Les protéines de choc thermiques (HSP) sont des chaperons moléculaires qui stabilisent le pliage et la conformation de protéines normales et oncogéniques, prévenant la formation d'agrégats protéiques. Elles sont impliquées dans la régulation de l'apoptose, de la survie cellulaire et dans la cancérogénèse. HSP90 est la protéine chaperone majeure de stabilisation d'oncogènes impliqués dans les hémopathies malignes. L'objectif de notre travail était de déterminer l'implication de HSP90 dans différents types d'hémopathies malignes, les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM), les Syndromes Myélodysplasiques (SMD) et les Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL), et de tester son inhibition par un inhibiteur spécifique, la tanespimycine (17- AAG). Dans les LAM, nous avons évalué l'implication des différentes isoformes de la protéine dans la résistance aux chimiothérapies et aux inhibiteurs de HSP90. Ce travail met en évidence la valeur péjorative de l'expression de HSP90 dans les différents sous types d'hémopathies, corrélant avec un risque de rechute élevé ou d'évolution vers des formes plus agressives. L'utilisation de la tanespimycine a permis de déclencher l'apoptose dans les cellules immatures impliquées dans ces pathologies. HSP90 constitue donc une protéine majeure de la cellule leucémique, et son ciblage offre des perspectives intéressantes dans le traitement des hémopathies malignes / Heat shock proteins (HSP) are molecular chaperones that stabilize the folding and conformation of normal and oncogenic proteins, preventing the formation of protein aggregates. They are involved in the regulation of apoptosis, cell survival and carcinogenesis. HSP90 is the major chaperone implicated in stabilization of oncogenes involved in hematologic malignancies. The aim of our study was to determine the involvement of HSP90 in various types of malignancies, Acute Myeloid Leukemia (AML), Myelodysplastic Syndromes (MDS) and Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and to test its inhibition by a specific inhibitor, the tanespimycine (17-AAG). In acute myeloid leukemia, we evaluated the involvement of different isoforms of the protein in resistance to chemotherapy and inhibitors of HSP90. This work highlights the pejorative value of HSP90 expression in different subtypes of malignancies, correlated with a high risk of relapse or progression to more aggressive forms. Use of tanespimycine has triggered apoptosis in immature cells involved in these diseases. HSP90 is therefore a major protein of the leukemic cell and its targeting offers interesting perspectives in the treatment of hematologic malignancies

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) peuvent être conçus comme des conditions pré-leucémiques dans lesquelles l’apoptose avorte les produits de différenciation de cellules souches mutées, potentiellement malignes. Néanmoins, peut-être à cause d’une inhibition progressive de l’apoptose, les SMD se transforment fréquemment en leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nos données indiquent que les SMD à faible risque se caractérisent par l’absence d’activation de NF-κB au sein des cellules portant des altérations cytogénétiques typiques. Par contre, dans les SMD à haut risque de transformation en LAM (ainsi que dans les LAM post-SMD), les cellules souches hématopoïétiques et leurs produits de différenciation montrent une translocation activatrice des sous-unités p50/p65 de NF-κB. L’utilisation d’antagonistes de IKK provoque une inhibition de NF-κB conduisant à une apoptose accélérée, ainsi l’activation de NF-κB serait responsable de la suppression progressive de l’apoptose et donc de la transformation maligne. Ce projet de thèse a consisté à comprendre les mécanismes impliqués dans la dérégulation de l’apoptose dans les SMD/LAM ; ainsi qu’à utiliser des technologies de criblage pour permettre une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées, et à adapter de nouveaux outils d’analyse. Au cours d’une première étude, nous avons montré que les inhibiteurs de méthyltransférase de l’ADN et les inhibiteurs d’histones déacétylases induisent efficacement l’apoptose dans la lignée cellulaire SMD/LAM P39, parallèlement à une inhibition de la translocation de NF-κB du cytoplasme au noyau. Dans une seconde étude, nous avons montré que l’inhibition pharmacologique du récepteur Flt3 induit une inhibition de la voie NF-κB, et pourrait être une cible thérapeutique pertinente. Dans une troisième étude, nous avons montré que l’auto-activation d’ATM chez les patients atteints de SMD/LAM joue un rôle dans l’activation constitutive de NF-κB suggérant qu’ATM serait également une bonne cible thérapeutique dont l’inhibition pourrait réduire le défaut d’apoptose des cellules SMD et LAM. Et enfin, grâce à l’optimisation d’une technique d’analyse d’images à haut débit, nous avons identifié deux composés capables d’induire la mort cellulaire des lignées cellulaires LAM in vitro : le zinc pyrithione et la ouabain. Leurs effets d’inhibition du signal de survie NF-κB, conduisant à une réduction de l’expression de protéines anti-apoptotiques, suggèrent que ces composés pharmaceutiques pourraient être utilisés comme des agents anti-leucémiques. Ce projet de thèse nous a permis de mettre en évidence le potentiel anti-leucémique de différents agents impliqués dans les principales voies de signalisation de l’apoptose dérégulées dans les SMD/LAM, qui pourraient prochainement servir de cibles pour de nouveaux essais thérapeutiques. / Myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of hematopoietic stem cell disorders that is characterized by an ineffective hematopoiesis (finaly leading to blood cytopenias) and by a high risk of progression to acute myeloid leukemia (AML). It can therefore be viewed as a preleukemic condition in which apoptosis aborts the differentiation products of potentially malignant mutated (stem) cells. The progression of MDS into AML is associated with progressive inhibition of apoptotsis (by e.g. the expression of antiapoptotic proteins) and a negative prognostic value, suggesting that loss of the apoptotic program could favor the MDS-to-AML transition. Therefore the present project aimed at understanding the mechanisms involved in the deregulation of apoptosis in MDS and AML and the characterization of their underlying signaling pathways by means of standard biochemical and high throughput screening approaches. Our previous work showed that inhibitors of DNA methyltransferases and histone deacetylases effectively induced apoptosis in AML cells in vivo which was associated with an inhibition of NF-κB-dependent transactivation of survival signals. We further found that the pharmacological inhibition of the Flt3 receptor in AML cells decreased NF-κB activation and might therefore constitute a relevant therapeutic target for the treatment of AML. In line with these findings we demonstrated that the constitutive activation of ATM in high-risk MDS and AML patients accounts for the activation of NF-κB suggesting ATM as yet another drugable target for antileukemic therapy. Finally we generated a high throughput image based screening platform, which enabled us to perform large scale drug screening approaches and to identify two compounds with antileukemic properties. Both agent, pyrithione zinc (PZ) and Ouabain (OUA) efficiently induced cell death in AML cells in vitro associated with the inhibition of NF-κB. PZ and OUA exerted significant anticancer effects in vivo, on human AML cells xenografts as well as ex vivo, on CD34+ (but not CD34-) malignant myeloblasts from AML patients. Summarizing this project allowed us to shed some light on the importance of NF-κB during MDS to AML progression and at the same time it helped to identify drugable targets and agents with potential anticancer properties for the treatment of leukemia.

Ce projet de thèse portait sur le développement d’outils microfluidiques pour la toxicologie et la recherche contre le cancer. En permettant l’analyse simultanée d’un très grand nombre de réactions biologiques ou chimiques réalisés dans des compartiments indépendants (ie. gouttelettes), la microfluidique de gouttes offre une sensibilité de détection et une précision sans précédent pour l’analyse de molécules biologiques, telles que l’ADN ou les Anticorps, en comparaison des expériences réalisées conventionnellement en tubes ou en microplaques (essais en « bulk » ou volume). Ce format permet également de réaliser des expériences à très haut débit et est particulièrement pertinent pour la toxicologie, où des analyses robustes de l’effet des médicaments sont nécessaires. De même, ces procédures sont également très adaptées à l’analyse de cellules uniques pour le séquençage ADN ou ARN et l’épigénomique. Tout cela fait de la microfluidique en goutte un outil puissant pour la toxicologie et la recherche sur le cancer. En premier temps, une méthode du comptage précise des cellules encapsulée dans des microgouttelettes, nommée « hémocytométrie microfluidique », a été développée. Un nouvel algorithme de comptage a été proposé. Des cellules bactériennes (Escherichia Coli) et des cellules de 2 lignées humaines différentes (HL60 and H1975) ont été testées. Le nombre de chaque type de cellules a été déterminé avec une haute corrélation entre la théorie (basée sur la distribution de Poisson) et les résultats expérimentaux. Avec ces résultats robustes, un protocole de microfluidique en goutte a été mis en place pour interroger la viabilité cellulaire et la prolifération des 2 lignées humaines. Ces résultats sont en concordance avec ceux de la littérature. Pour la toxicologie, 3 différents modèles, y compris des microsomes (extrait de cellules d’insectes infectées par un baculovirus exprimant le cytochrome P450 3A4 humain, CYP3A4), HepG2-CYP3A4 (modifiée génétiquement pour exprimer le gène CYP3A4 humain), et HepaRG, une lignée hépatique, ont été évaluées pour l’activité enzymatique du CYP3A4, une enzyme largement utilisée en routine pour le criblage de médicament candidat. Les microsomes ont permis de développer un essai fluorogénique permettant de mesurer l’inhibition du CYP3A4. Cependant, ni l’utilisation des microsomes ni des cellules HepG2 exprimant CYP3A4 n’a donné de résultats satisfaisants en microgouttelettes. L’utilisation des cellules HepaRG, une lignée cellulaire qui conserve la majorité de l’expression des cytochromes P450 et des récepteurs nucléaires nécessaire à leur expression, a montré des résultats encourageant à la fois sur les tests de mesure de l’activité enzymatique et d’analyse de l’induction du CYP3A4. Pour la recherche sur le cancer, 4 essais originaux de PCR digitale en gouttes ont été mis en place pour la détection et la quantification de mutations (NRAS, DNMT3A, SF3B1 and JAK2) importante pour les syndromes myélodysplasiques, un groupe hétérogène de maladies touchant les cellules souches hématopoïétiques caractérisées par une hématopoïèse inefficace et des cytopénies périphériques. Finalement, un essai de PCR sur cellule unique encapsulées au sein de billes agarose a été proposé. / This thesis project consists in developing droplet-based microfluidic tools for toxicology and cancer research. Owing to its large numbers of discretized volumes, sensitivity of detection of droplet-based microfluidics for biological molecules such as DNA and antibody is much higher than bulk assays. This high throughput format is particularly suitable for experiments where a robust dose-response curve is needed, as well as for single cell analysis with applications in genomic or sequencing and epigenetics. All above makes droplet-based microfluidics a powerful tool for toxicology and cancer research. In a first part of the work, an accurate cell counting method, named “microfluidics hemocytometry”, has been developed. A new counting algorithm was proposed to count the cells within each droplet. Escherichia Coli and two different human cell lines (HL60 and H1975) were used to validate our strategy. The number of each type of cells in droplets was determined with a high consistency between theory (Poisson distribution) and experimental results. With these robust results, a droplet-based microfluidic protocol has then been established to inquiry both cell viability and proliferation for the two human cell lines. The results are in good agreement with the one of the literature. For the toxicology, 3 different biological models, including microsomes (extracted from baculovirus-infected insect cell expressing human CYP3A4), HepG2-CYP3A4 (genetically modified to express the human CYP3A4 gene) and HepaRG liver cells lines were evaluated for enzymatic activity of cytochromes P450 (CYP3A4), a routinely used enzyme for drug candidate screening. Microsome-based assays were used to validate a fluorogenic inhibition assay. However neither microsome-based assay nor the assay using CYP3A4 expressing HepG2 gave satisfying results in droplet-based format. However, HepaRG cells, a hepatic function-conserved cell line with most cytochrome and related nuclear receptors, demonstrated high relevance both for enzymatic activity testing and CYP3A4 expression induction study. For cancer research, 4 different picoliter droplet-based PCR assays were developed for the detection and quantification of mutations (NRAS, DNMT3A, SF3B1 and JAK2) present in Myelodysplastic syndromes, a heterogeneous group of clonal bone marrow hematopoietic stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis and peripheral cytopenias. Furthermore, a single cell multistep PCR assay using encapsulation of target DNA in agarose droplets was proposed.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) forment un groupe de pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique (CSH) caractérisées par une hématopoïèse inefficace. La présence d’au moins une anomalie génétique (anomalie cytogénétique ou mutation somatique) est observée dans plus de 90% des cas. Ainsi, plusieurs clones moléculaires pouvaient coexister au moment du diagnostic de la maladie. Dans les SMD avec délétion du chromosome 5 (del(5q)), il a récemment été montré que les anomalies étaient présentes dès le stade de la CSH. Dans les SMD, la pénétrance des anomalies génétiques décrites est incomplète. De plus, peu de choses sont actuellement connues sur l’ordre d’apparition des mutations et leur impact fonctionnel sur les différents clones moléculaires dans le cas des SMD non-del(5q). Grâce au séquençage d’exome entier (WES) de patients ne présentant aucune mutation dans les gènes décrits dans les SMD, nous avons décrit l’existence de mutations dans les gènes BCOR et BCORL1, chez respectivement 4,2% et 0,8% des patients. Les mutations du gène BCOR arrivent tardivement au cours de l’évolution de la maladie et affectent le pronostic des patients. Des approches à l’échelle unicellulaire nous ont également permis d’observer que la majeure partie des mutations identifiées chez les patients sont retrouvées dès le stade CD34+CD38-. Chez les patients, plusieurs clones moléculaires coexistent à ce stade. De plus, les mutations des gènes de l’épissage et de la régulation épigénétique sont fréquemment acquises en premier dans les cellules hématopoïétiques les plus immatures des patients porteurs de SMD. Nous avons observé que certaines mutations, acquises secondairement, sont réparties inégalement dans les différents compartiments hématopoïétiques et peuvent avoir un impact sur la différenciation hématopoïétique. Enfin, nous montrons que la répartition des clones moléculaires évolue au cours du temps. En réponse au traitement par Lenalidomide, on observe également une évolution rapide de l’architecture clonale qui peut être liée au statut de réponse des patients. Ces résultats tendent à confirmer l’hétérogénéité génétique mais aussi fonctionnelle des SMD. Nous avons pu identifier de nouvelles mutations impliquées secondairement dans la physiopathologie des SMD. Il existe une dominance clonale précoce dans les SMD du fait de l’acquisition de toutes les mutations dans les cellules hématopoïétiques immatures. Cependant, les différentes populations hématopoïétiques peuvent présenter des génotypes différents. Enfin cette architecture est variable au cours de l’évolution de la maladie. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group of clonal disorders of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by ineffective hematopoiesis. At least one genetic abnormality (cytogenetic abnormality or somatic mutation) is observed in more than 90% of cases. Thus, it has been observed several molecular clones which could coexist at diagnosis of the disease. In MDS with deletion of chromosome 5 (del (5q)), it has recently been shown that defects were present in the HSC. In MDS, the penetrance of genetic abnormalities described is incomplete. In addition, little is currently known about the order of appearance of mutations and their functional impact on different molecular clones in the case of non-del (5q) MDS. Through the whole exome sequencing (WES) of patients without mutation in the genes described in MDS, we described the existence of mutations in genes BCOR and BCORL1, in respectively 4.2% and 0.8% of patients. Mutations in the gene BCOR were acquired lately during the course of the disease and affect the prognosis of patients. Approaches at the single cell level have also allowed us to observe that most of the mutations identified in patients are found at the immature differentiation stage CD34+CD38-. In patients, several molecular clones could coexist at this stage. In addition, mutations in gene splicing and epigenetic regulation are frequently first acquired in the most immature hematopoietic cells of MDS patients. We found that certain mutations, acquired in a second time, are distributed unevenly in different hematopoietic compartment and may have an impact on hematopoietic differentiation. Finally, we showed that the distribution of molecular clones evolves over time. In response to treatment with Lenalidomide, it has also been observed a rapid evolution of clonal architecture that can be linked to patient response status. These results tend to confirm the genetic but also functional heterogeneity in MDS. We have identified new mutations involved in the pathogenesis of MDS. We observed an early clonal dominance in MDS because of the acquisition of all mutations in immature hematopoietic cells. However, different hematopoietic populations can have different genotype. Finally, the architecture of mutations could be modifying during the course of the disease.

