Kutane CD8+ T-Zell-Lymphome beinhalten heterogene Subgruppen mit unterschiedlicher klinischer und histologischer Präsentation. Zytotoxische CD8+ T-Zell-Lymphome sind selten und daher nur ungenügend charakterisiert. Unser Ziel war es, zytotoxische Lymphominfiltrate, basierend auf histologischen, immunphänotypischen und klinischen Faktoren, besser charakterisieren sowie daraus mögliche diagnostische und prognostische Marker abzuleiten zu können. Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Biopsien von 44 Patienten mit kutanen zytotoxischen T-Zell-Lymphominfiltraten wurden aus den Archiven des Instituts für Pathologie und des dermatohistologischen Labors der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie des Universitätsklinikums Würzburg vom Zeitraum 1998 bis 2014 herausgesucht. Histologische, immunphänotypische and molekulargenetische Eigenschaften wurden analysiert und mit den klinischen Daten verglichen. Die identifizierten Fälle der kutanen CD8+ zytotoxischen Lymphominfiltrate (n=44) beinhalteten 1 Fall mit einem aggressiven epidermotropen CD8+ T-Zell-Lymphom (AETCL), 14 Fälle mit einer Mycosis fungoides (MF)/ einem Sézary-Syndrom (SS), 3 Fälle mit einer Lymphomatoiden Papulose (LyP), 5 Fälle mit einem akralen CD8+ T-Zell-Lymphom (akrales CD8+ TCL) and 4 Fälle mit einem subkutanen Panniculitis-artigem T-Zell-Lymphom (SPTCL). 9 Fälle wurden als primär kutanes peripheres T-Zell-Lymphom, nicht näher spezifiziert (cPTCL-NOS) und 4 Fälle als systemisches T-Zell-Lymphom (sPTCL-NOS) klassifiziert. Multiple Hautläsionen, die ein höheres Tumorstadium implizieren, ein hoher Proliferationsindex und die finale Subtyp-Zuteilung zu systemischen PTCL-NOS oder AETCL stellten negative prognostische Faktoren dar. Auf der anderen Seite indizierte ein geringer Proliferationsindex zusammen mit der Expression von CD68 einen indolenten klinischen Verlauf und charakterisierte den Subtyp des akralen CD8+ T-Zell-Lymphoms. Eine enge Korrelation der klinischen Charakteristika mit der Histologie und dem Immunphänotyp ist zur endgültigen Diagnosestellung unbedingt notwendig. / Cutaneous CD8+ lymphoma infiltrates comprise heterogeneous subgroups with diverse clinical and histological presentation. Cytotoxic CD8+ T-cell lymphomas are only rarely encountered and, thus, remain only poorly characterized. Our aim was to obtain proper subtype assignment of CD8+ skin lymphoma infiltrates and to derive putative prognostic markers thereof. Formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue of 44 patients with CD8+ cytotoxic cutaneous T-cell lymphoma infiltrates was retrieved from the archives of the Institute of Pathology and the Department of Dermatology, University Hospital Wuerzburg, dating back from 1998 until 2014. Cytological, histological, immunohistochemical and molecular genetic features were assessed and correlated with respective clinical data. The identified cases of CD8+ cytotoxic atypical lymphoproliferative infiltrates of the skin (n=44) comprised 1 case of aggressive epidermotropic primary cutaneous T-cell lymphoma (AETCL), 14 cases of mycosis fungoides (MF)/Sézary-syndrome (SS), 3 cases of lymphomatoid papulosis (LyP), 5 cases of acral CD8+ T-cell lymphoma (acral CD8+ TCL) and 4 cases of subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma (SPTCL). Moreover, 9 cases were classified as primary cutaneous peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS) and 4 cases as systemic PTCL-NOS. Multiple skin lesions, a high proliferative index and especially a final subtype attribution to AETCL or systemic PTCL-NOS were associated with a worse survival. Coexpression of CD68 by tumour cells was exclusively observed in acral CD8+ T-cell Lymphoma and, thus, indicated an invariably benign clinical course. A thorough clinicopathological correlation with respective staging examinations remains the mainstay for correct subtype assignment and proper prognostication.

