T-Zellrezeptor (TZR)-Gentherapie zeigte erste Erfolge in klinischen Studien, jedoch wurden gleichzeitig Risikofaktoren deutlich. Ein Risikofaktor ist das falsche Paaren der transferierten TZR-Ketten mit den endogenen, was zu TZR-Molekülen von unbekannter Spezifität führt und die Oberflächenexpression und somit auch die Funktionalität des transgenen TZR reduziert. Dieser Aspekt wurde in generierten T-Zellklonen mit einer konstitutiven/endogenen TZR-Expression sowie einer zweiten induzierbaren/transgenen TZR-Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nach Induktion der transgenen TZR-Expression der endogene TZR seine Funktionalität verlor, obwohl er noch auf der Oberfläche detektierbar war. Als Ursachen wurden neben einer reduzierten Oberflächenexpression des endogenen TZR auch falsch gepaarte TZR-Moleküle, die mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode detektiert wurden, gefunden. Die Modifikation des TZR durch den Einbau einer zweiten Cystein-Brücke, was das Paaren der korrespondierenden TZR-Ketten stabilisieren soll, führte in den T-Zellklonen zu keiner Reduktion der falsch-paarenden TZR-Moleküle. In primären Wildtyp-T-Zellen verbesserte sich das richtige Paaren des transgenen TZR leicht und konnte durch Codon-Optimierung der TZR-Gene weiter verbessert werden. Der zweite untersuchte Risikofaktor ist die Insertionsmutagenese durch den retroviralen Vektor. Die sichere Verwendbarkeit von differenzierten T-Zellen für die TZR-Gentherapie wurde in einem Tiermodel mit wiederholter T-Zellstimulierung, um weitere Mutationen während der Zellteilung zu provozieren, analysiert. Im Laufe der Zeit reicherten sich die transferierten T-Zellen in den Tieren dramatisch an, aber entwickelten sich nicht zu T-Zelllymphomen. Die Proliferationskapazität und die Funktionalität der transferierten T-Zellen wurden bestätigt. Die Polyklonalität der TZR-gen-modifizierten T-Zellen wurde mit Hilfe der linear-amplifizierten Polymerasekettenreaktion nachgewiesen. / T cell receptor (TCR) gene therapy is a new therapy for cancer which showed first clinical success but at the same time risk factors evolved. One risk factor is the mispairing of the TCR chains with the endogenous TCR chains which leads to TCRs with unknown specificities and to a reduced expression and functionality of the transferred TCR. This aspect was analyzed in dual TCR T cell clones which had one constitutive/endogenous TCR expression as well as a second inducible/transgenic TCR expression. It could be shown that the endogenous TCR lost its functionality after induction of the transgenic TCR expression although it was still detectable on the cell surface. The reason was found in the lower surface expression level of the endogenous TCR as well as in mispaired TCR dimers detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique. Modification of the TCR by insertion of a second cysteine bridge which should stabilize the pairing of the corresponding TCR chains did not reduce the TCR mispairing in the T cell clones. In primary wild-type cells, the pairing of the transgenic TCR improved slightly and could be further improved by codon-optimization of the TCR genes. The second analyzed possible side effect of TCR gene therapy is the insertional mutagenesis by the retroviral vector. The safety of differentiated T cells for TCR gene therapy was analyzed in an animal model with a repetitive T cell stimulation to provide the opportunity for mutations to occur during cell division. Over time, transferred T cells increased dramatically in the recipient mice, but did not lead to T cell lymphomas. The proliferative capacity and the functionality of transferred T cells were confirmed. The polyclonality of the TCR gene-modified T cells could be confirmed by linear amplification-mediated polymerase-chain reaction.

