Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus commun diagnostiqué dans le monde entier. Les limites de la chimiothérapie à base de cisplatine ont incité les scientifiques à rechercher de nouveaux médicaments anti-cancéreux à base de métal. Les complexes à base d’or(III) ont été parmi les plus largement étudiés puisqu’ils ont montré une plus importante cytotoxicité in vitro que le cisplatine ainsi que des activités anti-cancéreuse in vivo dans le CCR, mais leur utilisation clinique a été limitée en raison de leur faible stabilité dans des conditions physiologiques. De nouveaux complexes à base d’or(III) couplés à la porphyrine [or(III)/chlorure d’adamantane-porphyrine (SN1) et or(III)/chlorure de mono-acétateporphyrin (SN2)] avec une stabilité en solution aqueuse améliorée ont été synthétisés. SN1 et SN2 réduisent la survie des lignées humaines HT-29 et HCT-116 de CCR, causent l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M, et nous avons observé une diminution de l'expression de la cycline B1 et de la kinase « cyclindépendant 1 » (Cdk1) avec une surexpression de la forme active de p53, p21 et de « Bcl-2-associated X » (Bax). En outre, SN1 et SN2 induisent l’apoptose par la voie intrinsèque, puisqu'ils mènent au clivage de la caspase 9, la caspase 3 et la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) tout en augmentant l’expression de Bax. La phosphatidylinositol-3-kinase/protéine kinase B (PI3K/Akt), le facteur nucléaire κB (NF-κB) et l’ « extracellular signal-regulated kinase » (ERK) sont importants pour la survie cellulaire et la prolifération. SN1 et SN2 entrainent une diminution de l'activité d'Akt où la forme phosphorylée diminue avec le temps, mais aussi ils causent une diminution importante dans la phosphorylation d'ERK et l'activité de NF-κB. Finalement, les complexes SN1 et SN2 ciblent la voie p38/« mitogen-activated protein kinase » (MAPK) entrainant une augmentation de l'expression de la cyclooxygenase-2 et de son produit enzymatique la prostaglandine E2. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer diagnosed worldwide. The limitations of cisplatin-based chemotherapy have prompted intense interest among scientists to search for alternative metal-based anticancer medicines. Gold(III) complexes have been among the most widely investigated since they showed higher cytotoxicity than cisplatin and promising in vitro and in vivo anticancer activities in CRC but their clinical usefulness has been limited by their poor stability under physiological conditions. A novel gold(III) porphyrin complexes [gold(III) porphyrin-adamantane chloride (SN1) and gold(III) porphyrin mono-acetate chloride (SN2)] with improved aqueous stability were synthesized. SN1 and SN2 reduced the survival of human CRC HT-29 and HCT-116 cell lines, caused cell cycle arrest in G2/M phase, and we observed downregulation of the expression of cyclin B1 and cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) along with up-regulation of the active form of p53, p21 and Bcl-2–associated X (Bax). Furthermore, SN1 and SN2 induced apoptosis by the intrinsic pathway, since they lead to the cleavage of caspase 9, caspase 3 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), and up-regulating Bax. Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt), nuclear factor-κB (NF-κB) and extracellular signal-regulated kinases (ERK) are important for cell survival and proliferation. SN1 and SN2 lead to decrease in the activity of Akt where thephosphorylated form decreased with time as well as they caused an important decrease in the phosphorylation of ERK and activity of NF-κB. Finally, SN1 and SN2 complexes affected p38/mitogenactivated protein kinase (MAPK) pathway then we recorded an increase in the cyclooxygenase-2 expression and its enzymatic product prostaglandin E2.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Context: Cardiovascular diseases are the leading cause of death globally. Myocardial infarction is responsible for the highest number of deaths due to cardiovascular disease. Objective: We have previously shown that acute benfotiamine administration at the onset of reperfusion is associated with decreased infarct size and preserved contractile function in response to ischemia-reperfusion. We aimed to evaluate the involvement of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI3K/Akt) and Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) pro-survival signaling pathways in mediating these cardioprotective effects. Materials and Methods: Part One - Hearts were rapidly excised from Wistar rats and mounted on a Langendorff perfusion apparatus. After stabilization, hearts were subjected to 30 minutes of regional ischemia and 120 minutes of reperfusion. The control group received no treatment. Experimental groups were treated with 100 μM benfotiamine ± 0.1 μM Tyrphostin AG490 or Wortmannin (inhibitors of JAK2 and PI3K, respectively), dissolved in dimethyl sulfoxide. The vehicle control group received an equivalent dose of dimethyl sulfoxide. All treatments were administered for 20 minutes at the onset of reperfusion. Functional parameters were measured throughout, to test the effects of benfotiamine ± pro-survival pathway inhibitors on functional recovery. In addition, hearts were stained with Evans blue and triphenyltetrazolium chloride to assess the effects of benfotiamine ± pro-survival pathway inhibitors on infarct size. Part Two - Hearts that were perfused ± 30 minutes of global ischemia and ± 20 minutes of benfotiamine administration, were used to assess PI3K/Akt and JAK/STAT signaling in response to ischemia-reperfusion and benfotiamine treatment. As with previous experiments, benfotiamine was administered at a concentration of 100 μM, at the onset of reperfusion. Tissues were assessed by Western blot analysis. Results: 20 minutes of acute benfotiamine administration at the onset of reperfusion led to a decrease in infarct size (35.6 ± 2.4% vs. 55.7 ± 5.0% [p<0.05]). Inhibition of PI3K/Akt signaling by addition of Wortmannin abrogated this infarct-limiting effect (51.5 ± 1.3% vs. 35.6 ± 2.4% [p<0.05]). However, inhibition of JAK/STAT signaling had no effect. There were no significant differences in left ventricular developed pressure, coronary flow rate or heart rate during the experiments. In addition, 20 minutes of acute benfotiamine administration at the onset of reperfusion lead to an increase in phospho-FOXO/FOXO in the cytosolic fraction, but no significant change in phospho-STAT3/STAT3 in the nucleus. Conclusions: Our results suggest that acute benfotiamine administration at the onset of reperfusion may act to reduce infarct size via activation of PI3K/Akt pro-survival signaling. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Konteks: Kardiovaskulêre siekte is die hoofoorsaak van sterftes wêreldwyd. Miokardiale infarksie is verantwoordelik vir die grootste aantal sterftes weens kardiovaskulêre siekte. Doel: Ons het voorheen getoon dat akute benfotiamientoediening met die aanvang van reperfusie geassosieer is met „n verkleining in die infarkgrootte, en dit het verder ook die kontraktiele funksie in reaksie op ischemie-reperfusie behou. Ons doel was om die betrokkenheid van die fosfatidielinositol 3-kinase/Akt (PI3K/Akt) en Janus kinase/seintransduseerde en aktiveerder van transkripsie (JAK/STAT) pro-oorlewings seinweg in die mediasie van hierdie kardiobeskermende effekte te evalueer. Materiale en Metodes: Deel een - Harte is vinnig vanuit Wistarrotte verwyder en op die Langendorff-perfusieapparaat gemonteer. Na stabilisering is die harte blootsgestel aan 30 minute regionale ischemie en 120 minute reperfusie. Die kontrole groep het geen behandeling ontvang nie. Eksperimentele groepe is met 100 μM benfotiamien ± 0.1 μM Tirfostien AG490 of Wortmannin (inhibeerders van JAK2 en PI3K, onderskeidelik) behandel, opgelos in dimetielsulfoksied. Die draer-kontrole groep het „n ekwivalente dosis van dimetielsulfoksied ontvang. Alle behandelings is toegedien vir 20 minute aan die begin van die reperfusie. Funksionele parameters is deurgaans gemeet om te toets vir die effekte van benfotiamien ± pro-oorlewingsweg inhibeerders op funksionele herstel. Verder is die harte met Evans-blou en trifenieltetrazoliumchloried gekleur om die effek van benfotiamien ± pro-oorlewingsweg inhibeerders op die infarkgrootte te bepaal. Deel twee - Harte is vir ± 30 minute perfuseer met globale ischemie en ± 20 minute met benfotiamientoediening. Dit was gebruik om PI3K/Akt en JAK/STAT seine as gevolg van ischemie-reperfusie en benfotiamienbehandeling te ondersoek. Soos met die vorige eksperimente, is benfotiamien toegedien by ‟n konsentrasie van 100 μM met die aanvang van reperfusie. Weefsel is ondersoek deur middel van Western blot analise. Resultate: 20 minute van akute benfotiamientoediening, met die aanvang van reperfusie, het tot „n verkleining in die infarkgrootte (35.6 ± 2.4% vs. 55.7 ± 5.0% [p<0.05]) gelei. Inhibering van die PI3K/Akt seinweg deur toediening van Wortmannin het die infark-beperkende effek opgehef (51.5 ± 1.3% vs. 35.6 ± 2.4% [p<0.05]). Inhibering van JAK/STAT seine het egter geen effek getoon nie. Daar was geen beduidende verskille in linkerventrikulêr-ontwikkelde druk, koronêre-vloeitempo of harttempo tydens die eksperimente nie. Verder, 20 minute van akute benfotiamientoediening met die aanvang van reperfusie het „n toename in fosfo-FOXO/FOXO in die sitosoliese-fraksie veroorsaak, maar geen beduidende verandering in fosfo-STAT3/STAT3 is in die nukleus waargeneem nie. Gevolgtrekkings: Ons resultate suggereer dat akute benfotiamientoediening met die aanvang van reperfusie moontlik die infarkgrootte via aktivering van die PI3K/Akt pro-oorlewingsein kan verklein.

Despite the development and use of specialised cardiac preservation solutions, the quality of the donor heart may still be compromised by its obligatory exposure to periods of ischaemia (both cold and warm) followed by reperfusion upon reintroduction of the recipient circulation. This is reflected in Transplant Registry data showing increased primary allograft failure as a function of increasing ischaemic time. The research described in this thesis is designed to further the understanding of the mechanisms by which the donor heart may be adapted to these prolonged periods of ischaemia and reperfusion by the activation of endogenous pro-survival signalling pathways by the addition of pharmacological agents to Celsior, a clinical preservation solution. Studies were conducted in an isolated working rat heart model of donor heart preservation. The first study investigated the cardioprotective effects of a novel inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase 1, INO-1153. Maximum protective effect (after a 6 hour storage period) was observed when the PARP inhibitor was administered prior to cardiac arrest and storage and when the agent was added to the Celsior cardioplegic / storage solution. This protective affect was associated with activation of the Akt signalling pathway and could be prevented by inhibition of Akt phosphorylation and activation. The second study examined functional protection and pro-survival signalling pathway activation in hearts arrested and stored for 6 hours in Celsior supplemented with glyceryl trinitrate (an exogenous source of nitric oxide) and Cariporide (an inhibitor of sodium hydrogen exchange). Here, cardiac protection was accompanied by activation of the ERK 1/2 pro-survival pathway as well as a decrease in apoptosis. The third study examined the cardioprotective effect of supplementation of Celsior with all three agents after an extended (10 hour) period of hypothermic storage. Significant recovery of function was only observed in the triply supplemented hearts, being accompanied by activation of both the Akt and ERK pathways. These studies demonstrate for the first time the feasibility of recruitment of endogenous pro-survival pathways as an approach to increasing the post-storage function of the donor heart. Importantly, for the logistics of clinical transplantation, these pathways can be recruited by addition of appropriate pharmacological agents to the arresting and storage solution.