Glukokortikoide (GCs) gehören zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorgänge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zusätzlich antientzündliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) trägt zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivität des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. Sämtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgeführt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, während andere vollständig resistent gegenüber GCs erschienen. In weiterführenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. Für diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erwünschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde über RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens führt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erhöhte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines grün fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine Änderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgeführt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten Überlebensvorteile für Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungeklärt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tatsächlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tatsächlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher nötig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen. / Glucocorticoids (GCs) belong to the family of the steroid hormones. Under physiological conditions GCs have an important function as stress hormones in the activation of catabolic metabolism processes. In high, therapeutic concentrations anti-inflammatory and immunsuppressive effects play, in addition, an important role., Among the rest, this modulation of the immune system happens by induction of the programmed cell death (apoptosis) in T-lymphocytes. The investigation of the mechanisms of this glucocorticoid-induced cell death (GICD) contributes to a better understanding of the impact of glucocorticoids within the immune system. Timothy J. Cole et. al. could prove that the activity of the glucocorticoid-receptor-promotor 1A (GR-1A) appealing in T-lymphocytes correlates on GICD. The aim of this work is to examine the connection by GR-1A-promotor-expression and GICD in detail. All cell experiments were carried out in WEHI 7.1 cells, a murine, immature T-cell-lymphoma. In the first investigations of the WEHI 7.1-cells appeared that only certain cell clones went to glucocorticoid-induced apoptosis while others were completely resistant towards GCs. In continuing experiments exclusively the GICD-sensitive cells were used. For this celltype the available being of the GR-1A-Transkripts, as well as clear appealing to GICD has been proved. In the following experiments 7.1-5A WEHI cells were compared to 7.1-5A WEHI cells of suppressed GR-1A equipment. The desired reduction of the GR-1A-transkricts was achieved about RNA interference (RNAi) by means of small interfering RNA (siRNA). RNAi is a technology which causes selectively the dismantling of mRNA by small siRNA chains and thereby leads to a reduction of the protein biology synthesis of a certain gene. The connection of GR-1A and glucocorticoid apoptosis should be examined in WEHI 7.1-cells with a diminished GR-1A expression. The cells which show a raised resistance against glucocorticoidinduced apoptosis should be generated by the infiltration of siRNA weight-bearing lentiviraler vectors against the GR-1A-transcript. Those cells which had integrated siRNA information into the genome could be isolated by detection of a green fluorescing marker gene (eGFP). Afterwards the cells were analysed on a change of the GR protein amount. No significant differences in western blot analyses to the quantification of the GR in the expression of the GR protein in the successfully GR-1A-deficient WEHI 7.1-cells in comparison to the negative control were found. Dexamethason-dose-response-assays were carried out to grasp the portion of GICD in the transfected cells. After treatment with the highly potent glucocorticoid dexamethason no significant survival advantages arose for the cells which own a lack of GR-1A-transcript on the basis of RNAi. The studies carried out in this work could not prove the postulated connection between GR-1A expression and GICD. It remains unsettled whether it has come to a significant decrease of the GR-1A after the successful transfection of the WEHI 7.1-cells, or whether a really correct synthesis from siRNA has taken place in the cells. Hence, other investigations seem necessary to understand the role of the promotor 1A better.

Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells is an effective treatment for hematological malignancies that are refractory to conventional chemotherapy. To address a wider variety of cancer entities, there is a need to identify and characterize additional target antigens for CAR-T cell therapy. The two members of the receptor tyrosine kinase-like orphan receptor family, ROR1 and ROR2, have been found to be overexpressed on cancer cells and to correlate with aggressive cancer phenotypes. Recently, ROR1-specific CAR-T cells have entered testing in phase I clinical trials, encouraging us to assess the suitability of ROR2 as a novel target for CAR-T cell therapy. To study the therapeutic potential of targeting ROR2 in solid and hematological malignancies, we selected two representative cancer entities with high unmet medical need: renal cell carcinoma and multiple myeloma. Our data show that ROR2 is commonly expressed on primary samples and cell lines of clear cell renal cell carcinoma and multiple myeloma. To study the efficacy of ROR2-specific CAR T cell therapy, we designed two CAR constructs with 10-fold binding affinity differences for the same epitope of ROR2. We found both cell products to exhibit antigen-specific anti-tumor reactivity in vitro, including tumor cell lysis, secretion of the effector cytokines interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFNγ), and T cell proliferation. In vivo studies revealed ROR2 specific CAR-T cells to confer durable responses, significant survival benefits and long-term persistence of CAR-expressing T cells. Overall, there was a trend towards more potent anti-tumor efficacy upon treatment with T cells that expressed the CAR with higher affinity for ROR2, both in vitro and in vivo. We performed a preclinical safety and toxicology assessment comprising analyses of ROR2 expression in healthy human and murine tissues, cross-reactivity, and adoptive T cell transfer in immunodeficient mice. We found ROR2 expression to be conserved in mice, and low-level expression was detectable in the male and female reproductive system as well