Plusieurs populations de cellules immunitaires possèdent une activité cytotoxique permettant l'élimination de cellules altérées. Cette fonction cellulaire est ainsi déterminante dans le contrôle des infections, des processus tumoraux, ou encore des maladies inflammatoires chroniques. Mon projet de thèse se concentre sur des aspects fondamentaux de l'activité lytique de deux populations de lymphocytes T cytotoxiques : les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1. Pour cela, l'exploration des mécanismes de cette activité a été conduite au travers de deux modèles, pathologique et thérapeutique, à différentes échelles biologiques : au niveau de la population ou de la cellule individuelle, mais aussi différentes échelles d'organisations moléculaires : cellulaire et nanoscopique. Nous avons pu démontrer que l'activité de lyse de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques face à un excès de cellules cibles est efficace sur des temps prolongés, reposant sur une capacité individuelle fortement hétérogène à effectuer une lyse multiple. L'importance de cette activité de lyse soutenue a été renforcée par l'identification d'un défaut lytique particulièrement prononcé sur le long- terme chez des lymphocytes T CD8+ issus de patients atteints du syndrome de Wiskott-Aldrich. Ce défaut est lié à une activation réduite de l'intégrine LFA-1 et un délai dans la délivrance du coup létal. De plus, la protéine WASP permet de restreindre LFA-1 de haute-affinité en nanoclusters denses ainsi que de permettre l'organisation en un ring de LFA-1 et la localisation des granules lytiques à l'intérieur de celui-ci. Par ailleurs, les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1 développés dans le cadre d'une thérapie cellulaire (Ovasave(r)) démontrent une capacité de lyse envers les cellules myéloïdes, en complément d'une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T conventionnels. Cette activité est mise en place sur du long-terme, jusqu'à atteindre une efficacité optimale, lié à un délai dans la délivrance du coup létal. De manière surprenante, malgré une spécificité pour l'ovalbumine, l'activité cytotoxique semble être indépendante de l'activation du TCR. En outre, la lyse est granzyme-dépendante mais perforine-indépendante. Ainsi ces lymphocytes T thérapeutiques manifestent une activité cytotoxique alternative. Pour conclure, mon projet de thèse a permis de caractériser une activité de lyse soutenue basée sur une capacité individuelle hétérogène. Cette habilité à soutenir une lyse sur du long-terme implique une stabilité de la synapse, où WASP joue notamment un rôle clé pour l'activation et l'organisation de LFA-1. Les lymphocytes T régulateurs thérapeutiques démontrent aussi une activité de lyse soutenue, cependant les acteurs moléculaires sont non conventionnels. De manière générale, une activité de lyse soutenue permettrait de calibrer une réponse cytotoxique prolongée en rapport à la taille de la population cible, ainsi que le partage avec d'autres fonctions cellulaires comme la sécrétion de cytokines. / During different pathological conditions such as infections, tumoral processes or chronic inflammation diseases, altered cells are eliminated through a cytotoxic activity mediated by several immune cell populations. This cellular function is therefore crucial for carrying out the action of the immune system. My thesis project focuses on fundamental aspects of the lytic activity of two cytotoxic lymphocyte populations: CD8+ T cells and type-1 CD4+ regulatory T cells. To explore the mechanisms of this activity, this study has been driven on two cases, pathological and therapeutic models, at the population and single-cell levels and also at the cellular and nanoscopic scales of the molecular organisation. We have been able to demonstrate that the CD8+ T cell lysis activity against an excess of target cells is effective over prolonged periods, relying on a highly heterogeneous individual capacity to perform multiple lysis. The importance of this sustained cytotoxic activity was reinforced by the identification of a lytic defect, particularly pronounced on a long time period, of CD8+ T cells from Wiskott-Aldrich syndrome patients. This defect is related to a reduced activation of the LFA-1 integrin and delay in the lethal hit delivery. In addition, the WASP protein allows to restrict high affinity LFA-1 to dense nanoclusters as well as the assembly of LFA- 1 ring and the localization of the lytic granules inside this ring. Moreover, type-1 CD4+ regulatory T cells from a cellular therapy (Ovasave(r)) demonstrated a cytotoxic activity toward myeloid cells, additionally to an immunosuppressive activity on conventional T cells. This activity is implemented over long time periods, until reaching optimal efficiency, and is related to a delay in the lethal hit delivery. Surprisingly, despite a specificity for ovalbumin, the cytotoxic activity measured in absence of the antigen suggests a TCR independence. In addition, lysis is not mediated by perforin but is exclusively granzyme-dependent. Thus, these therapeutic T cells exhibit an alternative cytotoxic activity. To conclude, my thesis project permits to characterize a sustained lysis activity relying on a heterogeneous individual capacity. This ability to sustain a lytic activity involves stability of the synapse, where WASP plays a key role towards the activation and organization of LFA-1. The therapeutic regulatory T lymphocytes also demonstrated a sustained cytotoxic activity, however the molecular actors are unconventional. On the whole, sustained lytic activity would be key to the calibration of cytotoxic responses in relation to the size of the target population, as well as sharing with other cellular functions such as cytokine secretion.

