Os solos ácidos recobrem, cerca de 40% da área terrestre, constituindo-se em um dos principais fatores limitantes à população à produção vegetal do planeta. No Brasil, os solos ácidos abrangem cerca de dois terços do território nacional. De um modo geral, a acidez do subsolo reduz a profundidade do sistema radicular, aumentando a susceptibilidade à seca e diminuindo o uso de nutrientes pelas plantas. Além da alta atividade de íon hidrogênio (H+), os solos ácidos geralmente apresentam níveis tóxicos de alumínio, sendo que a toxicidade por AI tem sido intensivamente investigada nos últimos anos. No entanto, a toxicidade por AI ocorre apenas a pH baixo e em condições onde a toxicidade por prótons geralmente também se manifesta. Apesar disto, trabalhos envolvendo a toxicidade por prótons são escassos. A sensibilidade de células a pH baixo depende da fase de crescimento e desenvolvimento em que estas se encontram. Em raízes, as células mais sensíveis são as da região de alongamento e em suspensões celulares as células na fase log de crescimento são mais sensíveis do que as células na fase estacionária. Este trabalho faz parte de uma linha de pesquisa que procura explorar as diferenças que existem entre células quanto à sensibilidade a pH baixo para melhor entender a toxicidade e tolerância a prótons. Foram utilizadas células da cultura de tabaco cv. BY-2, um sistema modelo que apresenta diversas vantagens sobre o uso de raízes para a realização deste trabalho. Os objetivos deste estudo foram de a) determinar condições apropriadas para a exposição destas células a acidez; b) caracterizar a resposta destas células a pH baixo, sob influência de diferentes fatores ambientais, quando se encontram em estados distintos de sensibilidade ao pH baixo; e c) verificar se mudanças na sensibilidade das células a pH baixo podem ser decorrentes de alterações na composição da membrana plasmática ou na atividade das ATPases. Vários testes iniciais foram realizados com o intuito de se definir algumas condições experimentais - o tempo de exposição, a composição do meio e o tampão a ser empregado. Optou-se por lavar as células e depois incubá-las por 1h em meio simples com pH desejado e contendo apenas Ca \'Cl IND. 2\' 2mM, KCl 10mM. E o tampão MES ou biftalato (10 mM). O biftalato foi testado porque o tampão MES, usado normalmente no meio de cultura completo, não é eficiente na faixa de pH abaixo de 5,0. O biftalato (pKa = 4,1) praticamente não afetou a viabilidade celular avaliada pela permeabilidade a trypan blue, mas inibiu o crescimento celular no meio de cultura completo. Mesmo assim, os dois tampões foram utilizados em paralelo em diversos experimentos e verificou-se que os resultados foram semelhantes. A viabilidade das células na fase log (2 dias) foi reduzida quando se abaixou o pH de 5,6 a 3,8, sendo que caiu mais acentuadamente até o pH de 4,8. As células da fase estacionaria (7d) foram insensíveis ao baixo pH. A um pH fixo de 4,2 aumentando-se a concentração de Ca \'Cl IND. 2\' para cerca de 8 a 16 mM praticamente aboliu o efeito deletério do pH baixo. Para se ter o mesmo efeito com a adição de KCl, foi necessário adicionar entre 80 e 160 mM. A adição de sacarose também amenizou os efeitos do pH\'sendo praticamente revertido a uma concentração de 100 Mm. Os resultados indicam a importância da força iônica e da osmolaridade da solução, mas o efeito de Ca não parece depender apenas destas duas propriedades. A inibição de ATPases, pelo uso de DCCD, não pareceu ter qualquer relação com a sensibilidade a pH baixo. Tanto células de tabaco na fase log quanto estacionárias foram sensíveis à aplicação de ortovanadato de sódio. Em células da fase estacionária, este efeito mais acentuado a pH 4,2, sugerindo que nestas células, as H+ ATPases do tipo P da membrana plasmática podem ter algum papel na tolerância destas células ao baixo pH. Encontrou-se diferenças no perfil protéico de frações