as parts of the gastrointestinal tract. CAR-T cells targeting human ROR2 were found to elicit similarly potent reactivity upon recognition of murine ROR2. In vivo analyses showed transient tissue-specific enrichment and activation of ROR2-specific CAR-T cells in organs with high blood circulation, such as lung, liver, or spleen, without evidence for clinical toxicity or tissue damage as determined by histological analyses. Furthermore, we humanized the CAR binding domain of ROR2-specific CAR-T cells to mitigate the risk of adverse immune reactions and concomitant CAR-T cell rejection. Functional analyses confirmed that humanized CARs retained their specificity and functionality against ROR2-positive tumor cells in vitro. In summary, we show that ROR2 is a prevalent target in RCC and MM, which can be addressed effectively with ROR2-specific CAR-T cells in preclinical models. Our preliminary toxicity studies suggest a favorable safety profile for ROR2-specific CAR-T cells. These findings support the potential to develop ROR2-specific CAR-T cells clinically to obtain cell products with broad utility. / Adoptive Immuntherapie mit T-Zellen, die chimäre Antigenrezeptoren (CAR) exprimieren, ist ein effektiver Behandlungsansatz für Chemotherapie-resistente Blutkrebserkrankungen. Die Übertragung dieses Konzepts auf weitere Krebsarten erfordert die Identifikation und Charakterisierung neuer Zielstrukturen für die CAR-T Zelltherapie. ROR1 und ROR2, die beiden Mitglieder der Familie der Rezeptortyrosinkinase-ähnlichen Orphan-Rezeptoren, werden auf einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert und korrelieren mit einer schlechten Prognose und höherer Krebs-Invasivität. Kürzlich konnte ROR1 als Zielstruktur für die CAR-T Zelltherapie bestätigt werden und die Effektivität und Sicherheit ROR1 spezifischer CAR-T Zellen wird derzeit im Rahmen klinischer Phase-I Studien näher untersucht. Aus diesem Grund waren wir daran interessiert, das therapeutische Potenzial ROR2-spezifischer Zelltherapie zu untersuchen. Als Modellsysteme hierfür wählten wir das Nierenzellkarzinom und das Multiple Myelom als repräsentative hämatologische und solide Krebserkrankungen mit hohem medizinischem Bedarf aus. Unsere Daten zeigen, dass ROR2 häufig auf Zelllinien und primären Tumorproben des klarzelligen Nierenzellkarzinoms und des Multiplen Myeloms vorkommt. Um die Effektivität ROR2-spezifischer CAR-T Zellen zu untersuchen, wurden zwei CAR Konstrukte mit zehnfach unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für dasselbe Epitop von ROR2 hergestellt. Beide Zellprodukte zeigten hohe, antigen-spezifische Antitumor-Reaktivität in vitro – insbesondere im Hinblick auf Tumorzell-Lyse, Sekretion der Zytokine Interleukin-2 (IL-2) und Interferon gamma (IFNγ) und T-Zell Proliferation. In vivo beobachteten wir langanhaltende Antitumor-Effektivität durch ROR2-spezifische CAR-T Zellen, sowie signifikante Überlebensvorteile und langfristige T-Zell Persistenz. Außerdem beobachteten wir, sowohl in vitro als auch in vivo, einen Trend zu stärkerer Antitumor-Effektivität von T-Zellen, die den CAR mit höherer Affinität für ROR2 exprimierten. Im Rahmen einer präklinischen Toxikologie-Studie analysierten wir die Expression von ROR2 im gesunden Gewebe, die Kreuz-Reaktivität ROR2-spezifischer CAR-T Zellen und deren Sicherheit durch adoptiven T-Zell Transfer in immun-defiziente Mäuse. Unsere Daten zeigen, dass ROR2 in H. sapiens und M. musculus gleichermaßen exprimiert wird und ROR2 Expression war insbesondere in den weiblichen und männlichen Reproduktionsorganen und Teilen des Gastrointestinaltrakts detektierbar. Wir konnten außerdem zeigen, dass CAR-T Zellen, die menschliches ROR2 erkennen, vergleichbare Antitumor-Reaktivität gegen Zellen, die murines ROR2 exprimieren, auslösen. Unsere in vivo Analysen zeigten temporäre Anreicherung und Aktivierung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen in gut durchbluteten Geweben, wie Lunge, Leber und Milz, in der Abwesenheit klinischer Anzeichen für Toxizität oder histologisch nachweisbarer Gewebsschädigungen. Um die Risiken immunologischer Nebenwirkungen und die damit einhergehende Abstoßung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen zu reduzieren, humanisierten wir die CAR Bindedomäne. Unsere Daten zeigen, dass humanisierte ROR2-spezifische CAR-T Zellen vergleichbare Spezifität und Funktionalität gegen ROR2-positive Tumorzellen in vitro aufweisen. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass ROR2 eine häufig auftretende Zielstruktur auf der Oberfläche von RCC und MM Zellen ist und diese in präklinischen Modellen effektiv mittels ROR2-spezifischer CAR-T Zellen adressiert werden kann. Unsere vorläufigen Toxizitätsdaten deuten darauf hin, dass ROR2-spezifische CAR-T Zellen ein vorteilhaftes Sicherheitsprofil aufweisen. Alles in allem unterstützen diese Daten das Potenzial der klinischen Entwicklung ROR2-spezifischer CAR-T Zellen als Zellprodukte mit breit gefächerter Anwendbarkeit.

Ziel der in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Untersuchungen war eine nähere Charakterisierung von peripheren T-Zell-Lymphomen (PTCL). Hierfür wurden im Wesentlichen zwei Ansätze verfolgt: Im ersten Ansatz sollten für die Tumorzellen der verschiedenen PTCL korrespondierende Normalzellen identifiziert werden, um deren Eigenschaften und Funktionen mit denen der neoplastischen Zellen vergleichen zu können. Im zweiten Ansatz sollten die hierdurch gewonnenen Erkenntnisse in weiterführende Untersuchungen umgesetzt werden, um Hinweise auf die Mechanismen der Tumorzelltransformation in den verschiedenen PTCL zu erhalten. Zur Bearbeitung des ersten Ansatzes wurde eine PCR-basierte Methode entwickelt, mit der sich das in den Tumorzellen klonal rearrangierte T-Zell-Rezeptor (TCR)Vbeta-Segment bestimmen lässt, um anschließend den Phänotyp der Tumorzellen unter Zuhilfenahme eines gegen dieses Segment gerichteten Antikörpers in immunhistochemischen Mehrfachfärbungen zu definieren. Es konnte gezeigt werden, dass sich angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome (AILT) und großzellig anaplastische Lymphome (ALCL) jeweils einer T-Effektorzell-Population und eine Untergruppe der peripheren T-Zell-Lymphome, nicht weiter spezifiziert (PTCL-NOS) einer T-Gedächtniszell-Population zuordnen lassen. Ausgehend vom Phänotyp bereits bekannter T-Zell-Subpopulationen wurde darüber hinaus versucht, aus der heterogenen Gruppe der PTCL-NOS weitere Untergruppen einem bestimmten T-Zell-Entwicklungsstadium zuzuordnen. Die diesbezüglichen Ergebnisse legen nahe, dass es eine seltene Gruppe von PTCL gibt, die sich von regulatorischen T-Zellen ableitet, und sich durch einen sehr aggressiven Krankheitsverlauf auszeichnet. Diese Erkenntnis könnte in Zukunft