas da ordem de muitos bilhões de dólares por ano. Este fato ocorre devido a que o ambiente aquático é mais favorável a proliferação de bactérias patogênicas, podendo atingir altas densidades em torno dos animais e ser ingeridas durante a alimentação ou durante as trocas gasosas. Assim, o risco de infecções bacterianas na criação de peixes é alto, podendo ser consequência de fatores estressantes tais como falta de higiene, alta densidade de estocagem, baixa qualidade da água, flutuação da temperatura, nutrição inadequada, más práticas de manejo, inadequados procedimentos e métodos de transporte, adaptação ao novo ambiente e captura. Na tentativa de minimizar perdas, antibióticos são administrados, através dos alimentos, aos peixes com fins terapêuticos (tratamento de doença). Devido ao seu baixo custo e relativa eficiência em combater infecções bacterianas mais comuns, as sulfonamidas pertencem a uma classe de antibióticos largamente usada. Trimetoprim é outro agente antibiótico frequentemente coadministrado com sulfonamidas para aumentar, de forma sinergética, a eficiência do tratamento contra uma variedade de infecções bacterianas. Entretanto, o uso de antimicrobianos como agentes quimioterapêuticos tem criado problemas devido ao seu efeito tóxico, desenvolvimento de resistência microbiana, resíduo acumulativo e consequências à saúde pública e ao meio ambiente. O monitoramento dos resíduos de quimioterapêuticos em alimentos tem se tornado prioritário para o controle de resíduos de contaminantes na cadeia de produção de alimentos de origem animal. Nos últimos anos, ocorreu um rápido desenvolvimento de novos métodos analíticos, para a determinação destes resíduos. Dentre os métodos de análise mais promissores, inclue-se a técnica de preparo de amostras denominada QuEChERS ("QuEChERS - Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe"), o qual foi empregado neste estudo. Para a quantificação dos resíduos foi utilizada a técnica UPLC-ESI-QToF MS, por se tratar de um método altamente seletivo na determinação de moléculas orgânicas sendo, atualmente, uma das técnicas mais modernas de quantificação de resíduos em alimentos, permitindo níveis de quantificação na ordem de ng/g de matriz. No presente estudo, para fins de desenvolvimento e validação do método analítico foi considerado o limite máximo de resíduo (LMR) estabelecido na União Europeia (EU) (100 ng g-1). O método desenvolvido foi validado en conformidade aos guias de validação da EU e do Ministério da Agricultura Pecuaria e Abastecimento (MAPA) do Brasil, tendo apresentado seletividade sem efeito matriz para as sulfonamidas estudadas. A precisão (intra e interdias) verificada apresentou coeficiente de variação (CV %) menor do que 20 %. Os limites de deteccção (LOD) e quantificação (LOQ) foram 1 ng g-1 e 5 ng g-1, respectivamente. Para as sulfonamidas o valor de CCa variou entre 102,6 e 120,0, e para CCß entre 111,7e 140,1. Para o trimetoprim o valor de CCa e CCß foi de 70,0 e 89,9, respectivamente. Os resultados obtidos indicam que o método é apropriado para a determinação de sulfonamidas e trimetoprim em filés de tilápia / Abstract: The aquaculture is at present one of the food production sectors with the highest expansion. It comprises all forms of animal and vegetal aquatic cultures and plants in the fresh water, brackish and marine environments. A major drawback for the sector is the disease outbreaks, with estimated overall losses of several billion dollars per year. This fact occurs because the aquatic environment is more favorable to pathogenic bacteria, regardless of the animal specie, they could reach high densities around them and be ingested during feeding or when they ingest water. Thus, the risk of bacterial infections in fish farming is high and may be due to stress factors such as poor hygiene, overcrowding, poor water quality, temperature fluctuation, poor nutrition, poor management practices, careless handling, improper procedures and transport methods, adaptation to the new environment and capture. In an attempt to minimize losses, antibiotics are administered, by means of the food, to fish for therapeutic (to treat disease) purposes, in aquaculture facilities throughout the world. Due to its low cost and effectiveness in overcoming the most common bacterial infections, sulfonamides are a class of widely used antibiotics. Trimethoprim is another antibiotic agent frequently emplyed in conjunction with sulphonamides to increase, synergistically, the power of treatment against a variety of bacterial infections. The use of antibiotics or chemotherapeutics has created problems due to its toxic effects, bacterial resistance induction, cumulative and residual effects to public health and to the environment. The monitoring of veterinary drug residues in food has become a main concern for the control of residues of contaminants in the production chain of animal foods. In recent years, there was a fast development of new analytical methods for determination of these residues. Among the most promising methods of analysis it is found the technique of sample preparation called "QuEChERS - Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe", which was used in this study. UPLC-ESI-QToF MS technique was used in the quantification of the residues, since it is a highly selective method for the determination of organic molecules, currently, being one of the most modern techniques for quantifying residues in food, enabling the possibility to quantify residues in the order of ng g-1. In the present study, for the purpose of development and validation of the analytical method it was considered the maximum residue limit (MRL) established in Japan (20 ng g-1), which is lower than that established in the European Union (EU) (100 ng g-1). The method was validated according to the validation guidelines of the EU and the Brazilian Ministry of Agriculture Livestock and Supply (MAPA), having presented selectivity and no matrix effect for the sulfonamides studied. The precision (intra-and interday) showed a coefficient of variation (CV %) less than 20 %. The limits for detection (LOD) and quantification (LOQ) were 1 ng g-1 and 5 ng g-1, respectively. The results indicate that the method is suitable for the determination of sulfonamides and trimethoprim in tilapia fillets. For sulfonamides, the value of CCa varied between 102.6 and 120.0, and 111.7 and 140.1 between CCß. For the value of trimethoprim and CCa CCß was 70.0 and 89.9, respectively. The results indicate that the method is suitable for the determination of sulfonamides and trimethoprim in tilapia fillets / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Effects of sulfadiazine, sulfathiazole, and sulfapyridine on the thyroid gland and blood pressure were investigated in the rat. Thiouracil, a known potent anti-thyroid substance, was employed as a standard with which the drugs were compared. Four groups of young male albino rats were injected with graded doses of thiouracil, sulfadiazine, sulfathiazole, and sulfapyridine, suspended in distilled water, over a '6-dsy period, respectively. A 0.027' solution of the drug was incorporated into the drinking water daily. A control group was injected with physiological saline and a 0.02" solution of the saline solution was incorporated into the drinking water. Thiouracil and the sulfenamiaes acted as anti-thyroid agents. Goiterous conditions developed, including thyroid hypertrophy, reduced food intake, as well as an increase in body weight concomitantly with reduced oxygen consumption and reduction in the level of iodinated compounds in the blood. A slight increase in the systolic blood pressure was also noted. Results were obtained by means of spectrophotometry, oxygen consumption rates, blood pressure determinations, and gross analyses of the thyroid glands.

A utilização de medicamentos veterinários é de grande importância na produção animal, porém também pode trazer conseqüências negativas, como a presença de resíduos em alimentos, como o leite bovino. As sulfonamidas são uma classe de antibióticos utilizados no tratamento veterinário e humano, sendo de grande importância sua análise em alimentos de origem animal, como o leite, uma vez que podem provocar resistência bacteriana, reações alérgicas e intoxicações, comprometendo a segurança alimentar da população e prejudicando a fabricação de derivados lácteos. A maioria dos estudos vem utilizando a extração em fase sólida (SPE), na extração das sulfonamidas e no clean up da amostra. Entretanto, o método QuEChERS, introduzido em 2003, vem sendo considerado promissor na extração de diversos compostos em matrizes alimentícias. Assim, a presente pesquisa teve o objetivo de desenvolver e validar métodos analíticos, comparando os métodos de extração SPE e QuEChERS, com posterior análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de arranjo de diodos, para a determinação de sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina) em leite bovino. Na otimização das condições cromatográficas e do método de extração QuEChERS, utilizou-se planejamentos experimentais. Primeiramente, foram otimizadas as condições cromatográficas, selecionando-se coluna C18 Luna (100 x 4,6 mm, 5 µm), 17 µL de volume de injeção, comprimento de onda de 290 nm, vazão de 0,50 mL min-1, temperatura de 20 °C e eluição gradiente com os solventes água e etanol. No método de extração QuEChERS, o procedimento otimizado utilizou 6 g de leite, 3 mL de água, 6 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético, 2,4 g de MgSO4 e 0,6 g de acetato de sódio, sendo que na etapa de clean up da amostra utilizou-se 37,5 mg de amina primária e secundária, 25 mg de octadecilsilano e 150 mg de MgSO4. O planejamento experimental foi considerado eficiente na otimização das condições cromatográficas e no procedimento de extração QuEChERS, obtendo-se boa separação entre os picos e valores de recuperação entre 95 e 98%, com desvio padrão relativo inferior a 8,25% para os analitos na concentração de 0,05 mg kg-1. No desenvolvimento do método de extração SPE não foi possível obter boa recuperação dos analitos e clean up da amostra. Acredita-se que as sulfonamidas estudadas sejam perdidas na etapa de pré-tratamento do leite, a qual é importante para a realização da SPE. Desse modo, a extração usando o QuEChERS foi selecionada para a análises das sulfonamidas em leite bovino. Os ensaios de validação demonstraram que o método é adequado para a análise das sulfonamidas, dentro do limite máximo de resíduos (0,1 mg kg-1), estabelecido pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária, com exatidão e precisão dentro da faixa aceitável pelos guias de validação seguidos. Além disso, foi possível utilizar apenas etanol e água como fase móvel cromatográfica, o que é uma vantagem em relação a métodos tradicionais, pois utiliza um solvente orgânico menos tóxico e renovável. A vazão de fase móvel é relativamente baixa, o que contribui para a diminuição do volume de solvente orgânico consumido e de resíduos gerados. / The use of veterinary medicines is of great importance in animal production, but also can have negative consequences, such as the occurrence of residues in food of animal origin, among which bovine milk stands out. Sulfonamides are an antibiotic class used in animal and human treatments, so it is important to analyze this kind of residue in food of animal origin, such as milk, because it can cause allergic reactions and poisoning, affecting food safety and damaging the manufactory of dairy products. Most of the studies have used solid-phase extraction (SPE) in the extraction of sulfonamides and clean up of the sample. However, the QuEChERS method, introduced in 2003, has been considered promising in the extraction of various compounds in food matrices. Thereby, this research aimed to develop and validate analytical methods comparing the extraction methods SPE and QuEChERS, followed by high performance liquid chromatography with diode array detection for the analysis of sulfonamides (sulfathiazole, sulfamethazine and sulfadimethoxine) in bovine milk. In the optimization of the chromatographic conditions and QuEChERS method, we used experimental design. Chromatographic conditions were optimized, selecting column C18 Luna (100 x 4.6 mm, 5 µm), injection volume of 17 µL, wavelength of 290 nm, flow rate of 0.5 mL min-1, temperature of 20 °C and gradient mode, using water and ethanol as mobile phase. In the QuEChERS method, the optimized procedure used 6 g of milk, 3 mL of water, 6 mL of acetonitrile with 1% of acetic acid, 2.4 g of MgSO4 and 0.6 g of sodium acetate, and in the clean up step it was used 37.5 mg of primary and secondary amine, 25 mg of octadecylsilane and 150 mg of MgSO4. Experimental design was considered efficient in the optimization, since it was obtained good separation of the chromatographic peaks and recovery between 95 and 98% with relative standard deviation below 8.25% for the analytes in the concentration of 0.050 mg kg-1. In the development of the extraction method SPE, it was not possible to obtain good recovery for the analytes and clean up of the sample. It is believed sulfonamides are lost in the sample pre-treatment step, which is important in performing SPE. Therefore, the QuEChERS method was selected for this analysis. The validation tests demonstrate the method is appropriate, within the maximum limit residue (0.1 mg kg-1), established by the National Health Surveillance Agency, with accuracy and precision within the accepted limit, according to the followed validation guides. Moreover, it was possible to use just water and ethanol as mobile phase, what is an advantage in relation to traditional methods, because it uses an organic solvent less toxicant and renewable. Rate flow is also relatively low, which contributes to decrease the required volume of organic solvent and the amount of waste produced.