enriquecidas em membrana plasmática entre células da fase log e estacionárias e entre células tratadas ou não a pH baixo. Estas diferenças precisam ser melhor estudadas. / Acid soils account for about 40 % of the surface area of the world and are one of the major factors limiting plant productivity. In Brazil, these soils comprise roughly two-thirds of its total territory. In general, soil acidity is detrimental because it limits the depth of the root system, increasing susceptibility to drought and decreasing the use of nutrients. In addition to the high levels of hydrogen ion activity, acid soils usually have Al toxicity hazards, a topic which has been intensely studied in the past years. However, Al toxicity only occurs at low pH, under conditions in which proton toxicity is also a problem. Despite this, studies of proton toxicity are lacking. The sensitivity of cells to low pH depends on their growth and developmental status. In roots, the most sensitive cells are those of the elongation zone and in cell cultures, cells in the log phase are more sensitive than those of the stationary phase. This study is part of a larger attempt to explore the differences that exist between cells with respect to their sensitivity to low pH to further understand toxicity and tolerance to protons. Cells of tobacco BY-2, a plant cell model system which has several advantages over the use of roots, was used in this study. The objectives were a) to determine the appropriate conditions to expose these cells to low pH; b) characterize the response of these cells to low pH, when different environmental factors are varied and at different stages of cellular sensitivity to acidity; and c) examine if changes in the sensitivity of cells to low pH are due to changes in the composition of plasma membranes or in the activity of ATPases. Several preliminary tests were performed to define the experimental conditions to be used ? the duration of exposure to low pH, the composition of the medium and the buffer to be used. A simple solution containing only CaCl2 2mM, KCl 10 mM and MES or phthalate buffer (10 mM) was chosen to wash and incubate the cells at the pH of interest. Phthalate was tested because MES, the buffer normally used in the culture medium, is not effective at pH values below 5.0. Phthalate (pKa = 4,1) had very little effects on cell viability as evaluated by membrane permeability to trypan blue, but it severely inhibited the growth of the cell culture in complete medium. Nevertheless, both buffers were used in several subsequent experiments, the results of which were found to be similar between both buffers. The viability of log-phase cells (2 day-old) was reduced when the pH was lowered from pH 5,6 to 3.8, but this was sharper down to pH 4,8. Cells in stationary phase (7 day-old) were insensitive to low pH. At a fixed pH of 4,2, increases in the concentration of CaCl2 up to 8 or 16 mM abolished most of the deleterious effects of low pH. To generate the same effect, KCl had to be added at concentrations between 80 and 160 mM. The addition of sucrose also alleviated the effects of low pH. The results suggest the importance of solution ionic strength and osmolarity on sensitivity to low pH, but the effects of Ca do not appear to depend only on these two properties. The inhibition of ATPases, by DCCD, did not appear to bear any relation to cellular sensitivity to low pH. Both log-phase and stationary-phase cells were affected by the addition of sodium orthophosphate. In stationary-phase cells, this effect was more pronounced at pH 4,2, suggesting that in these cells, P-type H+-ATPases of the plasma membrane may play a role in the tolerance of these cells to lo pH. Differences were found in the protein profile of enriched plasma membrane fractions both between log-phase and stationary-phase cells and between cells treated or not with low pH. These differences, however, need to be better examined.