Auswirkungen auf das therapeutische Vorgehen, beispielsweise in Form einer individuell abgestimmten, aggressiveren Therapie, haben. Als wegweisender Nebenbefund der durchgeführten PCR-basierten immun-histochemischen Untersuchungen sind die Ergebnisse der Analysen von ALCL anzusehen. Bei diesen Tumoren konnte gezeigt werden, dass die fehlende Expression von TCR sowie TCR-assoziierten Molekülen trotz des Vorhandenseins klonal rearrangierter TCR ein wesentliches Merkmal dieser Entität darstellt. Diese Erkenntnis stellt eine neue vereinigende Eigenschaft von ALK- (anaplastic lymphoma kinase) und ALK+ ALCL dar, die insbesondere auch zur Abgrenzung gegenüber anderen CD30+ PTCL in der Diagnostik herangezogen werden kann. Inwiefern das Fehlen der über den TCR vermittelten Signale, die normalerweise über den JAK/STAT Weg die Proliferation hemmen und letztlich zu Wachstumsstopp und Apoptose führen, auch zur Tumorzelltransformation beiträgt, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden. TCR-knock-out/down Experimente bzw. die Reexpression eines TCR in entsprechenden ALCL-Zelllinien könnten diese Aspekte weiter beleuchten. Ein weiterer interessanter Aspekt sind die Parallelen zu dem morphologisch ähnlichen Hodgkin-Lymphom, das sich von B-Zellen ableitet, jedoch ebenfalls keinen B-Zellrezeptor (BCR) exprimiert. Das abberante TCR/BCR-Signaling könnte zu der ungewöhnlichen, anaplastischen Morphologie der neoplastischen Zellen in beiden Lymphomen beitragen, da auch Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts durch diese Signalkaskaden vermittelt werden. Hier könnten insbesondere vergleichende Untersuchungen zu einem besseren Verständnis dieser Tumoren beitragen. Der Befund, dass die Tumorzellen des AILT einen Effektorzellphänotyp aufweisen, hat uns dazu veranlasst, nach Ursachen zu suchen, die in den Tumorzellen die bei diesem Zelltyp zu erwartende Apoptose verhindern. SNP-Analysen und immunhistochemische Untersuchungen der Apoptose-assoziierten CTLA-4- und FAS-Gene bzw. deren Expression haben jedoch keine Hinweise auf einen hier gelegenen Apoptosedefekt ergeben. Es sind somit weiterführende Untersuchungen der FAS- und CTLA-4-Signalwege sowie anderer Apoptose-assoziierter Moleküle nötig, um der nach wie vor naheliegenden Hypothese eines Apoptosedefekts als pathogenetisch relevanten Faktor in AILT nachzugehen. Aus den in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Untersuchungen haben sich zahlreiche neue Aspekte ergeben, die Ausgangspunkt für ein besseres Verständnis der Biologie dieser Erkrankungen sein können. Nicht zuletzt könnten diese Ergebnisse dazu beitragen eine Klassifikation der T-Zell-Lymphome zu erstellen, die sich analog zu der Klassifikation der B-Zell-Lymphome an der korrespondierenden Normalzelle orientiert und letztlich die Diagnostik und Therapie und damit die Prognose dieser Tumoren verbessert. / The aim of our study was a more specific molecular characterisation of peripheral T-cell lymphomas (PTCL). Towards this goal, we primarily chose two approaches: The first approach was to identify the normal counterparts of the neoplastic T-cells in different subtypes of PTCL in order to compare the features and functions of normal and neoplastic T-cells. The second approach dealt with potential mechanisms of tumor cell transformation that may occur in these non-neoplastic counterparts of PTCL during tumorigenesis. In the first approach, we developed a PCR-based method which allows the identification of the clonally rearranged T-cell receptor (TCR)V segment of the neoplastic T-cells. Subsequent phenotyping of the tumor cells was done with an antibody against this segment performing immunohistochemical double- and triple stains. Angioimmunoblastic T-cell lymphomas (AILT) and anaplastic large cell lymphomas (ALCL) could both be related to effector cells, whereas a subgroup of PTCL not otherwise specified (PTCL-NOS) showed a corresponding memory cell population. Furthermore, based on defined T-cell populations, attempts to assign further subgroups within the heterogeneous group of PTCL-NOS provided evidence of rare cases derived from regulatory T-cells with an aggressive clinical course. In the future, this finding may have implications for the therapeutic management leading to a more individualized therapy. We gained additional insights from our PCR-based immunohistochemical investigations which may be of major importance for the pathogenesis of ALCL. Specifically, we could demonstrate that the lack of TCR expression and of TCR-associated molecules is an essential feature of this entity, despite the existence of clonally rearranged TCR genes. This perception presents a new unifying feature of anaplastic lymphoma kinase (ALK)- and ALK+ ALCL, which is particularly useful in discriminating ALCL from other CD30+ PTCL in the diagnostic setting. Further investigations are needed to clarify to what extent the lack of TCR mediated signals, which normally inhibit proliferation by the JAK/STAT pathway leading to growth arrest and apoptosis, also contributes to tumor cell transformation. TCR-knock-down experiments in normal T-cells and TCR re-expression in corresponding ALCL cell lines might shed additional light on these aspects. The parallels to the morphologically similar Hodgkin lymphoma which is derived from B-cells, are another interesting aspect, since these tumors do not express a B-cell receptor (BCR). The aberrant TCR/BCR signaling could contribute to the abnormal anaplastic morphology of the neoplastic cells in both lymphoma entities, since changes of the cytoskeleton are induced by the TCR/BCR signal cascades as well. Thus, comparative analyses could contribute to a better understanding of these tumors. The finding of AILT tumor cells showing an effector cell phenotype led us to search for reasons why apoptosis is inhibited in the tumor cells, whereas in normal T-cells of this differentiation state apoptosis generally occurs. Both analyses of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and immunohistochemical studies of the apoptosis-associated CTLA-4 and FAS genes, however, did not provide any evidence of a defective apoptotic pathway based on these SNPs. Therefore, further investigations of the FAS and CTLA-4 pathways as well as other apoptosis-associated molecules are needed to identify factors that result in defective apoptosis of AILT cells. Our work may help to provide a better understanding of the biology of PTCL and could contribute to the development of an improved classification of T-cell lymphomas, which is based on corresponding normal T-cell counterparts, analogous to the classification of B-cell lymphomas. An improved molecular characterization of PTCL is a prerequisite for the development of novel therapeutic approaches.