Durch den Transfer der Gene des heterodimeren T-Zellrezeptors (TZR) mithilfe viraler Vektoren können T-Zellen programmiert werden, ein ausgewähltes Antigen spezifisch zu erkennen. In klinischen Studien wurden solche T-Zellen bereits mit Erfolg zur Immuntherapie von Krebs und viralen Infektionen eingesetzt. Genmodifizierte T-Zellen unterscheiden sich jedoch von normalen T-Zellen, weil sie neben den beiden zelleigenen auch die zwei übertragenen TZR-Gene exprimieren. Diese Situation erlaubt die Bildung vier verschiedener TZR-Heterodimere: der zelleigene TZR, der übertragene TZR und zwei gemischte TZR, bestehend aus je einer übertragenen und einer zelleigenen TZR-Kette. Gemischte TZR bergen das Risiko von Nebenwirkungen, weil sie durch Zufall gesundes Körpergewebe erkennen und so Autoimmunität auslösen könnten. In dieser Arbeit wurden deshalb virale Vektoren entwickelt, die gleichzeitig mit der Übertragung von neuen TZR-Genen den zelleigenen TZR durch RNA Interferenz (RNAi) unterdrücken. Mikro-RNA (miRNA), die in den Vektor MP71 eingefügt wurden, reduzierten den zelleigenen TZR in Maus-T-Zellen um mehr als 85%. Dies hatte zur Folge, dass beide Ketten des übertragenen P14-TZR in gleicher Menge auf der Zelloberfläche exprimiert wurden und die Bildung von gemischten TZR reduziert wurde. In einem Mausmodell der adoptiven T-Zelltherapie verhinderte die Unterdrückung des zelleigenen TZR die Entstehung von Autoimmunität, die andernfalls durch gemischte TZR verursacht wurde. Im Gegensatz dazu führte die Anwendung von gentechnisch optimierten P14-TZR-Genen weder zur angeglichenen Oberflächenexpression der P14-TZR Ketten noch zu weniger Autoimmunität im Mausmodell. Ein anderes Tierexperiment zeigte, dass die miRNA die Funktion der genmodifizierten T-Zellen nicht beeinträchtigte. Schließlich wurde ein viraler Vektor entwickelt und getestet, der die Expression des zelleigenen TZR in menschlichen T-Zellen effektiv unterdrückte und die Bildung von gemischten TZR reduzieren konnte. / T cells can be genetically modified using viral vectors. The transfer of genes encoding both chains of the heterodimeric T cell receptor (TCR) programs T cells to specifically react towards an antigen of choice. Such TCR gene-modified T cells were already successfully applied in clinical studies to treat cancer and viral infections. However, in contrast to nonmanipulated T cells these cells express the transferred TCR in addition to the endogenous TCR and this situation allows the assembly of four different TCR heterodimers: the endogenous TCR, the transferred TCR, and two mixed TCR dimers, composed of one endogenous and one transferred TCR chain. The formation of mixed TCR dimers represents a safety issue because they may by chance recognize self-antigens and thereby cause autoimmune side effects. To overcome this problem, an RNAi-TCR replacement vector was developed that simultaneously silences the endogenous TCR and expresses an RNAi-resistant therapeutic TCR. The expression of miRNA encoded by a retroviral MP71 vector in transduced mouse T cells reduced the surface levels of the endogenous TCR by more than 85%. The knockdown of the endogenous TCR in turn resulted in equal surface expression levels of both transferred P14 TCR chains and prevented the formation of mixed TCR dimers. Accordingly, the development of lethal mixed TCR dimer-dependent autoimmunity (TI-GVHD) in a mouse model of adoptive T cell therapy was dramatically reduced by the knockdown of the endogenous TCR. In contrast, the usage of genetically optimized TCR genes neither resulted in equal surface levels of both P14 TCR chains nor in reduced autoimmunity. A second mouse model demonstrated that the in vivo functionality of the transduced T cells was not negatively influenced by the expression of the miRNA. Finally, an RNAi-TCR replacement vector for human T cells was developed that effectively reduced the expression of the endogenous TCR and prevented the formation of mixed TCR dimers.