Foi investigada a resposta antioxidante de culturas em suspensão celular de café (Coffea arabica L.) ao cádmio (Cd) e níquel (Ni). As células de café foram tratadas por doze dias com zero (controle), 0,05 e 0,5 mM de NiCl2 ou CdCl2. O Cd e o Ni acumularam rapidamente nas células e este acúmulo foi diretamente correlacionado com o aumento na concentração de metal no meio externo. Em 0,05 mM CdCl2 e 0,05 mM NiCl2, o crescimento foi estimulado, mas em 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 a taxa de crescimento foi reduzida. As alterações no metabolismo do oxigênio ativo foram detectadas pela análise visual, assim como pelo aumento na peroxidação lipídica, nos tratamentos com 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2. As atividades das enzimas catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutationa redutase (GR; EC 1.6.4.2) e superóxido dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) aumentaram após exposição ao Cd, particularmente na maior concentração de CdCl2. A atividade da ascorbato peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) foi elevada por 0,05 mM CdCl2, mas não pode ser detectada em células cultivadas na maior concentração de CdCl2 após 24 h de cultivo, enquanto que a guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) não demonstrou um padrão claro de resposta ao tratamento com Cd. As atividades das enzimas CAT, GR, APX, GOPX e SOD foram aumentadas, particularmente nos períodos iniciais de exposição ao NiCl2 e as atividades foram maiores na dosagem 0,5 mM NiCl2, na maioria dos tempos de exposição testados. A análise em PAGE não desnaturante seguido pela revelação da atividade enzimática, apresentou uma isoenzima da CAT, nove isoenzimas da SOD e quatro isoenzimas da GR. As isoenzimas da SOD foram diferencialmente afetadas pelo tratamento com CdCl2 e NiCl2 e uma isoenzima da GR mostrou responder especificamente ao CdCl2 e ao NiCl2. Os resultados sugerem que 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 podem levar ao estresse oxidativo. O CdCl2 e o NiCl2 a 0,05 mM não induziram peroxidação lipídica e a principal resposta aparenta ser via indução das atividades das enzimas SOD, CAT e APX nas células tratadas com Cd e das enzimas SOD, CAT, GOPX e APX nas células tratadas com Ni, para a remoção das espécies ativas de oxigênio (EAOs), e pela indução da GR para garantir a disponibilidade de glutationa reduzida. A síntese de peptídeos de ligação ao Cd, deve também estar relacionada com a inibição da atividade da APX, provavelmente devido ao esgotamento da glutationa e ascorbato na maior concentração de CdCl2. / The antioxidant responses of coffee (Coffea arabica L.) cell suspension cultures to cadmium (Cd) and nickel (Ni) were investigated. Coffee cells were treated for twelve days with 0 (control), 0.05 and 0.5 mM NiCl2 or CdCl2. Cd and Ni accumulated very rapidly in the cells and this accumulation was directly correlated with an increase in applied metal concentration in the external medium. At 0.05 mM CdCl2 and 0.05 mM NiCl2, growth was stimulated, but at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2 the growth rate was reduced. An alteration in activated oxygen metabolism was detected by visual analysis as well as by an increase in lipid peroxidation at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutathione reductase (GR; EC 1.6.4.2) and superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) activity increased after Cd exposure, particularly at the higher concentration of CdCl2. Ascorbate peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) activity was higher at the lower CdCl2 concentration used, but could not be detected in cells growing in the higher CdCl2 concentration after 24 h of growth, whilst guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) did not show a clear response to Cd treatment. CAT, GR, APX, GOPX and SOD activities were increased due to Ni treatment, particularly at earlier NiCl2 exposure times and the activities were higher at 0.5 mM NiCl2 for most of exposure times tested. An analysis by non-denaturing PAGE followed by staining for enzyme activity, revealed one CAT isoenzyme, nine SOD isoenzymes and four GR isoenzymes. The SOD isoenzymes were differently affected by CdCl2 and NiCl2 treatment and one GR isoenzyme was shown to specifically respond to CdCl2 and NiCl2. The results suggest that the higher concentrations of CdCl2 and NiCl2 may lead to oxidative stress. CdCl2 and NiCl2 at 0.05 mM did not induce lipid peroxidation and the main response appeared to be via the induction of SOD, CAT and APX activities in Cd treated cells and SOD, CAT, GOPX and APX activities in Ni treated cells, for the removal of reactive oxygen species (ROS), and by the induction of GR to ensure the availability of reduced glutathione. The synthesis of Cd-binding proteins may also be related to the inhibition of APX activity probably due to glutathione and ascorbate depletion at higher CdCl2 concentration.

