Techn. Hochsch., Diss., 2000--Aachen.

The culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) at large-scale becomes feasible with the aid of scalable suspension setups in continuously stirred tank reactors (CSTRs). Suspension cul- tures of hiPSCs are characterized by the self-aggregation of single cells into macroscopic cell aggre- gates that increase in size over time. The development of these free-floating aggregates is dependent on the culture vessel and thus represents a novel process parameter that is of particular interest for hiPSC suspension culture scaling. Further, aggregates surpassing a critical size are prone to spon- taneous differentiation or cell viability loss. In this regard, and, for the first time, a hiPSC-specific suspension culture unit was developed that utilizes in situ microscope imaging to monitor and to characterize hiPSC aggregation in one specific CSTR setup to a statistically significant degree while omitting the need for error-prone and time-intensive sampling. For this purpose, a small-scale CSTR system was designed and fabricated by fused deposition modeling (FDM) using an in-house 3D- printer. To provide a suitable cell culture environment for the CSTR system and in situ microscope, a custom-built incubator was constructed to accommodate all culture vessels and process control devices. Prior to manufacture, the CSTR design was characterized in silico for standard engineering parameters such as the specific power input, mixing time, and shear stress using computational fluid dynamics (CFD) simulations. The established computational model was successfully validated by comparing CFD-derived mixing time data to manual measurements. Proof for system functionality was provided in the context of long-term expansion (4 passages) of hiPSCs. Thereby, hiPSC aggregate size development was successfully tracked by in situ imaging of CSTR suspensions and subsequent automated image processing. Further, the suitability of the developed hiPSC culture unit was proven by demonstrating the preservation of CSTR-cultured hiPSC pluripotency on RNA level by qRT-PCR and PluriTest, and on protein level by flow cytometry. / Die Vermehrung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) im Indus- triemaßstab wird durch skalierbare Bioprozesse in aktiv durchmischten Rührkessel-Bioreaktoren (CSTRs) ermöglicht. Hierbei zeichnet sich das Wachstum von hiPSCs durch die charakteristische Bildung von sphäroidischen Zellaggregaten aus, deren Durchmesser sich im Laufe der Kultivierung vergrößert. Die Agglomeration von hiPSCs ist sowohl abhängig vom Grad der Durchmischung als auch vom jeweiligen Kulturgefäß, und stellt somit einen wichtigen Prozessparameter dar, welcher während der Prozessskalierung berücksichtigt werden muss. Weiterhin weisen hiPSCs in Aggregaten, welche eine kritische Größe überschreiten, eine erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, ihre Pluripotenz zu verlieren oder hinsichtlich ihrer Viabilität beeinträchtigt zu werden. Auf Grundlage dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Plattform für die Durchführung von hiPSCs-Suspensionskulturen en- twickelt, welche die zerstörungsfreie Überwachung des hiPSC-Aggregatwachstums in Echtzeit durch den Einsatz von in situ-Mikroskopie ermöglicht. Neben den eigens entworfenen Bioreaktoren, welche zum Großteil aus 3D-gedruckten Komponenten bestehen, wurde eine Peripherie in Form eines Inkubator-Prototyps entwickelt und konstruiert, welcher die Unterbringung der Bioreaktoren, der Systemkomponenten zur Erzeugung von Zellkulturbedingungen sowie einer in situ-Mikroskop- Spezialanfertigung gewährleistet. Als Ausgangspunkt der Entwicklung des CSTR Systems diente ein Strömungssimulationsmodell, welches dazu verwendet wurde, prozesstechnische Kennzahlen zu er- mitteln um das CSTR System hinsichtlich des spezifischen Leistungseintrags, der Mischzeit und der Scherbelastung zu charakterisieren. Das erstellte Simulationsmodell wurde zudem erfolgreich an- hand eines Messdatenabgleichs der Mischzeit hinsichtlich seiner Aussagekraft validiert. Des Weit- eren wurde die Funktionsfähigkeit des gesamten Systems durch Langzeitversuche belegt. Hierbei wurden hiPSCs in den entwickelten Bioreaktoren über einen Zeitraum von vier Passagen expandiert und das Aggregatwachstum mittels in situ-Mikroskopie in Kombination mit einer automatisierten Bildauswertung beschrieben. Überdies hinaus wurde die Qualität der kultivierten hiPSCs hinsichtlich ihrer Differenzierungskapazität durch den Nachweis von Pluripotenzmarkern auf RNA (qRT-PCR und PluriTest) sowie Proteinebene (Durchflusszytometrie) untersucht.

Universiẗat, Diss.--Halle, 1994.

Die Pflanzenbiotechnologie ermöglicht die nachhaltige Gewinnung pflanzlicher Wertstoffe mittels innovativer biotechnologischer Methoden. Bisher mangelt es auf diesem Gebiet jedoch an Grundlagenwissen und aussagekräftigen Studien, z. B. zur Anwendung biotechnologischer Standardverfahren beim Respirationsmonitoring. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden grundlegende Untersuchungen zur Erzeugung (Induktion) pflanzlicher in-vitro-Kulturen und zu geeigneten Kultivierungssystemen sowie Prozessüberwachungsstrategien vorgestellt und diskutiert. Als Modellsystem dient die Einjährige Sonnenblume Helianthus annuus. Die Induktion pflanzlicher Zellkulturen (Kallus und Suspensionen) mit photomixotrophem Stoffwechsel wurde unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht und geeignete Induktionsparameter ermittelt. Sowohl pflanzliche Gewebekulturen (Hairy roots) als auch die erzeugten photomixotrophen und heterotrophe Suspensionen konnten in verschiedenen Reaktorsystemen erfolgreich kultiviert und die Produktbildung nachgewiesen werden. Protokolle zu Induktion sowie Erhaltung von Zell- und Gewebekulturen von H. annuus wurden etabliert. Ein modernes Prozessüberwachungssystem für Schüttelkolben, das RAMOS® (Respiration Activity Monitoring System®) wurde erstmals umfassend für Untersuchungen des Wachstumsverhaltens und zum Screening pflanzlicher Zell- und Gewebekulturen eingesetzt. Dabei wurde die Problematik der Verdunstung (Evaporation) aus den Kulturgefäßen als signifikant bei den langen Kultivierungen von pflanzlichen in-vitro-Kulturen diagnostiziert und ein Modell zur Korrektur der Atmungstransferraten entwickelt. Erstmalig in der Pflanzenbiotechnologie kam das RAMOS® für Studien mit Zell- und Gewebekulturen von H. annuus im Speziellen sowie für Untersuchungen von Hairy roots im Allgemeinen zum Einsatz. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit werden relevante Kriterien zur Anwendung des innovativen Messsystems RAMOS® im Rahmen pflanzenbiotechnologischer Untersuchungen vorgestellt. Es wird ein Überblick über geeignete Kultivierungssysteme und zu publizierten Modellierungsstrategien für Applikationen in der Pflanzenbiotechnologie gegeben. Ein Literaturüberblick zu publizierten Modellierungsstrategien mit pflanzenbiotechnologischem Bezug vervollständigt die Arbeit. / Plant biotechnology enables a sustainable production of valuable plant resources using innovative biotechnological methods. However, a comprehensive knowledge base as well as significant studies, e. g. concerning the application of biotechnological standard procedures of respiration monitoring, are missing so far. In this work, basic investigations regarding the induction of plant in vitro cultures and appropriate cultivation systems as well as process monitoring strategies will be introduced and discussed. The annual sunflower Helianthus annuus serves as biological model system. The induction of plant cell cultures (callus and suspension) with photomixotroph metabolism was investigated at different conditions and appropriate induction parameter were determined. Both, plant tissues (Hairy roots) and induced photomixotroph as well as heterotrophic suspensions were cultivated successfully in various reactor systems. The production of desired metabolites was proven. Protocols concerning induction respectively maintenance of cell and tissue cultures of H. annuus have been established. For extensive investigations of growth behavior and for screening of plant cell and tissue cultures, a modern process monitoring tool for shake flasks, the RAMOS® (Respiration Activity Monitoring System®), was used for the first time. Thereby, the problem of evaporation off the culture vessels was identified as significant for time-intensive cultivations of plant in vitro cultures. A model for the correction of respiration transfer rates has been developed. For the first time in plant biotechnology, the RAMOS® has been applied for studies with H. annuus in special, and for studying the growth and respiration behavior of Hairy roots in general. With the help of the present work, relevant criteria concerning the application of the innovative measuring system RAMOS® for plant biotechnological investigations will be given. Furthermore, a survey over appropriate cultivation systems and published modelling strategies in plant biotechnology are introduced. A literature survey concerning model strategies regarding plant biotechnology completes this work.

Plants produce a variety of secondary metabolites, e.g. to defend themselves against herbivores or to attract pollinating insects. Plant cell biotechnology offers excellent opportunities in order to use such secondary plant metabolites to produce goods with consistent quality and quantity throughout the year, and therefore to act independently from biotic and abiotic environmental factors. This article presents results of an extensive study of plant cell in vitro cultivation in a modern shake flask system with non-invasive online respiration activity monitoring unit. Comprehensive screening experiments confirm the successful transfer of a model culture (sunflower suspension) into the shake flask monitoring device and the suitability of this respiration activity monitoring unit as qualified tool for screening of plant in vitro cultures (sunflower and sage suspension). The authors demonstrate deviations between online and offline data due to varying water evaporation from different culture flask types. The influence of evaporation on growth-specific parameters thereby rises with increasing cultivation time. Furthermore, possibilities to minimize the impact of evaporation, either by adjusting the inlet air moisture or by measuring the evaporation in combination with an appropriate correction of the measured growth values, are shown.