Hintergrund: Die HIV-Infektion wird von einer allgemeinen Hyperimmunaktivierung begleitet, die wahrscheinlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Im Rahmen einer 24-monatigen, Placebo-kontrollierten, randomisierten Doppelblindstudie wurde in unserer Arbeitsgruppe der Einfluss von gering-dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) auf die Progression der Erkrankung untersucht (ProCort-Studie, clinicaltrials.gov NCT01299948). Es konnte gezeigt werden, dass gering-dosiertes Prednisolon bei weiblichen Studienteilnehmerinnen zu einer signifikant verlangsamten Progression hin zum Studienendpunkt AIDS geführt hat. Die immunologischen Grundlagen dieses Effektes sind noch nicht ausreichend verstanden. Es ist bekannt, dass die HIV-Infektion zu einer Zunahme der aktivierten T-Zellen im Blut führt und dass der Anteil dieser aktivierten T-Zellen mit der Krankheitsprogression korreliert. Diese T-Zell Hyperaktivierung wird unter antiretroviraler Behandlung wieder normalisiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Prednisolon-Behandlung auf die T-Zell-Aktivierung untersucht werden, um zu verstehen, ob die Prenisolon-Behandlung ähnliche positive Effekte auf das Immunsystem hat, wie die antiretrovirale Therapie. Methoden: In dieser Studie wurden insgesamt 154 PBMC-Proben (77 Placebo, 77 Prednisolon) des Studienzeitpunktes 12 Monate untersucht. Die PBMC wurden mit Fluorochrom-markierten Antikörpern gegen CD3 (PerCP-Cy 5.5), CD8 (FITC), CD38 (PE) und HLA-DR (APC) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Folgende Populationen wurden definiert: T-Zellen (CD3+), CD8-positive T Zellen (CD3+/CD8+), CD4-positive T Zellen (CD3+/CD8-), aktivierte T Zellen (CD38+/HLA-DR+). Eine statistische Analyse der Daten erfolgte mit Hilfe der GraphPad Prism Software. Ergebnisse: Patienten mit Prednisolon-Behandlung zeigten im Vergleich zu Patienten mit Placebo-Behandlung eine geringere Aktivierung der CD8+ T Zellen (median 8.04 % [CI95% 8.158-11.54]) vs. median 9.74 % [CI95% 9.71-13.05] sowie der CD4+ T Zellen (median 6.910% [CI95% 6.862-8.721] vs. median 8.185 % [CI95% 8.088-10.49]). Die Unterschiede sind jedoch statistisch nicht signifikant (p=0.1250 bzw. p=0.1032, U test). Bei einer Stratifizierung der Daten nach Geschlecht erreichten die festgestellten Unterschiede zwischen Placebo- und Prednisolonbehandlung bei weiblichen Studienteilnehmern statistische Signifikanz (CD8+ Aktivierung: median 7.3 % [CI95% 7.413-10.26] vs. median 10.3 % [CI95% 9.927-13.69], p = 0.0248, U-test), sowie der CD4+ T Zellen (median 6.735% [CI95% 6.448-8.476] vs. (median 8.36% [CI95% 8.274-10.72], p = 0.0158, U-test), während bei männlichen Studienteilnehmern kein Unterschied auftrat. Die Lymphozytenaktivierung zeigte eine positive Korrelation zur HIV-Viruslast (p = 0.0521 für CD8+ und p = 0.0078 für CD4+, lineare Regression) und zum Immunaktivierungsmarker sCD14 (p = 0.0075 für CD8+ und p < 0.0085 für CD4+, lineare Regression) und zum Aktivierungsmarker supar (p = 0.0261 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). Aktivierte CD4+ Zellen zeigten eine positive, aktivierte CD8+ Zellen eine negative Korrelation zum Anteil an memory-B-Zellen (p = 0.0080 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). In einer Kaplan-Meyer-Analyse innerhalb des Placebo-Arms zeigten Patienten mit einer höherne Immunaktivierung bei CD8+ T-Lymphozyten (Quartilen Q1 und Q2) eine signifikant schnellere Progression zu AIDS als Patienten mit einer niedrigen Immunaktivierung (Quartilen Q3 und G4, p = 0.0176). Diskussion: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen mit Prednisolon-Behandlung zum Zeitpunkt 12 Monate eine signifikant niedrigere Lymphozytenaktivierung zeigen als Studienteilnehmerinnen mit Placebo-Behandlung. Die Prednisolon-vermittelte Reduktion der Immunaktivierung korrelierte mit verlangsamter Krankheitsprogression. Die HIV-induzierte Immunaktivierung ist damit ein treibender Faktor in der Progression der Erkrankung. Immunmodulatorische Therapien bei Patienten mit ungenügender Immunrekonstitution unter antiretroviraler Behandlung könnten daher möglicherweise einen positiven Behandlungseffekt erzielen. Zielsetzung dieser Arbeit ist die Bestimmung der Aktivierung von CD8+ und CD4+ T-Lymphozyten bei Teilnehmern eines RCT, in dem der Effekt von niedrig-dosiertem Prednisolon auf die Progression der HIV-Infektion untersucht werden sollte. Die Ergebnisse sollten mit der Art der Behandlung (Placebo oder Prednisolon), weiteren Markern der Immunaktivierung sowie der Viruslast korreliert werden und der Effekt auf die Krankheitsprogression untersucht werden. Aus diesen Ergebnissen sollten Rückschlüsse auf die Effekte von Prednisolon auf das Immunsystem, sowie ein besseres Verständnis der Immunpathogenese der Infektion gewonnen werden. / HIV-infection comes along with chronic immune activation, which is most likely a driving force in the progression to AIDS. During a 24-month, placebo-controlled, randomized, double-blind study called the Pro-Cort trial, our work group investigated the impact of low dose prednisolone (5mg/day) on the progression