Os solos ácidos recobrem, cerca de 40% da área terrestre, constituindo-se em um dos principais fatores limitantes à população à produção vegetal do planeta. No Brasil, os solos ácidos abrangem cerca de dois terços do território nacional. De um modo geral, a acidez do subsolo reduz a profundidade do sistema radicular, aumentando a susceptibilidade à seca e diminuindo o uso de nutrientes pelas plantas. Além da alta atividade de íon hidrogênio (H+), os solos ácidos geralmente apresentam níveis tóxicos de alumínio, sendo que a toxicidade por AI tem sido intensivamente investigada nos últimos anos. No entanto, a toxicidade por AI ocorre apenas a pH baixo e em condições onde a toxicidade por prótons geralmente também se manifesta. Apesar disto, trabalhos envolvendo a toxicidade por prótons são escassos. A sensibilidade de células a pH baixo depende da fase de crescimento e desenvolvimento em que estas se encontram. Em raízes, as células mais sensíveis são as da região de alongamento e em suspensões celulares as células na fase log de crescimento são mais sensíveis do que as células na fase estacionária. Este trabalho faz parte de uma linha de pesquisa que procura explorar as diferenças que existem entre células quanto à sensibilidade a pH baixo para melhor entender a toxicidade e tolerância a prótons. Foram utilizadas células da cultura de tabaco cv. BY-2, um sistema modelo que apresenta diversas vantagens sobre o uso de raízes para a realização deste trabalho. Os objetivos deste estudo foram de a) determinar condições apropriadas para a exposição destas células a acidez; b) caracterizar a resposta destas células a pH baixo, sob influência de diferentes fatores ambientais, quando se encontram em estados distintos de sensibilidade ao pH baixo; e c) verificar se mudanças na sensibilidade das células a pH baixo podem ser decorrentes de alterações na composição da membrana plasmática ou na atividade das ATPases. Vários testes iniciais foram realizados com o intuito de se definir algumas condições experimentais - o tempo de exposição, a composição do meio e o tampão a ser empregado. Optou-se por lavar as células e depois incubá-las por 1h em meio simples com pH desejado e contendo apenas Ca \'Cl IND. 2\' 2mM, KCl 10mM. E o tampão MES ou biftalato (10 mM). O biftalato foi testado porque o tampão MES, usado normalmente no meio de cultura completo, não é eficiente na faixa de pH abaixo de 5,0. O biftalato (pKa = 4,1) praticamente não afetou a viabilidade celular avaliada pela permeabilidade a trypan blue, mas inibiu o crescimento celular no meio de cultura completo. Mesmo assim, os dois tampões foram utilizados em paralelo em diversos experimentos e verificou-se que os resultados foram semelhantes. A viabilidade das células na fase log (2 dias) foi reduzida quando se abaixou o pH de 5,6 a 3,8, sendo que caiu mais acentuadamente até o pH de 4,8. As células da fase estacionaria (7d) foram insensíveis ao baixo pH. A um pH fixo de 4,2 aumentando-se a concentração de Ca \'Cl IND. 2\' para cerca de 8 a 16 mM praticamente aboliu o efeito deletério do pH baixo. Para se ter o mesmo efeito com a adição de KCl, foi necessário adicionar entre 80 e 160 mM. A adição de sacarose também amenizou os efeitos do pH\'sendo praticamente revertido a uma concentração de 100 Mm. Os resultados indicam a importância da força iônica e da osmolaridade da solução, mas o efeito de Ca não parece depender apenas destas duas propriedades. A inibição de ATPases, pelo uso de DCCD, não pareceu ter qualquer relação com a sensibilidade a pH baixo. Tanto células de tabaco na fase log quanto estacionárias foram sensíveis à aplicação de ortovanadato de sódio. Em células da fase estacionária, este efeito mais acentuado a pH 4,2, sugerindo que nestas células, as H+ ATPases do tipo P da membrana plasmática podem ter algum papel na tolerância destas células ao baixo pH. Encontrou-se diferenças no perfil protéico de frações