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La formation de podosomes dans les cellules endothéliales (Ces) aortiques en réponse au TGFβ est bien décrite in vitro (dans des boîtes de culture) et ex vivo (dans des segments de vaisseaux aortiques vivants). Le projet de cette thèse était de franchir l’étape suivante en démontrant la présence de podosomes in vivo en réponse à du TGFβ d’origine endogène. Pour ce faire, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées présentant spontanément des niveaux de TGFβ élevés dans la paroi aortique, raisonnant que cet environnement devrait être propice à l’apparition des structures. La souris Marfan (FbnC1039G/+) constitue le modèle murin de la maladie humaine appelée « syndrome de Marfan ». Chez la souris comme chez l’homme, une mutation dans le gène codant pour la fibrilline-1 conduit à une augmentation des niveaux de TGFβ dans la paroi aortique et dans le sang circulant. Nous avons utilisé ce modèle pour rechercher la présence de podosomes dans l'endothélium aortique. La visualisation « en face » de l'endothélium marqué pour l’actine fibrillaire, la cortactine, la protéine adaptatrice Tks5 et la metalloprotéase MT1-MMP, a révélé des rosettes de podosomes semblables à celles détectées ex vivo en réponse à du TGFβ d’origine exogène. Ces rosettes peuvent être trouvées dans l'endothélium de l'aorte ascendante ou descendante. L’analyse du tissu sous-jacent révèle une détérioration de la lame basale qui apparait parsemée de zones dépourvues d’un de ses constituants majeurs, le collagène IV. Nous émettons l'hypothèse que les rosettes de podosomes sont impliquées dans la formation de ces zones de dégradation du collagène IV. Pour examiner les conséquences du déficit en fibrilline-1 pour les CEs et confirmer les données in vivo concernant la souris Marfan, nous avons utilisé deux approches in vitro. D’abord, nous avons mis au point un protocole pour isoler les CEs aortiques à partir des souris Marfan. Ensuite, nous avons, par la stratégie des siRNA, procédé à la déplétion en fibrilline-1 de CEs aortiques d’origine bovine (BAEc). Les cellules endothéliales aortiques isolées des souris Marfan conservent in vitro le phénotype « TGFβ » et forment podosomes capables de dégrader la matrice extracellulaire sans aucune stimulation exogène. Dans le modèle des cellules BAE, le dosage du TGFβ indique que, in vitro, la déplétion de ces cellules en fibrilline-1 provoque une augmentation de TGFβ biologiquement actif associé à la fraction cellulaire. Ce TGFβ conduit alors à la formation de podosomes dans les CEs. Nous avons observé d’autres conséquences du déficit en fibriline-1 dans l’endothélium in situ. L’analyse topologique de la surface de l’endothélium aortique de la souris Marfan révèle des phénomènes de « blebbing », des filopodes, des anomalies des jonctions cellules-cellules. L’analyse ultrastructurale en microscopie électronique à transmission révèle que l’endothélium de la souris Marfan a une apparence radicalement distincte de celui observé chez les témoins sauvages. La lame élastique, fragilisée par le déficit en fibrilline-1, disparaît comme digérée, par endroits. On observe une sécrétion anormale de matrice extracellulaire. Les cellules présentent un phénotype activé ou des signes d’apoptose. Ces études fournissent la première démonstration de l'apparition de podosomes endothéliaux in vivo et suggèrent leur implication en physiopathologie vasculaire. Elles fournissent également la première démonstration que l’endothelium aortique est profondément modifié dans le modèle murin de la maladie de Marfan. / Podosome formation in aortic endothelial cells exposed to TGFβ has been well described in vitro (in tissue culture dishes) and ex vivo (in living aortic vessel segments). The aim of the project was to go to the next step and demonstrate the occurrence of podosomes in vivo in response to endogenous TGFβ. For this purpose, we chose to use a genetically engineered mouse model, which spontaneously presents high TGFβ levels in the aorta, reasoning that this would be a favorable environment for these structures to appear. Marfan mice represent the murine model of the human disease Marfan syndrome. Similar to the human disease, a mutation in the fibrillin-1 gene (C1039G/+) leads to enhanced TGFβ levels in the aortic wall as well as in circulating blood. We therefore used the Marfan mouse model in search of podosomes in the aortic endothelium. “En face” viewing of the endothelium stained for filamentous actin, cortactin, Tks5 adaptator protein and MT1-MMP metalloprotease detected podosome rosettes with features similar to those detected in the ex vivo situation. Podosome rosettes were found in both descending and ascending aorta. Analysis of the underlying tissue with collagen IV staining revealed a basement membrane scattered with staining-free patches, most likely corresponding to collagen IV degradation. We propose that podosome rosettes are involved in basement membrane degradation in this mouse. To examine the consequences of fibrillin-1 deficiency in endothelial cells and confirm the data obtained in vivo in Marfan mouse aorta, we used two in vitro approaches. First, we set up a protocol to isolate aortic endothelial cells from Marfan aortas, second, we depleted fibrillin-1 from BAE cells by siRNA silencing. Isolated Marfan aortic endothelial cells retained in vitro the TGFβ activated phenotype and formed functional podosomes without any exogenous stimulation. TGFβ levels measurements in fibrillin-1 depleted aortic endothelial cells confirmed that fibrillin-1 deficiency triggers an increase in active, cell associated TGFβ, which in turns, leads to podosome formation in endothelial cells. Finally we studied other alterations caused by the fibrillin-1 defect at the endothelial cell level in situ. Topological analysis of the Marfan mouse aortic endothelium monolayer revealed cell blebbing, numerous filopodia and showed altered cell-cell junctions. At the ultrastructural level, transmission electronic microscopy revealed that the Marfan mouse endothelium had an appearance dramatically distinct from that observed in control littermates. The elastic lamina, weakened by fibrillin-1 deficit, disappeared in some places. The vessel wall also showed abundant extracellular matrix proteins. Endothelial cells presented an activated or apoptotic phenotype. These studies provide the first demonstration for the occurrence of endothelial podosomes in vivo and suggest their involvement in vascular physiopathology. In addition, they provide evidence that the aortic endothelium is profoundly altered in the murine model of Marfan syndrome.