En fonction du contexte génétique d’un individu et de son environnement, les mutations responsables de certaines maladies génétiques peuvent avoir des effets différents. Ces effets créent donc un besoin pour des traitements médicaux personnalisés. Ces traitements, pour être développés, demandent une meilleure compréhension de l’implication du contexte génétique au niveau moléculaire, incluant le mode d’action des gènes modificateurs. Pour mieux comprendre leur mode d’action, dans le cadre de mon projet, j’utilise un modèle du Syndrome de Wiskott-Aldrich chez la levure Saccharomyces cerevisiae impliquant le gène LAS17. Grâce à des expériences d’évolution expérimentale, des gènes ciblés par des mutations et, par la suite, une molécule ont été identifiés permettant de corriger le phénotype malade. Dans certains cas, cette correction est spécifique au contexte génétique et la majorité des gènes ciblés codent pour des partenaires d’interaction physique de Las17p. Une exception est la sous-unité Cnb1p de la calcineurine, la protéine ciblée par la cyclosporine A, qui ne fait pas partie de ces partenaires. La réponse à cette molécule est pourtant spécifique à un contexte génétique. J’ai utilisé différentes approches, dont des analyses QTL, pour identifier les gènes modificateurs sous-jacents à cette spécificité. Plusieurs locus ont été identifiés et la plupart incluaient des gènes au niveau du réseau d’interaction protéique ou génétique de Las17p et des sous-unités de la calcineurine. Le gène candidat principal, END3, un interactant physique de Las17p, semble présenter des effets de dosage au niveau protéique. Les liens avec la littérature suggèrent une importance dans la balance protéique de réseaux d’interaction à la fois du gène causant la maladie et celui ciblé par le traitement. L’ensemble des résultats du modèle soutiennent l’importance de tenir compte du contexte génétique pour élaborer de nouveaux traitements et suggèrent que les partenaires d’interactions devraient être les principales cibles de ces interventions. / Depending on the genetic background of an individual and their environment, the mutations responsible for some genetic diseases may have different effects. These effects create a need for personalized medical treatments. To be developed, these treatments require a better understanding of the implication of the genetic background at the molecular level, including the mode of action of modifier genes. To better understand their mode of action, as part of my project, I used a model of the Wiskott-Aldrich Syndrome in the yeast Saccharomyces cerevisiae involving the LAS17 gene. Through experimental evolution experiments, several genes targeted by mutations and, subsequently, a molecule have been identified to rescue the diseased phenotype in yeast. In some cases, this phenotypic rescue was specific to the genetic context and the majority of the targeted genes coded for Las17p physical interaction partners. An exception was the Cnb1p subunit of calcineurin, the protein targeted by cyclosporin A, which was not one of these partners. The response to this molecule was nevertheless specific to a genetic background. I used different approaches, including QTL analysis, to identify modifier genes underlying this specificity. Several loci were identified and most of them included genes in the protein or genetic interaction networks of Las17p and of calcineurin subunits. The main candidate gene, END3, a physical interactant of Las17p, appeared to exhibit protein-level effects. The literature suggests an importance in the protein balance of the interaction networks of both the gene causing the disease and the one targeted by the treatment. The overall model results support the importance of considering the genetic background for developing new treatments and suggest that interaction partners should be primary targets for these interventions.

Thèse de doctorat : Bioingénierie : Nancy 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre.