Wheyruit slush formulas were evaluated prior to consumer testing of pre-selected formulated beverages. Varying ingredients were prepared in accordance to a factorial design of maximum use of whey and minimum use of additional ingredients. Whey was obtained from the Mississippi State University Dairy Processing Plant and evaporated. The evaporated sweet whey was combined with blueberries, cherry concentrate, Splenda®, water and ice. Sensory tests were conducted to evaluate appearance, flavor and overall acceptability of formulations. Panelists were asked to participate in a survey to elaborate personal perceptions of the products. Formulation of 125mL whey and 30g blueberries had the higher acceptability score, but was not different from the beverage with 150mL whey and 30g blueberries. These two formulas were tested for chemical analysis. Adequate levels of antioxidants, total phenolics and neutral pH were observed. Results from proximate analysis showed minimal caloric levels with low presence of protein and carbohydrate.

Die vorliegende Arbeit hatte vorrangig zum Ziel, die enzymatische Synthese von prebiotischen Galactooligosacchariden (GOS) in Süß- und Sauermolke unter Nutzung verschiedener Enzymquellen zu evaluieren. Aufgrund des tendenziell weltweit steigenden Molkenaufkommens besteht großes Interesse, eine möglichst ganzheitliche Wertschöpfung dieses teilweise ungenutzten Rohstoffs zu generieren. Eine Möglichkeit, um dies zu realisieren, wäre die Herstellung einer GOS-haltigen Molke und eine entsprechende Weiterverarbeitung zu GOS-haltigen Lebensmitteln. Durch die generell hohe Temperatur- und pH-Toleranz von GOS sind vielfältige Applikationsmöglichkeiten gegeben. Neben den kommerziell verfügbaren β-Galactosidasen aus Aspergillus oryzae und Kluyveromyces lactis wurden Enzyme aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (kurz: L. bulgaricus) und Cryptococcus laurentii im Labormaßstab hergestellt und charakterisiert. Mit beiden Enzymen konnten höhere GOS-Ausbeuten in niedrig konzentrierten Lactoselösungen (Puffer als auch Molke) erhalten werden als mit den beiden kommerziellen Enzymen. Während die β-Galactosidase aus K. lactis stark vom umgebenden Medium beeinflusst wird, so zeigen alle anderen Enzyme eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse von Puffer auf das Substrat Süß- bzw. Sauermolke. Die höchste Transgalactosylierungsaktivität weist das Enzym aus C. laurentii mit Ausbeuten von ca. 50 % (inkl. GOS-Disaccharide) auf. Bei Verwendung der L. bulgaricus-Lactase können die Gesamtausbeute als auch die GOS-Zusammensetzung in Abhängigkeit von der gewählten Synthesetemperatur gezielt beeinflusst werden. Des Weiteren wurde der Einfluss einer parallel zur Synthese stattfindenden Glucose-Entfernung durch enzymatische Oxidation untersucht. Trotz tendenziell begünstigter Synthese von Tri- und höheren Oligosacchariden konnte die Ausbeute mit A. oryzae nicht signifikant gesteigert werden. Die Kopplung mit K. lactis führte zu einer signifikant verringerten Synthese von GOS-Disacchariden, wodurch die Ausbeute insgesamt sank. Der Einsatz von Glucose-Oxidase und Katalase ist demnach nur bei β-Galactosidasen empfehlenswert, welche vorrangig Tri- und kaum Disaccharide synthetisieren. Der Einsatz mehrerer β-Galactosidase-Enzyme stellte sich als vielversprechend heraus. In Abhängigkeit von den jeweils kombinierten Enzymen konnte die Ausbeute teilweise gesteigert werden. Positiv erwies sich eine sequentielle Kombination von A. oryzae und K. lactis im Sinne der Steigerung der Gesamtausbeute und der parallele Einsatz von A. oryzae und C. laurentii im Sinne der Erhöhung der Strukturdiversität der GOS-Mischung.