In der vorliegenden Arbeit wurde der zelluläre Immunstatus von 17 Patienten mit Erstdiagnose eines soliden gastrointestinalen Tumors vor und nach intravenöser Applikation von drei Zyklen einer konventionellen Polychemotherapie untersucht. Verglichen wurde zu Beginn der Therapie mit einer Kontrollgruppe, bestehend aus 21 nicht onkologisch vorerkrankten Probanden. Zur Messung der individuellen T-Zellvermittelten Immunantwort auf Einzelzellebene wird auf die Methode des IFN-γ-ELISPOT-Assays zurückgegriffen. Die zentrale Frage war, ob die Applikation einer Polychemotherapie einen messbaren Effekt auf die Immunantwort des einzelnen Individuums hat. Zudem sollte untersucht werden, ob generelle Unterschiede zwischen Patienten mit einer unbehandelten Tumorerkrankung und gesunden Probanden bzw. allgemein internistisch erkrankten Patienten zu erkennen sind. In Zusammenschau der Ergebnisse sind trotz überwiegend unveränderter T-Zell-Antwort auf die meisten der eingesetzten Antigene einige statistisch signifikante Unterschiede festzuhalten. So zeigte die Gruppe der Tumorpatienten vor Applikation der Chemotherapie im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant erhöhte Spotintensität und einen höheren Stimulationsindex [A] in Bezug auf das Tuberkulose-Antigen CFP-10. Diese Veränderungen waren nach Applikation der Chemotherapie nicht mehr nachzuweisen. Des Weiteren ergaben sich bei den Tumorpatienten vor und nach Chemotherapie signifikante Veränderungen der T-Zell-Antwort bezüglich des Antigens Tetanus-Toxoid. Nach Applikation von 3 Zyklen Chemotherapie kam es zu einer Verminderung des Stimulationsindex [A]. Es wird daher die Vermutung nahe gelegt, dass sich gerade in Bezug auf bakterielle Infektionen die T-Zell-Antwort der Tumorpatienten signifikant ändert. Die klinische Relevanz müsste jedoch anhand gezielter Messung auf spezifische bakterielle Antigene in größer angelegten Studien überprüft werden.

Die adoptive T-Zell-Therapie (ATT) ist eine sich schnell entwickelnde Immuntherapie, die bei Patienten, die an verschiedenen Krebsarten leiden, eine positive klinische Reaktion anzeigt. Eine Variante der ATT ist eine T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Gentherapie, bei der Patienten-T-Zellen mit krebsspezifischen TCRs ausgestattet werden. Die Herstellung der TCR-erzeugten T-Zellen ist schnell und robust und erfordert eine geringe Anfangsmenge an Patienten-T-Zellen. Der Mangel an verfügbaren krebsspezifischen TCRs, die auf verschiedene Moleküle des menschlichen Leukozytenantigens (HLA) der Klasse I beschränkt sind, schließt jedoch viele Patienten von der Krebsbehandlung aus. Die Generierung einer krebsspezifischen TCR-Bibliothek, die aus gut definierten TCRs besteht, könnte die Zahl der Patienten, die an klinischen Studien teilnehmen, erhöhen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, Epstein-Barr-Virus (EBV)-spezifische TCRs zu identifizieren und zu isolieren, um eine EBV-spezifische TCR-Bibliothek als ein nützliches Werkzeug der TCR-Gentherapie bei der Behandlung von EBV-bedingten Krebserkrankungen zu generieren. Insgesamt wurden neun EBV-spezifische TCRs von EBV-positiven Spendern isoliert und charakterisiert, die verschiedene pHLA-Komplexe von EBV-Latentmembranproteinen (LMP1, LMP2A) und Kernprotein (EBNA3C) erkannten. Zusätzlich wurde ein neuartiges immunogenes LMP1-Epitop (QQNWWTLLV) entdeckt, das auf HLA-C*15:02 beschränkt ist. Definierte EBV-spezifische TCRs können als Grundlage für die EBV-spezifische TCR-Bibliothek verwendet werden, die eine wertvolle Quelle von TCRs für die schnelle Generierung von EBV-spezifischen T-Zellen zur Behandlung von Krebspatienten mit verschiedenen HLA-Typen darstellt. / Adoptive T cell therapy (ATT) is a fast developing immunotherapy indicating positive clinical response in patients suffering from different type of cancers. One type of the ATT is a T cell receptor (TCR) gene therapy, which involves endowing patient T cells with cancer-specific TCRs. Manufacturing of the TCR-engineered T cells is fast and robust, requiring small initial amount of patient T cells. However, lack of available cancer-specific TCRs restricted to various human leukocyte antigen (HLA) class I molecules eliminates many patients from cancer treatment. Generation of a cancer-specific TCR library consisting of well-defined TCRs could increase the number of patients enrolled in clinical trials. The aim of this PhD thesis was to identify and isolate Epstein-Barr virus (EBV)-specific TCRs in order to generate the EBV-specific TCR library as a useful tool of the TCR gene therapy for treatment of EBV-related malignancies. In total, nine EBV-specific TCRs of EBV-positive donors that recognized various pHLA complexes of EBV latent membrane proteins (LMP1, LMP2A) and nuclear protein (EBNA3C) were isolated and characterized. Additionally, a novel immunogenic LMP1 epitope (QQNWWTLLV) restricted to a HLA-C*15:02 was discovered. Defined EBV-specific TCRs can be used as a basis for the EBV-specific TCR library, which provides a valuable source of TCRs for rapid generation of EBV-specific T cells to treat cancer patients with different HLA types.