O uso de antibióticos em animais de produção pode ser ministrado de diferentes formas: i) como método de prevenção de doenças, ii) como tratamento e combate de doenças como mastite, infecções respiratórias, genitais e oftálmicas, e iii) aplicados às rações, a fim de aumentar o ganho de peso, promovendo também a eficiência de aproveitamento dos alimentos e tornando menores os índices de morbidez e mortalidade. No entanto, alguns produtores utilizam os antibióticos de forma inadequada, ministrando o mesmo em dosagens superiores às recomendadas ou até mesmo adicionando os antibióticos diretamente no leite, a fim de inibir o crescimento indesejável de bactérias, o que pode causar graves riscos à saúde humana. Uma das maneiras de se detectar resíduos de antibióticos (sulfonamidas) em leite é a partir da reação enzimática entre a anidrase carbônica e um éster (4-nitrofenil acetato), que gera uma coloração amarelo brilhante. As sulfonamidas inibem tal reação, impedindo o surgimento de cor. Dispositivos microfluídicos fabricados em papel (μAD) foram desenvolvidos como um novo método simples, rápido, portátil e de baixo custo, a fim de se detectar a presença ou ausência das três principais sulfonamidas (sulfametazina, sulfadimetoxina e sulfatiazol), como exigido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A imobilização de uma fina camada uniforme de pasta de metil celulose, nos spots dos microdispositivos, permitiu maior estabilidade na superfície reacional do papel, de forma a alcançar limites de detecção (LOD) menores, equivalentes à 2,80 μmol L-1 (7,79x10-7 g mL-1) para a sulfametazina, 2,70 μmol L-1(8,37x10-7 g mL-1) para a sulfadimetoxina e 2,50 μmol L-1 (6,38x10-7 g mL-1) para o sulfatiazol. O método apresentou, como principal vantagem, a análise das amostras de leite bovino sem qualquer tratamento prévio. Além disso, o método apresentou boa linearidade e repetitividade nos ensaios realizados intra-dia e inter-dia, além de se mostrar seletivo para compostos da classe das sulfonamidas, mostrou-se também robusto com relação a alterações na temperatura do leite bovino. Dessa forma, o teste pode ser transportado para a área rural, sem a necessidade de um profissional especializado, a fim de se obter um diagnóstico local rápido, simples e de baixo custo, para a qualidade do leite. / The use of antibiotics in animal production can be delivered in diferent ways: i) as a method of preventing disease in animals, ii) as treatment and combat diseases such as mastitis, respiratory infections, genital infections and ophthalmic infections, and iii) applied to the feed in order to increase the weight gain of the animals, promoting the efficiency of food utilization, and making lower the morbidity and mortality. However, some producers use antibiotics improperly, administering it in doses higher than those recommended or even directly adding antibiotics to the milk, in order to inhibit the unwanted growth of bacteria. This fact alone can cause serious risks to human health. One way of detecting antibiotic residues (sulfonamides) in milk, is using the enzymatic reaction between an ester (4-nitrophenyl acetate) and carbonic anhydrase, which gives a bright yellow color. The sulfonamides inhibit this reaction, preventing color appearance. Paper-based microfluidic devices (μPAD) have been developed as a new simple, fast, portable and inexpensive, in order to detect the presence or absence of the three most common sulfonamides (sulfamethazine, sulfadimethoxine and sulfathiazole), as required by the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA). The immobilization of a uniform thin layer of methyl cellulose pulp on the spots of microdevices, allowed greater stability in the reaction surface of the paper, and achieved lower limits of detection (LOD) than without the additive, equivalent to 2.80 5mol L-1 (7.79x10-7 g mL-1)for sulfamethazine, 2.70 5mol L-1 (8.37x10-7 g mL-1) for sulfadimethoxine and 2.50 5mol L-1 (6.38x10-7 g mL-1) for sulfathiazole. The principal advantage of this method is that allows the analysis of bovine milk samples without any prior treatment. Furthermore, the method i) has good linearity and repeatability in tests performed intra-day and inter-day, ii) shows selectivity for compounds of the sulfonamide class, and iii) is robust to changes in bovine milk temperature. Thus, the test can be transported to the rural area, without a specialized professional, providing locally a fast, simple and low cost diagnostic for the presence of sulfonamide antibiotics in milk.