La FAK est une tyrosine kinase cytoplasmique qui régule divers processus cellulaires, dont la survie, la prolifération, la différenciation et la motilité. Bien que diverses études aient démontré l'importance du FAK dans la pathogenèse du SMD et de la LAM, le rôle de cette molécule dans le microenvironnement des tumeurs du SMD et de la LAM reste à déterminer davantage. En examinant les CSM de la moelle osseuse qui dérivent de patients atteints de SMD et de LAM, nous avons observé une augmentation continue de l'expression et de l'activation de la FAK pendant la progression du SMD vers de la LAM, semblable à celle observée chez les patients hémopoïétiques. Dans le SMD à faible risque, on a constaté que les CSM se caractérisaient par une faible expression et une faible activation du FAK. Ils présentaient une morphologie modifiée, un immunophénotype, une différenciation et l'expression de facteurs favorables à l'hématopoïèse. Il convient de noter que ces caractéristiques pourraient être largement reproduites dans les CSM saines par inhibition FAK. De plus, l'appauvrissement en FAK dans la lignée cellulaire stromale pourrait induire une expansion massive et l'apoptose des CSH normaux. Nos résultats mettent en évidence le rôle crucial du FAK dans le maintien des fonctions des CSM et fournissent la preuve que la dysrégulation du FAK dans les CSM contribue à la perturbation de l'hématopoïèse et éventuellement à la progression des tumeurs malignes myéloïdes. Une meilleure compréhension du rôle que joue le microenvironnement du SMD et de la LAM permettra de mieux reconnaître les patients à faible risque et de mettre au point des traitements ciblant les CSM défectueuses, améliorant ainsi le résultat clinique / FAK is a cytoplasmic tyrosine kinase that regulates diverse cellular processes, including survival, proliferation, differentiation, and motility. Though various studies have demonstrated the importance of FAK in MDS and AML pathogenesis, the role of this molecule in MDS and AML tumor microenvironment remained to be further determined. By examining BM MSCs derived from MDS and AML patients, we have observed a continues increase of FAK expression and activation during MDS progression to AML, similar to those detected in hemopoietic counterparts. In LR-MDS, MSCs were found to be characterized by low FAK expression and activation. They exhibited altered morphology, immunophenotype, differentiation, and expression of hematopoiesis-supporting factors. Of note, these features could be largely reproduced in normal MSCs by FAK inhibition. Furthermore, FAK depletion in BM stromal cell line could induce massive expansion and apoptosis of normal HSPCs. Our results highlight a critical role of FAK in maintaining the functions of BM MSCs and provide evidence that dysregulation of FAK in MSCs contribute to the disturbed hematopoiesis and possibly the progression of myeloid malignancies. A greater understanding of the role that BM microenvironment plays in MDS and AML will enable an increased recognition of poor-risk patients and the development of therapies that target the defected MSCs, thereby improving the clinical outcome