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194 / The prior aim of the present work was to study the synthesis of prebiotic galactooligosaccharides (GOS) in sweet and acid whey by using various enzyme origins. Worldwide, an increase in whey production can be observed, thus a complete usage of this partially wasted resource is preferable. This could be implemented by producing a GOS containing whey and its subsequent processing to GOS containing foods. Due to the high temperature stability over a wide pH range, manifold food applications are possible. Besides the commercial available β-galactosidases from Aspergillus oryzae and Kluyveromyces lactis, enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (short: L. bulgaricus) and Cryptococcus laurentii were produced on the laboratory scale and characterized accordingly. With both enzymes, higher GOS yields in low lactose solutions (buffer as well as whey) were achieved compared to the two commercial enzymes. While the β-galactosidase from K. lactis was strongly influenced by the surrounding environment, all other tested enzymes showed a good transferability of the results from buffer to sweet and acid whey, respectively. The enzyme from C. laurentii exhibited the highest affinity to transgalactosylation, the yield being about 50 % (including GOS disaccharides). When using the L. bulgaricus lactase, total GOS yield as well as GOS composition can be adjusted via the synthesis temperature. Furthermore, the effect of glucose depletion during GOS synthesis using enzymatic oxidation was examined. Although a tendency towards the synthesis of tri- and higher oligosaccharides was observed, GOS yield by A. oryzae was not significantly enhanced. The combination with the K. lactis enzyme led to a significantly reduced synthesis of GOS disaccharides, resulting in a decreased total GOS yield. Thus, the use of glucose oxidase and catalase is only beneficial for β-galactosidases, which have a preference for synthesizing trisaccharides, but less disaccharides. The use of more than one β-galactosidase has shown to be promising. Depending on the respective enzyme combinations, it was partially possible to enhance the GOS yield. Positive results in terms of increasing total GOS yield were obtained using a consecutive coupling of A. oryzae and K. lactis, while in terms of enhancing the structural diversity of the GOS mixture, a simultaneous combination of A. oryzae und C. laurentii led to the best results.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS XIII 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG 1 2 STAND DES WISSENS 4 2.1 Molke: Aufkommen, Inhaltsstoffe und Verwertungsmöglichkeiten 4 2.2 β-Galactosidasen 7 2.2.1 Aufbau und Eigenschaften 7 2.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren in Milch und Molke 8 2.2.3 Einfluss von Glucose und Galactose 9 2.2.4 Kommerzielle β-Galactosidase-Präparate 11 2.3 Galactooligosaccharide 12 2.3.1 Definition und Syntheseweg 12 2.3.2 Einflussgrößen auf die Reaktion 14 2.3.2.1 Enzymquelle 14 2.3.2.2 Lactosekonzentration 16 2.3.2.3 Reaktionsbedingungen 17 2.3.2.4 Einfluss von Glucose und Galactose 21 2.3.3 GOS-Synthese in Milch und Molke 22 2.3.4 GOS-Synthese mit Lactobacillus sp. 26 2.3.5 GOS-Synthese mit Cryptococcus laurentii 26 2.3.6 GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 27 2.3.7 Möglichkeiten der Glucose-Entfernung 27 2.3.8 Kommerziell erhältliche GOS-Produkte 28 2.3.9 Eigenschaften und Anwendung 30 2.3.10 Modifizierte GOS-Strukturen und GOS-Alternativen 32 3 MATERIAL UND METHODEN 40 3.1 Materialien 40 3.1.1 Verwendete Enzyme 40 3.1.2 Verwendete Mikroorganismen 40 3.1.3 Verwendete Molkeproben 40 3.1.4 Verwendete Geräte 40 3.2 Bestimmung der Inhaltsstoffe von Molke 40 3.3 Mikroorganismenkultivierung und Enzymgewinnung 41 3.3.1 Biochemische Analysenmethoden 41 3.3.2 Herstellung der Rohextrakte aus Lactobacillus sp. 41 3.3.3 Kultivierung im Labormaßstab 42 3.3.3.1 Lactobacillus bulgaricus LB4 42 3.3.3.2 Cryptococcus laurentii 43 3.3.4 Kultivierung im Fermentormaßstab (L. bulgaricus LB4) 43 3.4 Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität 43 3.4.1 β-Galactosidase 43 3.4.2 Glucose-Oxidase 44 3.4.3 Katalase 44 3.4.4 Berechnung der Enzymaktivität 45 3.5 Enzymcharakterisierung 45 