enriquecidas em membrana plasmática entre células da fase log e estacionárias e entre células tratadas ou não a pH baixo. Estas diferenças precisam ser melhor estudadas. / Acid soils account for about 40 % of the surface area of the world and are one of the major factors limiting plant productivity. In Brazil, these soils comprise roughly two-thirds of its total territory. In general, soil acidity is detrimental because it limits the depth of the root system, increasing susceptibility to drought and decreasing the use of nutrients. In addition to the high levels of hydrogen ion activity, acid soils usually have Al toxicity hazards, a topic which has been intensely studied in the past years. However, Al toxicity only occurs at low pH, under conditions in which proton toxicity is also a problem. Despite this, studies of proton toxicity are lacking. The sensitivity of cells to low pH depends on their growth and developmental status. In roots, the most sensitive cells are those of the elongation zone and in cell cultures, cells in the log phase are more sensitive than those of the stationary phase. This study is part of a larger attempt to explore the differences that exist between cells with respect to their sensitivity to low pH to further understand toxicity and tolerance to protons. Cells of tobacco BY-2, a plant cell model system which has several advantages over the use of roots, was used in this study. The objectives were a) to determine the appropriate conditions to expose these cells to low pH; b) characterize the response of these cells to low pH, when different environmental factors are varied and at different stages of cellular sensitivity to acidity; and c) examine if changes in the sensitivity of cells to low pH are due to changes in the composition of plasma membranes or in the activity of ATPases. Several preliminary tests were performed to define the experimental conditions to be used ? the duration of exposure to low pH, the composition of the medium and the buffer to be used. A simple solution containing only CaCl2 2mM, KCl 10 mM and MES or phthalate buffer (10 mM) was chosen to wash and incubate the cells at the pH of interest. Phthalate was tested because MES, the buffer normally used in the culture medium, is not effective at pH values below 5.0. Phthalate (pKa = 4,1) had very little effects on cell viability as evaluated by membrane permeability to trypan blue, but it severely inhibited the growth of the cell culture in complete medium. Nevertheless, both buffers were used in several subsequent experiments, the results of which were found to be similar between both buffers. The viability of log-phase cells (2 day-old) was reduced when the pH was lowered from pH 5,6 to 3.8, but this was sharper down to pH 4,8. Cells in stationary phase (7 day-old) were insensitive to low pH. At a fixed pH of 4,2, increases in the concentration of CaCl2 up to 8 or 16 mM abolished most of the deleterious effects of low pH. To generate the same effect, KCl had to be added at concentrations between 80 and 160 mM. The addition of sucrose also alleviated the effects of low pH. The results suggest the importance of solution ionic strength and osmolarity on sensitivity to low pH, but the effects of Ca do not appear to depend only on these two properties. The inhibition of ATPases, by DCCD, did not appear to bear any relation to cellular sensitivity to low pH. Both log-phase and stationary-phase cells were affected by the addition of sodium orthophosphate. In stationary-phase cells, this effect was more pronounced at pH 4,2, suggesting that in these cells, P-type H+-ATPases of the plasma membrane may play a role in the tolerance of these cells to lo pH. Differences were found in the protein profile of enriched plasma membrane fractions both between log-phase and stationary-phase cells and between cells treated or not with low pH. These differences, however, need to be better examined.