Bien qu’au 11ème rang des cancers les plus fréquents et au 12ème rang des cancers les plus mortels, le mélanome reste un problème médical majeur préoccupant. En effet, cette pathologie, au stade métastatique, reste réfractaire à la chimiothérapie et aux thérapies ciblées. Un certain nombre d’arguments définissent la résistance à l’apoptose comme un point crucial dans l’échec aux traitements anti-cancéreux. Ces mécanismes de résistance et chimiorésistance spécifiques aux mélanomes, déclenchés en réponse aux traitements traditionnels, sont la conséquence d’une dérégulation des voies apoptotiques suite à l’activation des protéines anti-apoptotiques, l’inactivation des protéines pro-apoptotiques avec renforcement des signaux de survie (voies de survie PI3K/Akt, NF-κB et MAPK/ERK). Une étude effectuée sur la lignée murine de mélanome B16-F0 a introduit la mélanogenèse comme une forme de résistance à l’apoptose induite par l’acide ursolique (AU), un triterpène pentacyclique d’origine naturelle ; ainsi les cellules entrant en apoptose sont capables de déclencher une résistance qui se manifeste par une surproduction de la mélanine tout en retardant la mort cellulaire. D’autres études ont montré l’implication de la COX-2 dans un mécanisme de résitance à l’apoptose dans plusieurs types de cancers dans le but de retarder leur mort cellulaire. Dans cette optique, nous nous sommes intéressés à étudier l’implication de la mélanogenèse et de la voie COX-2/PGE2 dans la résistance à l’apoptose dans le mélanome et plus précisément dans un modèle d’apoptose induite par l’AU sur la lignée humaine de mélanome M4Beu. Par la suite, nous avons décrit une interaction probable entre ces deux voies distinctes, la mélanogenèse et la voie COX-2/PGE2. Dans un autre contexte, nous avons montré que l’AU inhibe les voies de survie PI3K/Akt et ERK1/2, ce qui favorise ses effets pro-apoptotique et anti-prolifératif. Notre étude permet de mieux explorer les mécanismes de résistance spécifiques aux mélanomes tout en suggérant l’effet bénéfique de l’AU comme adjuvant naturel aux traitements chimio-thérapeutiques traditionnels. / Despite the deployment of targeted therapies, the incidence and mortality rates of cutaneous melanoma is increasing very fast making it a pre-eminent public health threat. Previously, we had showed that B16-F0 murine melanoma cells undergoing apoptosis are able to delay their own death induced by ursolic acid (UA), a natural pentacyclic triterpenoid compound. We had demonstrated that tyrosinase and TRP-1 up-regulation in apoptotic cells and the subsequent production of melanin were implicated in an apoptosis resistance mechanism. Several resistance mechanisms to apoptosis have been characterized in melanoma such as hyperactivation of DNA repair mechanisms, drug efflux systems, and reinforcement of survival signals (PI3K/Akt, NF-κB and MAPK/ERK pathways). Otherwise, other mechanisms of apoptosis resistance involving different proteins, such as cyclooxygenase-2 (COX-2), have been described in many cancer types. In this study, we demonstrated the involvement of melanogenesis and COX-2/PGE2 pathway in resistance to UA-induced apoptosis in human M4Beu melanoma cells. Then, we established the evidence that an interaction exists between these two pathways by investigating on the one hand the effect of inhibiting melanogenesis by N-phenylthiourea (PTU) on COX-2 expression and its product PGE2, and on the other hand the effect of inhibiting COX-2 activity using NS-398 on tyrosinase expression and melanin production. Furthermore, we showed that anti-proliferative and proapoptotic effects of UA were mediated through modulation of multiple signaling pathways including Akt and ERK-1/2 proteins. Our study not only uncovers underlying molecular mechanisms of UA action in human melanoma cancer cells but also suggest its great potential as an adjuvant in treatment and cancer prevention.