of the HIV-infection. In this dissertation t-cell-activation was analyzed by the positive expression of CD3/ CD8 and CD38/HLADR markers. It showed a positive correlation to the viral load in HIV-infection. The t-cell-activation correlates also positive with known biomarkers of immune activation as sCD14 and supar. In a correlation to memory B-cells, activated CD4-t-cells correlated positively to memory B-cells, while activated CD8-t-cells correlated negatively to them. In a Kaplan-meyer-analysis in the placebo arm patients with high immune activation of CD8 positive t-cells showed a significant faster progression to AIDS than patients with a low immune activation of CD8 positive t-cells. Furthermore especially in female participants the treatment with prednisolone leaded to a significant lower immune activation. In summary positive immune modulating effects of prednisolone therapy were seen on HIV-infected individuals.

In der vorliegenden Arbeit wurde der zelluläre Immunstatus von 17 Patienten mit Erstdiagnose eines soliden gastrointestinalen Tumors vor und nach intravenöser Applikation von drei Zyklen einer konventionellen Polychemotherapie untersucht. Verglichen wurde zu Beginn der Therapie mit einer Kontrollgruppe, bestehend aus 21 nicht onkologisch vorerkrankten Probanden. Zur Messung der individuellen T-Zellvermittelten Immunantwort auf Einzelzellebene wird auf die Methode des IFN-γ-ELISPOT-Assays zurückgegriffen. Die zentrale Frage war, ob die Applikation einer Polychemotherapie einen messbaren Effekt auf die Immunantwort des einzelnen Individuums hat. Zudem sollte untersucht werden, ob generelle Unterschiede zwischen Patienten mit einer unbehandelten Tumorerkrankung und gesunden Probanden bzw. allgemein internistisch erkrankten Patienten zu erkennen sind. In Zusammenschau der Ergebnisse sind trotz überwiegend unveränderter T-Zell-Antwort auf die meisten der eingesetzten Antigene einige statistisch signifikante Unterschiede festzuhalten. So zeigte die Gruppe der Tumorpatienten vor Applikation der Chemotherapie im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant erhöhte Spotintensität und einen höheren Stimulationsindex [A] in Bezug auf das Tuberkulose-Antigen CFP-10. Diese Veränderungen waren nach Applikation der Chemotherapie nicht mehr nachzuweisen. Des Weiteren ergaben sich bei den Tumorpatienten vor und nach Chemotherapie signifikante Veränderungen der T-Zell-Antwort bezüglich des Antigens Tetanus-Toxoid. Nach Applikation von 3 Zyklen Chemotherapie kam es zu einer Verminderung des Stimulationsindex [A]. Es wird daher die Vermutung nahe gelegt, dass sich gerade in Bezug auf bakterielle Infektionen die T-Zell-Antwort der Tumorpatienten signifikant ändert. Die klinische Relevanz müsste jedoch anhand gezielter Messung auf spezifische bakterielle Antigene in größer angelegten Studien überprüft werden.

Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist. / Apoptosis and senescence are two distinct mechanisms that are induced by oncogenes to limit their oncogenic potential during tumorigenesis. Their appearance seems to be dependent on the specific oncogene. For a long time it is known that the oncogene Myc is a strong inducer of apoptosis. Latest results revealed, that Myc is also able to induce senescence, to prevent transformed cells from proliferating. Within the framework of my PhD I concentrated on both tumor suppressive mechanisms in two independent particular projects. Increased expression and activity of Myc enhances cell proliferation and thereby induces DNA double strand breaks. This damage activates a DNA damage response which leads to Atm/Atr mediated phosphorylation of H2A.X. A further target of the kinases Atm and Atr is HectH9 which ubiquitinates the mitochondrial protein Mcl1 in a DNA damage dependent manner. The ubiquitination of Mcl1 labels this protein for proteasomal degradation. In unstressed cells Mcl1 is located in the mitochondrial membrane where it interacts with proapoptotic members of the Bcl2 family inhibiting their activity. The reduction of Mcl1 protein is essential for the activation of proapoptotic proteins at the mitochondrium allowing release of cytochrome c as initial step in apoptosis. Myc mediated tumorigenesis is limited by using a mutant form of Myc as driving oncogene. This mutation inhibits interaction of Myc to its binding partner Miz1. The interaction of Myc and Miz1 is required to repress target genes like p21Cip1 and p15Ink4b. In vivo experiments demonstrate that Myc and Miz1 need to bind to each other to bypass TGFbeta-dependent senescence. This process is dependent on elevated levels of Myc consequently reduction to physiological levels of the protein induces apoptosis and senescence in a TGFbetadependent mannerIn addition, there is evidence that Myc is directly involved in the repression of Tgfbeta. In contrast to established models of repression by the Myc/Miz1 complex, it was shown, that Myc is recruited to and binds target DNA independently of Miz1. Therefore, I suggest that interaction of both proteins is essential only at the step of transcriptional initiation.

Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus primär humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chimärischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chimärischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und beträgt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der Überprüfung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegenüber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chimärischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstständig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantität als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen über einen chimärischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung über den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die über den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die über den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker für T Zellen. Die T Zellen, die durch die chimärischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollständige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellulären Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Phänomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen bestätigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen führt zu einer höheren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung über den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht für eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalität der T Zelle nach sich ziehen würde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird bestätigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalität dieser T Zellen zu schließen. / Activation dependent phosphorylation of MAP kinases in t cells. These t cells were activated through a chimeric antigen recepptor system of the first and second generation. In CMV specific t cells are no differences in the strength of phosphorylation between first and second generation receptors.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein Vektorsystem zu entwickeln, dass den simultanen Transfer verschiedener Transgene in CD8+ und CD4+ T-Zellen und dadurch die Herstellung eines immunotherapeutischen T-Zell-Produkts ermöglicht, welches aus zwei unterschiedlich modifizierten T-Zell-Subtypen besteht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Targeting-Technologie von lentiviralen auf γ-retrovirale Vektoren übertragen. Anschließend wird die Herstellung von Vektoren beschrieben, die spezifisch für murines CD4 oder CD8 sind. Deren Spezifität wurde zum einen durch die exklusive Expression von GFP in CD4+ oder CD8+ Zellen und zum anderen durch den Dosis-abhängigen Verlust des GFP-Signals nach Inkubation dieser Zellen mit CD4- und CD8-blockierenden Antikörpern nachgewiesen. Im dritten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass MVm8 und MVm4 primäre T-Zellen spezifisch transduzieren. MVm8-vermittelter Transfer des Ovalbumin (OVA)-reaktiven TZRs OT-I führte zu T-Zellen, die OVA+ Tumor-Zelllinien erkannten und Interferon-γ sezernierten. Der vierte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der in vivo Transduktion primärer T-Zellen mithilfe von MVm8, welches den OT-I-TZR und eine Luciferase transferiert (MVm8/OT-I-luc). Durch systemische Applikation von MVm8/OT-I-luc wurden T-Zellen in vivo transduziert. Durch Immunisierungen konnten antigen-spezifisches Homing, Expansion und eine anschließende Kontraktion in vivo transduzierter T-Zellen gezeigt werden. Mäuse mit starker OT-I-luc-Expression waren gegenüber einer Infektion durch OVA-transgene listeria monocytogenes geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Vektorsystem in der Lage ist zwischen Subtypen von T-Zellen zu unterscheiden und sie simultan mit unterschiedlichen Transgenen auszustatten. Für MVm8 konnte gezeigt werden, dass es T-Zellen direkt in vivo transduzieren kann. / The aim of this thesis was to generate a vector system that allows the simultaneous transfer of different transgenes into CD8+ and CD4+ T cells, allowing the generation of a immunotherapeutic T cell product comprised of two differently engineered T cell subsets. The first part of the thesis describes the transfer of the measles virus (MV) envelope-based targeting technology from lentiviral (LV) to γ-retroviral (gRV) vectors. The second part reports the generation of two targeting vectors specific for murine CD4 or CD8. The exclusive specificity of MVm4 and MVm8 was proven by expression of GFP in CD4+ and CD8+ reporter cells, respectively, but not in CD4-CD8- cells after transduction, and by a dose-dependent loss of GFP signal after incubation of reporter cells with CD4 or CD8 blocking antibodies before transduction. The third part shows that MVm8 but not MVm4 transduced primary T cells. MVm8-mediated transfer of the ovalbumin (OVA)-reactive TCR OT-I resulted in T cells secreting interferon-γ (IFNγ) upon recognition of OVA+ tumor cell lines. The final part of this thesis describes the in vivo transduction of primary T cells using MVm8 transferring OT-I and a luciferase (MVm8/OT-I-luc). To this end, B6 mice deficient for Rag2 have been repopulated with either polyclonal (B6) or monoclonal T cells derived from P14-TCR transgenic mice (P14). One day later the transferred T cells were transduced in vivo by systemic application of MVm8/OT-I-luc. Upon immunization in vivo-transduced T cells homed, expanded and contracted repeatedly in an antigen-dependent manner. Finally, mice exhibiting strong luc-signals showed improved protection against infections by OVA-transgenic listeria monocytogenes (LM-OVA). In conclusion, the viral vector system developed within this thesis is able to discriminate between the two main T cell subsets and to equip them with distinct transgenes simultaneously.