3.5.1 Temperatur- und pH-Optimum 45 3.5.2 Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren 46 3.5.3 Enzymstabilität 46 3.6 Galactooligosaccharid-Synthese 47 3.6.1 Verwendung von kommerziellen β-Galactosidasen 47 3.6.2 Verwendung von β-Galactosidase aus Lactobacillus bulgaricus LB4 47 3.6.3 Verwendung von Cryptococcus laurentii-Zellen 47 3.6.4 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 48 3.6.5 Kopplung mehrerer β-Galactosidasen 48 3.7 Galactooligosaccharid-Analytik 49 3.8 Statistische Auswertung 50 4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51 4.1 Zusammensetzung der Molken 51 4.2 Charakterisierung der β-Galactosidasen 52 4.2.1 Temperatur- und pH-Optimum 52 4.2.2 Inhibitoren und Aktivatoren 55 4.2.3 Stabilität in Puffer und Molke 57 4.3 Synthese von Galactooligosacchariden 61 4.3.1 Synthese mit β-Galactosidase aus K. lactis 61 4.3.1.1 Synthese in Puffer 61 4.3.1.2 Synthese in Süßmolke 64 4.3.1.3 Synthese in Sauermolke 66 4.3.2 Synthese mit β-Galactosidase aus A. oryzae 67 4.3.2.1 Synthese in Puffer 67 4.3.2.2 Synthese in Süßmolke 69 4.3.2.3 Synthese in Sauermolke 70 4.3.3 Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 73 4.3.3.1 Synthese in Puffer 73 4.3.3.2 Synthese in Süßmolke 76 4.3.4 Synthese mit C. laurentii-Zellen 78 4.3.4.1 Synthese in Puffer 78 4.3.4.2 Synthese in Sauermolke 80 4.3.5 Vergleich der untersuchen Enzyme und Substrate 83 4.3.6 Kopplung mit Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.1 Charakterisierung von Glucose-Oxidase und Katalase 88 4.3.6.2 Einfluss simultaner Glucose-Entfernung auf die GOS-Ausbeute 90 4.3.6.3 Schlussfolgerungen 95 4.3.7 Kombination mehrerer β-Galactosidasen 95 4.3.7.1 Kopplung von A. oryzae und K. lactis 95 4.3.7.2 Kopplung von A. oryzae und C. laurentii 100 4.3.7.3 Schlussfolgerungen 105 4.4 Untersuchungen zur β-Galactosidase-Synthese mit L. bulgaricus LB4 106 4.4.1 Nährmedienumstellung auf koscher-/halal-zertifizierte Bestandteile 106 4.4.2 Kultivierung im Fermentormaßstab 111 5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 114 6 LITERATURVERZEICHNIS 118 7 ANHANG 140 7.1 Anhang zu Kapitel 2 140 7.2 Anhang zu Kapitel 3 165 7.2.1 Verwendete Geräte 165 7.2.2 Zusammensetzung MRS-Medium 166 7.2.3 Wachstum von C. laurentii 167 7.2.4 Anfangslactosekonzentrationen 167 7.2.5 Katalaseaktivität 168 7.2.6 Vergleich GOS-Disaccharidanalytik 169 7.3 Anhang zu Kapitel 4 170 7.3.1 Temperaturabhängigkeit von verschiedenen β-Galactosidasen 170 7.3.2 Aktivatoren und Inhibitoren 171 7.3.3 Grafiken zur β-Galactosidase-Stabilität 173 7.3.4 Katalase-Stabilität 182 7.3.5 Aminosäuresequenz von β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 183 7.3.6 Grafiken zur GOS-Synthese mit kommerziellen β-Galactosidasen 184 7.3.7 Grafiken zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus L. bulgaricus LB4 188 7.3.8 Daten zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase aus C. laurentii 190 7.3.9 Vergleich der maximalen GOS-Ausbeute in Puffer und Molke 191 7.3.10 Grafik zur GOS-Synthese mit β-Galactosidase/GOX/KAT 192 7.3.11 Grafiken zur GOS-Synthese mit mehreren β-Galactosidasen 193 7.3.12 Grafiken zur Kultivierung von L. bulgaricus LB4 194

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Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Doris Oliveira Gregianin.pdf: 1718205 bytes, checksum: 59a8cb966255e87e0fa3f347f2a191cb (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / The increased incidence of cardiovascular disease and various cancers have been the cause of searching for changing habits in a large portion of the population, seeking the physical activity in conjunction with the consumption of healthier foods with higher nutritional content. Considering the high biological value of the proteins of sweet whey and the recognized effect in reducing risk of cardiovascular disease of soy protein, the aim of this study was to develop a mixed chocolate-soluble soybean extract dissolved in sweet whey. The different