Différentes études ont montré que les facteurs liés au mode de vie, de même que le vieillissement ou l’amélioration des tests de diagnostic et de screening, ne peuvent à eux seuls expliquer l’incidence croissante des cancers dans les pays dits industrialisés. Bien que des changements de comportements aient conduit à une diminution du nombre de cancers en France, l’incidence des carcinomes hépatocellulaires est toujours en augmentation. D’autres facteurs oncogéniques, tels que l’exposition à des cancérogènes de l’environnement pourraient intervenir. Parmi ceux-ci, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), dont le benzo[a]pyrène (B[a]P) est le chef de file, et qui sont retrouvés notamment dans la fumée de cigarette, les gaz d’échappements ou les aliments grillés, constituent une priorité en termes de santé publique du fait de leurs effets cancérogènes. Une caractéristique-clé commune à tous les cancers a trait à leur métabolisme énergétique particulier, basé sur la glycolyse. Cependant, rien n’est connu quant à une possible reprogrammation métabolique due aux HAP. L’objectif global de mon projet de thèse a donc été d’étudier l’impact in vitro du B[a]P, utilisé à faible concentration, sur le métabolisme énergétique, de préciser le rôle de la reprogrammation métabolique dans le contrôle de la balance survie/apoptose par le B[a]P et de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous avons d’abord identifié une production de monoxyde d’azote (NO) résultant de l’activation de la iNOS par le B[a]P, et agissant comme un signal de survie, possiblement via une hyperpolarisation mitochondriale. Nous avons ensuite démontré que le B[a]P induit une reprogrammation métabolique des cellules en favorisant un métabolisme glycolytique au détriment de la phosphorylation oxydative. Enfin, nous avons identifié IF1, l’inhibiteur physiologique de la F0F1ATPase, comme une nouvelle cible des HAP, participant à la reprogrammation métabolique et capable de promouvoir la survie sous l’effet du B[a]P. Au total, nous montrons que ces altérations du métabolisme mitochondrial promues par le B[a]P, sont à l’origine de signaux de survie dans notre modèle de cellules épithéliales hépatiques F258. Ces mécanismes pourraient ainsi contribuer à la progression tumorale sous l’effet des HAP. / Various studies have shown that factors related to lifestyle (smoking, diet, etc.), as well as aging or even the improved efficiency of diagnostic and screening tests, cannot explain by themselves the rising incidence of cancers in the industrialized countries. Although evolution of behaviors has helped reducing the number of cancers in France, the incidence of hepatocellular carcinomas is still increasing. This alarming result could be related to other oncogenic factors such as chronic exposure to environmental carcinogens. Among these compounds, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), including benzo[a]pyrene (B[a]P), the prototype carcinogen of this family, especially found in cigarette smoke, exhaust fumes or grilled food, are a priority in terms of public health due to their high carcinogenic potential. A key feature of cancer cells is related to their predominant glycolytic metabolism. However, nothing is known yet about a possible metabolic reprogramming upon PAH exposure. My PhD project has aimed at characterizing the impact of a low B[a]P concentration on energy metabolism, at clarifying the role of such a metabolic reprogramming in cell fate determination, and at elucidating the cellular and molecular basis of this phenomenon. We first identify a production of nitric oxide (NO), involving the activation of iNOS by B[a]P, and acting as a survival signal. We then demonstrate that B[a]P induces a metabolic reprogramming, thus promoting a glycolytic metabolism at the expense of oxidative phosphorylation. Finally, we identify IF1, the physiological inhibitor of the F0F1ATPase as a new target of PAHs, which participates in the B[a]P-elicited metabolic reprogramming and survival. To sum up, we identify new alterations of mitochondrial metabolism, acting as survival signals in B[a]P-treated rat hepatic epithelial F258 cells. These mechanism could therefore contribute to tumor progression.