O uso de antibióticos em animais de produção pode ser ministrado de diferentes formas: i) como método de prevenção de doenças, ii) como tratamento e combate de doenças como mastite, infecções respiratórias, genitais e oftálmicas, e iii) aplicados às rações, a fim de aumentar o ganho de peso, promovendo também a eficiência de aproveitamento dos alimentos e tornando menores os índices de morbidez e mortalidade. No entanto, alguns produtores utilizam os antibióticos de forma inadequada, ministrando o mesmo em dosagens superiores às recomendadas ou até mesmo adicionando os antibióticos diretamente no leite, a fim de inibir o crescimento indesejável de bactérias, o que pode causar graves riscos à saúde humana. Uma das maneiras de se detectar resíduos de antibióticos (sulfonamidas) em leite é a partir da reação enzimática entre a anidrase carbônica e um éster (4-nitrofenil acetato), que gera uma coloração amarelo brilhante. As sulfonamidas inibem tal reação, impedindo o surgimento de cor. Dispositivos microfluídicos fabricados em papel (μAD) foram desenvolvidos como um novo método simples, rápido, portátil e de baixo custo, a fim de se detectar a presença ou ausência das três principais sulfonamidas (sulfametazina, sulfadimetoxina e sulfatiazol), como exigido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A imobilização de uma fina camada uniforme de pasta de metil celulose, nos spots dos microdispositivos, permitiu maior estabilidade na superfície reacional do papel, de forma a alcançar limites de detecção (LOD) menores, equivalentes à 2,80 μmol L-1 (7,79x10-7 g mL-1) para a sulfametazina, 2,70 μmol L-1(8,37x10-7 g mL-1) para a sulfadimetoxina e 2,50 μmol L-1 (6,38x10-7 g mL-1) para o sulfatiazol. O método apresentou, como principal vantagem, a análise das amostras de leite bovino sem qualquer tratamento prévio. Além disso, o método apresentou boa linearidade e repetitividade nos ensaios realizados intra-dia e inter-dia, além de se mostrar seletivo para compostos da classe das sulfonamidas, mostrou-se também robusto com relação a alterações na temperatura do leite bovino. Dessa forma, o teste pode ser transportado para a área rural, sem a necessidade de um profissional especializado, a fim de se obter um diagnóstico local rápido, simples e de baixo custo, para a qualidade do leite. / The use of antibiotics in animal production can be delivered in diferent ways: i) as a method of preventing disease in animals, ii) as treatment and combat diseases such as mastitis, respiratory infections, genital infections and ophthalmic infections, and iii) applied to the feed in order to increase the weight gain of the animals, promoting the efficiency of food utilization, and making lower the morbidity and mortality. However, some producers use antibiotics improperly, administering it in doses higher than those recommended or even directly adding antibiotics to the milk, in order to inhibit the unwanted growth of bacteria. This fact alone can cause serious risks to human health. One way of detecting antibiotic residues (sulfonamides) in milk, is using the enzymatic reaction between an ester (4-nitrophenyl acetate) and carbonic anhydrase, which gives a bright yellow color. The sulfonamides inhibit this reaction, preventing color appearance. Paper-based microfluidic devices (μPAD) have been developed as a new simple, fast, portable and inexpensive, in order to detect the presence or absence of the three most common sulfonamides (sulfamethazine, sulfadimethoxine and sulfathiazole), as required by the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA). The immobilization of a uniform thin layer of methyl cellulose pulp on the spots of microdevices, allowed greater stability in the reaction surface of the paper, and achieved lower limits of detection (LOD) than without the additive, equivalent to 2.80 5mol L-1 (7.79x10-7 g mL-1)for sulfamethazine, 2.70 5mol L-1 (8.37x10-7 g mL-1) for sulfadimethoxine and 2.50 5mol L-1 (6.38x10-7 g mL-1) for sulfathiazole. The principal advantage of this method is that allows the analysis of bovine milk samples without any prior treatment. Furthermore, the method i) has good linearity and repeatability in tests performed intra-day and inter-day, ii) shows selectivity for compounds of the sulfonamide class, and iii) is robust to changes in bovine milk temperature. Thus, the test can be transported to the rural area, without a specialized professional, providing locally a fast, simple and low cost diagnostic for the presence of sulfonamide antibiotics in milk.