La fibrilline-1, composant majeur des microfibrilles et second composant majeur des fibres élastiques, est une glycoprotéine dont la mutation du gène chez l'humain est responsable du syndrome de Marfan, caractérisé par des anévrismes et des dissections aortiques. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié d'une part le rôle de la fibrilline-1 dans la physiologie des cellules endothéliales vasculaires humaines et d'autre part la conséquence du déficit quantitatif de la fibrilline-1 sur la structure et la fonction du système cardiovasculaire au cours du vieillissement chez la souris. Le fragment de fibrilline-1 "PF14" induit une signalisation calcique via les intégrines α5β1 et αvβ3, l'activation de la phospholipase C et la mobilisation des réserves intracellulaires de calcium, ainsi que la prolifération et la migration des cellules endothéliales humaines. La déficience quantitative sévère ou totale de la fibrilline-1 entraîne une létalité chez la souris dans les deux semaines après la naissance alors que celle, partielle, due à la délétion hétérozygote hypomorphique des exons 19 à 24 du gène de la fibrilline-1 (délétion mgΔ) n'affecte pas la longévité des souris. Les souris Fbn-1+/mgΔ présentent une hypertrophie cardiaque et une hypotension ainsi que des anévrismes aortiques qui deviennent plus fréquents avec l'âge. La paroi aortique de ces souris présente des altérations structurales (fragmentations des lames élastiques), biomécaniques (l'augmentation de la rigidité) et de la vasomotricité, qui s'accentuent avec l'âge. Nos résultats suggèrent que la déficience quantitative de la fibrilline-1 pourrait altérer la signalisation que cette protéine déclenche normalement dans les cellules endothéliales dès la phase de morphogénèse artérielle, et induire en conséquence une pathologie anévrismale de la paroi aortique au cours du vieillissement. Les effets opposés des déficiences quantitatives en fibrilline-1 et en élastine sur la fonction vasculaire suggèrent des rôles opposés pour ces deux composants majeurs des fibres élastiques. Ce travail permet par ailleurs de valider les souris Fbn-1+/mgΔ, tant sur le plan structural que fonctionnel, comme modèle du syndrome de Marfan.

Le syndrome de Marfan (MFS) est une maladie génétique rare. Les signes cliniques sont principalement squelettiques, oculaires et cardiovasculaires. Le premier gène identifié est FBN1. Une LSDB UMD créée en 1995 a permis de colliger les mutations identifiées chez les patients. D’autres gènes ont été identifiés comme causant des syndromes apparentés : FBN2, TGFBR1, TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 et MYLK. Ma thèse avait pour but de mettre à jour ces différentes bases et de créer celles des nouveaux gènes. Les techniques de séquençage nouvelle génération dans la pratique clinique amènent des médecins non spécialistes à rapporter des variations secondaires dans ces gènes « actionable ». Il s’agit de la ressource la plus complète pour les cliniciens et les généticiens pour interpréter les variants associés au MFS et ses pathologies associées pour les variants primaires et secondaires.La bicuspidie de la valve aortique (2 feuillets au lieu de 3) est la malformation cardiovasculaire la plus fréquente touchant 0,6 à 2 % de la population. Ma thèse avait pour but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la BAV. Grâce à une cohorte de 200 patients, le gène HOXA1, un facteur de transcription, a pu être examiné de manière plus approfondie. Alors qu’il contient une répétition de 10 histidines, les individus hétérozygotes mutés en présentent 11. Mes études ont permis de démontrer l’imputabilité de cette mutation. Dans un second temps, un séquençage d’exomes entiers a permis de mettre en évidence de nouveaux variants prédits pathogènes. Ces données permettront de mieux comprendre le rôle physiologique d’HOXA1 et des nouveaux gènes candidats dans la pathogénèse de la BAV chez l’humain. / Marfan Syndrome is a rare genetic disorder. Clinical signs are mainly skeletal, ocular and cardiovascular. The first gene identified is FBN1. A LSDB UMD was created in 1995 to colligate all the mutations identified in. Thereafter, several others genes were identified involved in related disorders : FBN2, TGFBR1 and TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 and MYLK. The objectives of my PhD were to update these databases and to create new ones for genes. Next generation sequencing in clinical practice leads non-specialized doctors to report pathogenic secondary variants in “actionable” genes. Our databases are the only resources providing access to the full spectrum of known pathogenic mutations with checked and interpreted data from many reference diagnostic laboratories and research centers worldwide, and the most comprehensive resources for clinicians and geneticists to interpret variations linked to Marfan syndrome and related disorders not only primary but also secondary variants.Bicuspid Aortic Valve is the most common cardiovascular malformation affecting 0.6-2% of the population (2 leaflets instead of 3). Thanks to a cohort of 200 BAV patients, HOXA1 gene, a transcription factor, has been screened. While HOXA1 contains a string of 10 histidine repeats, these individuals are heterozygous for an 11 histidine repeat variant. My studies showed the imputability of this mutation. In a second phase, whole exome sequencing allow us to highlight new variants predicted pathogenic. Studies are still ongoing to confirm their imputability. These data contribute to our better understanding of the physiological of HOXA1 and new candidate genes in the pathogenesis of BAV disease in humans.