proportions of carrageenan stabilizers, pectin and tapioca starch were defined by the experimental design of mixtures simplex centroid. By optimizing the response surface was definitely the best formulation in relation to the physic-chemical and sensory parameters. The simultaneous optimization of response variables indicated that the optimal formulation should contain 46% carrageenan and 54% pectin and 0% starch, with a desirability index of 0.929. The formulation indicated for the desirability function was made with water soluble soy extract dissolved in sweet whey and; on sweet whey with reduced lactose content. Serum was hydrolyzed by the action of lactase from Kluyveromyces lactis yeast enzyme at a concentration of 2500 NLU / L in reaction 4 hr at 37 ° C. The sensory attributes were evaluated by nine points hedonic scale and attitude scale in purchase intent. For overall impression, the formulations presented average value of 7.11 ±1.09, while purchase intent the average value was 3.99 ± 1.28, and the multiple regression models proved to be predictive. The most widely accepted formulations were those who had lower viscosity and instrumental containing pectin in its constitution. The results obtained indicate that the combination of sweet whey and soy aqueous extract is a viable option for the preparation of a chocolate beverage. It was also observed that the use of cassava starch as a thickener does not interfere negatively on the rheological and sensory characteristics and; that the combined carrageenan and pectin concentrations defined predictive model ensures greater acceptability of the product. / O aumento da incidência de doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer tem sido a causa da procura por mudanças de hábitos em grande parte da população, buscando-se a prática de atividades físicas em conjunto com o consumo de alimentos mais saudáveis, com maior valor nutricional. Considerando o alto valor biológico das proteínas do soro de leite doce e o reconhecido efeito na diminuição de risco de doenças cardiovasculares da proteína de soja, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um achocolatado misto de extrato hidrossolúvel de soja dissolvido em soro de leite doce. As diferentes proporções dos estabilizantes carragena, pectina e amido de mandioca foram definidas pelo planejamento experimental de misturas simplex centróide. Através da otimização da Superfície de Resposta foi definida a melhor formulação em relação aos parâmetros físico-químicos e sensoriais. A otimização simultânea das variáveis de resposta indicou que a formulação ideal deveria conter 46% de carragena e 54% de pectina e 0% de amido, com um índice de desejabilidade de 0,929. A formulação indicada pela função de desejabilidade foi elaborada com extrato hidrossolúvel de soja dissolvido em soro de leite doce e; em soro doce com teor de lactose reduzido. O soro foi hidrolisado pela ação da enzima lactase proveniente da levedura Kluyveromyces lactis, na concentração de 2.500 NLU/L numa reação de 4 horas à temperatura de 37°C. Os atributos sensoriais foram avaliados pela escala hedônica de nove pontos e escala de atitude na intenção de compra. Para impressão global as formulações apresentaram valor médio 7,11 ±1,09, enquanto que para intenção de compra o valor médio foi de 3,99 ±1,28, sendo que os modelos de regressão múltipla mostraram-se preditivos. As formulações mais aceitas foram aquelas que apresentaram menor viscosidade instrumental e que continham pectina em sua constituição. Os resultados obtidos indicam que a combinação do soro doce de leite e extrato aquoso de soja é uma opção viável para a elaboração de uma bebida achocolatada. Também foi possível observar que o uso do amido de mandioca como espessante não interfere negativamente nas características reológicas e sensoriais do produto e; que a carragena e pectinas combinadas, nas concentrações definidas pelo modelo preditivo, garantem maior aceitabilidade ao produto.