A utilização de medicamentos veterinários é de grande importância na produção animal, porém também pode trazer conseqüências negativas, como a presença de resíduos em alimentos, como o leite bovino. As sulfonamidas são uma classe de antibióticos utilizados no tratamento veterinário e humano, sendo de grande importância sua análise em alimentos de origem animal, como o leite, uma vez que podem provocar resistência bacteriana, reações alérgicas e intoxicações, comprometendo a segurança alimentar da população e prejudicando a fabricação de derivados lácteos. A maioria dos estudos vem utilizando a extração em fase sólida (SPE), na extração das sulfonamidas e no clean up da amostra. Entretanto, o método QuEChERS, introduzido em 2003, vem sendo considerado promissor na extração de diversos compostos em matrizes alimentícias. Assim, a presente pesquisa teve o objetivo de desenvolver e validar métodos analíticos, comparando os métodos de extração SPE e QuEChERS, com posterior análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de arranjo de diodos, para a determinação de sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina) em leite bovino. Na otimização das condições cromatográficas e do método de extração QuEChERS, utilizou-se planejamentos experimentais. Primeiramente, foram otimizadas as condições cromatográficas, selecionando-se coluna C18 Luna (100 x 4,6 mm, 5 µm), 17 µL de volume de injeção, comprimento de onda de 290 nm, vazão de 0,50 mL min-1, temperatura de 20 °C e eluição gradiente com os solventes água e etanol. No método de extração QuEChERS, o procedimento otimizado utilizou 6 g de leite, 3 mL de água, 6 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético, 2,4 g de MgSO4 e 0,6 g de acetato de sódio, sendo que na etapa de clean up da amostra utilizou-se 37,5 mg de amina primária e secundária, 25 mg de octadecilsilano e 150 mg de MgSO4. O planejamento experimental foi considerado eficiente na otimização das condições cromatográficas e no procedimento de extração QuEChERS, obtendo-se boa separação entre os picos e valores de recuperação entre 95 e 98%, com desvio padrão relativo inferior a 8,25% para os analitos na concentração de 0,05 mg kg-1. No desenvolvimento do método de extração SPE não foi possível obter boa recuperação dos analitos e clean up da amostra. Acredita-se que as sulfonamidas estudadas sejam perdidas na etapa de pré-tratamento do leite, a qual é importante para a realização da SPE. Desse modo, a extração usando o QuEChERS foi selecionada para a análises das sulfonamidas em leite bovino. Os ensaios de validação demonstraram que o método é adequado para a análise das sulfonamidas, dentro do limite máximo de resíduos (0,1 mg kg-1), estabelecido pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária, com exatidão e precisão dentro da faixa aceitável pelos guias de validação seguidos. Além disso, foi possível utilizar apenas etanol e água como fase móvel cromatográfica, o que é uma vantagem em relação a métodos tradicionais, pois utiliza um solvente orgânico menos tóxico e renovável. A vazão de fase móvel é relativamente baixa, o que contribui para a diminuição do volume de solvente orgânico consumido e de resíduos gerados. / The use of veterinary medicines is of great importance in animal production, but also can have negative consequences, such as the occurrence of residues in food of animal origin, among which bovine milk stands out. Sulfonamides are an antibiotic class used in animal and human treatments, so it is important to analyze this kind of residue in food of animal origin, such as milk, because it can cause allergic reactions and poisoning, affecting food safety and damaging the manufactory of dairy products. Most of the studies have used solid-phase extraction (SPE) in the extraction of sulfonamides and clean up of the sample. However, the QuEChERS method, introduced in 2003, has been considered promising in the extraction of various compounds