Foi investigada a resposta antioxidante de culturas em suspensão celular de café (Coffea arabica L.) ao cádmio (Cd) e níquel (Ni). As células de café foram tratadas por doze dias com zero (controle), 0,05 e 0,5 mM de NiCl2 ou CdCl2. O Cd e o Ni acumularam rapidamente nas células e este acúmulo foi diretamente correlacionado com o aumento na concentração de metal no meio externo. Em 0,05 mM CdCl2 e 0,05 mM NiCl2, o crescimento foi estimulado, mas em 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 a taxa de crescimento foi reduzida. As alterações no metabolismo do oxigênio ativo foram detectadas pela análise visual, assim como pelo aumento na peroxidação lipídica, nos tratamentos com 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2. As atividades das enzimas catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutationa redutase (GR; EC 1.6.4.2) e superóxido dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) aumentaram após exposição ao Cd, particularmente na maior concentração de CdCl2. A atividade da ascorbato peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) foi elevada por 0,05 mM CdCl2, mas não pode ser detectada em células cultivadas na maior concentração de CdCl2 após 24 h de cultivo, enquanto que a guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) não demonstrou um padrão claro de resposta ao tratamento com Cd. As atividades das enzimas CAT, GR, APX, GOPX e SOD foram aumentadas, particularmente nos períodos iniciais de exposição ao NiCl2 e as atividades foram maiores na dosagem 0,5 mM NiCl2, na maioria dos tempos de exposição testados. A análise em PAGE não desnaturante seguido pela revelação da atividade enzimática, apresentou uma isoenzima da CAT, nove isoenzimas da SOD e quatro isoenzimas da GR. As isoenzimas da SOD foram diferencialmente afetadas pelo tratamento com CdCl2 e NiCl2 e uma isoenzima da GR mostrou responder especificamente ao CdCl2 e ao NiCl2. Os resultados sugerem que 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 podem levar ao estresse oxidativo. O CdCl2 e o NiCl2 a 0,05 mM não induziram peroxidação lipídica e a principal resposta aparenta ser via indução das atividades das enzimas SOD, CAT e APX nas células tratadas com Cd e das enzimas SOD, CAT, GOPX e APX nas células tratadas com Ni, para a remoção das espécies ativas de oxigênio (EAOs), e pela indução da GR para garantir a disponibilidade de glutationa reduzida. A síntese de peptídeos de ligação ao Cd, deve também estar relacionada com a inibição da atividade da APX, provavelmente devido ao esgotamento da glutationa e ascorbato na maior concentração de CdCl2. / The antioxidant responses of coffee (Coffea arabica L.) cell suspension cultures to cadmium (Cd) and nickel (Ni) were investigated. Coffee cells were treated for twelve days with 0 (control), 0.05 and 0.5 mM NiCl2 or CdCl2. Cd and Ni accumulated very rapidly in the cells and this accumulation was directly correlated with an increase in applied metal concentration in the external medium. At 0.05 mM CdCl2 and 0.05 mM NiCl2, growth was stimulated, but at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2 the growth rate was reduced. An alteration in activated oxygen metabolism was detected by visual analysis as well as by an increase in lipid peroxidation at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutathione reductase (GR; EC 1.6.4.2) and superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) activity increased after Cd exposure, particularly at the higher concentration of CdCl2. Ascorbate peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) activity was higher at the lower CdCl2 concentration used, but could not be detected in cells growing in the higher CdCl2 concentration after 24 h of growth, whilst guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) did not show a clear response to Cd treatment. CAT, GR, APX, GOPX and SOD activities were increased due to Ni treatment, particularly at earlier NiCl2 exposure times and the activities were higher at 0.5 mM NiCl2 for most of exposure times tested. An analysis by non-denaturing PAGE followed by staining for enzyme activity, revealed one CAT isoenzyme, nine SOD isoenzymes and four GR isoenzymes. The SOD isoenzymes were differently affected by CdCl2 and NiCl2 treatment and one GR isoenzyme was shown to specifically respond to CdCl2 and NiCl2. The results suggest that the higher concentrations of CdCl2 and NiCl2 may lead to oxidative stress. CdCl2 and NiCl2 at 0.05 mM did not induce lipid peroxidation and the main response appeared to be via the induction of SOD, CAT and APX activities in Cd treated cells and SOD, CAT, GOPX and APX activities in Ni treated cells, for the removal of reactive oxygen species (ROS), and by the induction of GR to ensure the availability of reduced glutathione. The synthesis of Cd-binding proteins may also be related to the inhibition of APX activity probably due to glutathione and ascorbate depletion at higher CdCl2 concentration.