Plants produce a variety of secondary metabolites, e.g. to defend themselves against herbivores or to attract pollinating insects. Plant cell biotechnology offers excellent opportunities in order to use such secondary plant metabolites to produce goods with consistent quality and quantity throughout the year, and therefore to act independently from biotic and abiotic environmental factors. This article presents results of an extensive study of plant cell in vitro cultivation in a modern shake flask system with non-invasive online respiration activity monitoring unit. Comprehensive screening experiments confirm the successful transfer of a model culture (sunflower suspension) into the shake flask monitoring device and the suitability of this respiration activity monitoring unit as qualified tool for screening of plant in vitro cultures (sunflower and sage suspension). The authors demonstrate deviations between online and offline data due to varying water evaporation from different culture flask types. The influence of evaporation on growth-specific parameters thereby rises with increasing cultivation time. Furthermore, possibilities to minimize the impact of evaporation, either by adjusting the inlet air moisture or by measuring the evaporation in combination with an appropriate correction of the measured growth values, are shown.

Die Pflanzenbiotechnologie ermöglicht die nachhaltige Gewinnung pflanzlicher Wertstoffe mittels innovativer biotechnologischer Methoden. Bisher mangelt es auf diesem Gebiet jedoch an Grundlagenwissen und aussagekräftigen Studien, z. B. zur Anwendung biotechnologischer Standardverfahren beim Respirationsmonitoring. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden grundlegende Untersuchungen zur Erzeugung (Induktion) pflanzlicher in-vitro-Kulturen und zu geeigneten Kultivierungssystemen sowie Prozessüberwachungsstrategien vorgestellt und diskutiert. Als Modellsystem dient die Einjährige Sonnenblume Helianthus annuus. Die Induktion pflanzlicher Zellkulturen (Kallus und Suspensionen) mit photomixotrophem Stoffwechsel wurde unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht und geeignete Induktionsparameter ermittelt. Sowohl pflanzliche Gewebekulturen (Hairy roots) als auch die erzeugten photomixotrophen und heterotrophe Suspensionen konnten in verschiedenen Reaktorsystemen erfolgreich kultiviert und die Produktbildung nachgewiesen werden. Protokolle zu Induktion sowie Erhaltung von Zell- und Gewebekulturen von H. annuus wurden etabliert. Ein modernes Prozessüberwachungssystem für Schüttelkolben, das RAMOS® (Respiration Activity Monitoring System®) wurde erstmals umfassend für Untersuchungen des Wachstumsverhaltens und zum Screening pflanzlicher Zell- und Gewebekulturen eingesetzt. Dabei wurde die Problematik der Verdunstung (Evaporation) aus den Kulturgefäßen als signifikant bei den langen Kultivierungen von pflanzlichen in-vitro-Kulturen diagnostiziert und ein Modell zur Korrektur der Atmungstransferraten entwickelt. Erstmalig in der Pflanzenbiotechnologie kam das RAMOS® für Studien mit Zell- und Gewebekulturen von H. annuus im Speziellen sowie für Untersuchungen von Hairy roots im Allgemeinen zum Einsatz. Mit Hilfe der vorliegenden Arbeit werden relevante Kriterien zur Anwendung des innovativen Messsystems RAMOS® im Rahmen pflanzenbiotechnologischer Untersuchungen vorgestellt. Es wird ein Überblick über geeignete Kultivierungssysteme und zu publizierten Modellierungsstrategien für Applikationen in der Pflanzenbiotechnologie gegeben. Ein Literaturüberblick zu publizierten Modellierungsstrategien mit pflanzenbiotechnologischem Bezug vervollständigt die Arbeit. / Plant biotechnology enables a sustainable production of valuable plant resources using innovative biotechnological methods. However, a comprehensive knowledge base as well as significant studies, e. g. concerning the application of biotechnological standard procedures of respiration monitoring, are missing so far. In this work, basic investigations regarding the induction of plant in vitro cultures and appropriate cultivation systems as well as process monitoring strategies will be introduced and discussed. The annual sunflower Helianthus annuus serves as biological model system. The induction of plant cell cultures (callus and suspension) with photomixotroph metabolism was investigated at different conditions and appropriate induction parameter were determined. Both, plant tissues (Hairy roots) and induced photomixotroph as well as heterotrophic suspensions were cultivated successfully in various reactor systems. The production of desired metabolites was proven. Protocols concerning induction respectively maintenance of cell and tissue cultures of H. annuus have been established. For extensive investigations of growth behavior and for screening of plant cell and tissue cultures, a modern process monitoring tool for shake flasks, the RAMOS® (Respiration Activity Monitoring System®), was used for the first time. Thereby, the problem of evaporation off the culture vessels was identified as significant for time-intensive cultivations of plant in vitro cultures. A model for the correction of respiration transfer rates has been developed. For the first time in plant biotechnology, the RAMOS® has been applied for studies with H. annuus in special, and for studying the growth and respiration behavior of Hairy roots in general. With the help of the present work, relevant criteria concerning the application of the innovative measuring system RAMOS® for plant biotechnological investigations will be given. Furthermore, a survey over appropriate cultivation systems and published modelling strategies in plant biotechnology are introduced. A literature survey concerning model strategies regarding plant biotechnology completes this work.