HINTERGRUND: Die Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) ist immer noch eine häufige Ursache für Morbidität und Mortalität unter immunsupprimierten Patienten. Eine effiziente T-Zell-Antwort vermag die unkontrollierte Ausbreitung des Virus zu verhindern. Vieles über diese T-Zell-Antwort ist aber noch unklar. Im Rahmen dieser Studie wurden daher bei HCMV-seropositiven herz- (n = 17) und lungentransplantierten (n = 3) Patienten Epitope in zwei wichtigen T-Zell-Zielen, den HCMV-Proteinen IE-1 (UL123) und pp65 (UL83), identifiziert, die Frequenzen der für diese Epitope spezifischen T-Zellen gemessen und die Klonalität ausgewählter starker CD8+ T-Zell-Antworten untersucht. METHODEN: Dazu wurden Pentadecapeptide, die die gesamte Aminosäure-Sequenz von IE-1 bzw. pp65 umfassten und sich um jeweils 11 Aminosäurereste überlappten, in Pools von 25 bis 30 Peptiden so zusammengefasst, dass jedes Peptid in einer einzigartigen Kombination von drei Pools enthalten war. PBMC der Patienten wurden dann mit den Peptid-Pools stimuliert und die resultierenden T-Zell-Reaktionen durch Färbung von intrazellulär zurückgehaltenem Interferon-gamma durchflusszytometrisch sichtbar gemacht. Immunogene Peptide konnten anhand der jeweiligen drei Pools, die zu IFN-gamma-Produktion führten, eindeutig identifiziert werden. Einige dieser T-Zell-Populationen wurden durch einen IFN-gamma-Sekretions-Assay, magnetische Zellseparation und durchflusszytometrische Feinsortierung aus PBMC isoliert und ihre Klonalität mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis klonal expandierter gamma-T-Zell-Rezeptor-Rearrangements (TCR-PCR) und anschliessender Fragmentanalyse fluoreszenzmarkierter PCR-Amplifikate untersucht. ERGEBNISSE: Bei den Patienten bestanden grosse Unterschiede hinsichtlich des jeweils immundominanten Proteins, der Dominanz von CD4+ bzw. CD8+ T-Zell-Subpopulation, der antigenen Determinanten, der gemessenen Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen sowie der Anzahl der identifizierten Epitope. Zehn zuvor noch nicht beschriebene Epitope wurden eben-falls identifiziert und die präsentierenden HLA-Allele der meisten in der Patientengruppe identifizierten Epitope bestimmt. Die mittels TCR-PCR untersuchten CD8+ T-Zell-Reaktionen waren auf einen oder wenige Klone fokussiert. Die Korrelation der experimentellen Daten mit den klinischen Verläufen der Patienten hinsichtlich HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung erbrachte jedoch keine Hinweise auf einen konkreten Zusammenhang. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Zusammenfassend ermöglichen die hier vorgestellten Methoden die Untersuchung des Langzeitverlaufes der CD4+ und CD8+ T-Zell-Antwort gegen immundominante Proteine auf Epitop-Ebene nach initialer Identifizierung der antigenen Determinanten, die direkte Bestimmung der Frequenzen der Epitop-spezifischen T-Zellen sowie die Untersuchung der Klonalität dieser Reaktionen aus ca. 2 x 20 ml Blut. Die Langzeit-Untersuchung von Patienten mit hohem Risiko für HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung kann so zu einem besseren Verständnis der komplexen HCMV-spezifischen T-Zell-Anwort und damit möglicherweise auch zur Verbesserung von Diagnose, Prophylaxe und Therapie dieser Patienten beitragen. / BACKGROUND: Human cytomegalovirus (HCMV) reactivation is still a leading cause of morbidity and mortality among immunosuppressed patients. Uncontrolled viral spread is prevented by an efficient T-cell response. However, little is known about the nature of this T-cell response. In this study we identified epitopes in two immunodominant HCMV-proteins, IE-1 (UL123) and pp65 (UL83), measured the frequencies of T-cells specific for these, and studied the clonotypic composition of selected T-cell responses in a group of HCMV-seropositive heart (n = 17) and lung (n = 3) transplant patients. METHODS: For both proteins overlapping pentadecapeptides covering the entire respective amino acid sequences were arranged in pools of 25 peptides each in such a way that every peptide was contained in exactly 3 pools. PBMC were stimulated with the resulting 15 pools for IE-1 or 16 pools or pp65, respectively, as well as with pools containing all peptides of the corresponding protein. Individual peptides leading to a positive T-cell response were identified by flow cytometric detection of intracellular interferon-gamma, each single peptide corresponding to a unique combination of 3 peptide pools. Selected T-cell populations specific for the previously identified single peptides were purified by performing an IFN-gamma secretion assay prior to magnetic cell separation and subsequent fluorescence-activated cell sorting. The clonality of these highly purified peptide-specific T-cell populations was then investigated by a T-cell receptor-gamma rearrangement-PCR and subsequent fragment analysis of fluorescence-labelled PCR amplificates. RESULTS: We observed broad heterogeneity among the patients in terms of the immunodominant protein, number of epitopes, predominance of CD4 or CD8 T-cell responses, and epitope-specific T-cell frequencies. 10 previously unknown epitopes were identified, and the HLA-restriction of most of the identified epitopes could be determined. The investigated T-cell responses showed a high degree of clonal focussing. These data were correlated to the patients episodes of HCMV reactivation, but a correlation between differences in the T-cell responses and a different clinical outcome in terms of HCMV-reactivation could not be established. CONCLUSIONS: In summary, this novel approach allows the rapid identification of epitopes contained in a given protein, direct determination of T-cell frequencies, and investigation of the T-cell clonality in the CD4 and CD8 T-cell subsets from as little as 2 times 20 ml of blood. Long-term follow-up of patients at risk for HCMV reactivation and disease may thus allow a more detailed insight into the complexity of the T-cell response to HCMV and may thus lead to improved diagnosis, prophylaxis and therapy.