in food matrices. Thereby, this research aimed to develop and validate analytical methods comparing the extraction methods SPE and QuEChERS, followed by high performance liquid chromatography with diode array detection for the analysis of sulfonamides (sulfathiazole, sulfamethazine and sulfadimethoxine) in bovine milk. In the optimization of the chromatographic conditions and QuEChERS method, we used experimental design. Chromatographic conditions were optimized, selecting column C18 Luna (100 x 4.6 mm, 5 µm), injection volume of 17 µL, wavelength of 290 nm, flow rate of 0.5 mL min-1, temperature of 20 °C and gradient mode, using water and ethanol as mobile phase. In the QuEChERS method, the optimized procedure used 6 g of milk, 3 mL of water, 6 mL of acetonitrile with 1% of acetic acid, 2.4 g of MgSO4 and 0.6 g of sodium acetate, and in the clean up step it was used 37.5 mg of primary and secondary amine, 25 mg of octadecylsilane and 150 mg of MgSO4. Experimental design was considered efficient in the optimization, since it was obtained good separation of the chromatographic peaks and recovery between 95 and 98% with relative standard deviation below 8.25% for the analytes in the concentration of 0.050 mg kg-1. In the development of the extraction method SPE, it was not possible to obtain good recovery for the analytes and clean up of the sample. It is believed sulfonamides are lost in the sample pre-treatment step, which is important in performing SPE. Therefore, the QuEChERS method was selected for this analysis. The validation tests demonstrate the method is appropriate, within the maximum limit residue (0.1 mg kg-1), established by the National Health Surveillance Agency, with accuracy and precision within the accepted limit, according to the followed validation guides. Moreover, it was possible to use just water and ethanol as mobile phase, what is an advantage in relation to traditional methods, because it uses an organic solvent less toxicant and renewable. Rate flow is also relatively low, which contributes to decrease the required volume of organic solvent and the amount of waste produced.

Digitized by Kansas Correctional Industries

Carbonic anhydases (CAs) are ubiquitous enzymes present in human under 15 different isozymes. Each active one catalyzes the hydration reaction of carbon dioxide into bicarbonate anion and proton. Some isozymes contribute to basic physiological processes like among other respiration and acid-base homeostasis while other isozymes are involved in pathologies such as epilepsy (CA VII) and cancer (CA IX). Convulsions observed during epileptic seizures are partly attributed to carbonic anhydrase VII which play a role in neuronal excitation phenomenon. Carbonic anhydrase IX (CA IX) is overexpressed in most cancer tissues and is absent from their normal counterparts. It can acidify the extratumoral medium leading to metastatic behavior. To improve our knowledge on the role of these isozymes, the design of selective CA VII and IX inhibitors is of a great interest. Otherwise, such compounds can potentially be developed as antiepileptic or anticancer agents. A molecular modeling study which combines a direct (homology modelling, docking) and an indirect (pharmacophore, virtual screening) approach of drug design was conducted to create novel and selective inhibitors. In parallel, original indanesulfonamides were designed, synthesized and their inhibitory potencies against the CAs were determined. Docking studies of some derivatives allowed to rationalize the enzymatic data. Then, we evaluated the effect of some indanesulfonamides on a model of cancer cells. The study of the anticonvulsant activity was performed on an in vivo model. Finally, during this work other series of potentially CA inhibitors were also evaluated for their CA inhibitory activities and for one of them for its anticonvulsant effect.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 153-173).