Untersuchungen der letzten Jahre deuten darauf hin, daß Virusinfektionen ein potentieller Modulator der menschlichen Allergieentstehung sind. Die folgende Studie untersucht, ob frühkindliche Infektionen mit CMV, EBV und VZV einen protektiven Effekt auf die Entstehung atopischer Erkrankungen im späteren Leben haben. Die Studie berücksichtigt sowohl die humorale, als auch die zelluläre Immunantwort auf Virusinfektion. Die humorale Immunantwort wurde serologisch im Verlauf bei 672 Kindern von Geburt bis zum 7. Lebensjahr untersucht (ELISA). Die Antikörper-Titer für CMV, EBV und VZV im Alter von 1 Jahr und 3 Jahren wurden mit den atopischen Manifestationen (atopische Dermatitis, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis, Gesamt-Serum-IgE und atopische Sensibilisierung) verglichen. Die TH1 Immunantwort (intrazelluläre IFN gamma Produktion) wurde bei 100 Kindern mit und ohne atopische Manifestationen im Alter von 1 Jahr bis 16 Jahren nach CMV Stimulation untersucht (Durchflußzytometrie). Signifikante Unterschiede in den Häufigkeiten atopischer Symptome zwischen Kindern mit positivem und negativem Antikörper-Titer gegen CMV, EBV und VZV konnten nicht gezeigt werden. Auf zellulärer Ebene zeigte sich, daß Kinder und Jugendliche ohne atopische Symptome auf Virus-Stimulation (CMV-Antigen bzw. Peptid) statistisch ebenso häufig mit einer IFN-gamma-Produktion (TH1-Immunantwort) reagieren wie Kinder und Jugendliche mit atopischen Krankheitszeichen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie können die Hypothese eines protektiven Effekts viraler Infektion, zumindest der Herpesgruppe, in den ersten Lebensjahren hinsichtlich einer späteren Allergieentstehung nicht bestätigen. Die Zusammenhänge der Entwicklung atopischer Erkrankungen sind bisher noch nicht vollständig geklärt. Es gilt weiterhin zu erforschen, in welchem Maße frühkindliche Infekte, neben Allergenexposition, Ernährung, Luftschadstoffen und familiärer Prädisposition die Allergogenese beeinflussen. / Studies of the last years indicated that virus infections are a potential modulator of the human allergogenesis. The following study analysed if infections with CMV, EBV and VZV in early childhood have a protective effect on the development of atopic disorders in later life. The study considered the humoral and cellular immuneresponse to virus infection. The humoral immuneresponse of 672 children were serologically followed up from birth to the age of seven years (ELISA). The antibody titres of CMV, EBV and VZV at the age of 1 year and 3 years were compared with the atopic manifestations (atopic dermatitis, asthma bronchiale, rhinoconjunctivitis, total serum IgE levels and atopic sensitiziation) at the age of seven years. The TH1 immuneresponse (intracellular IFN gamma production) of 100 atopic and nonatopic children at the age of 1 year to 16 years were analysed after CMV stimulation (flowcytometry). There was no significant difference in atopic manifestations between seven-year-old children with seropositivity and seronegativity (CMV, EBV, VZV) in early childhood. Nonatopic children showed the same T cell reactivity after CMV stimulation like atopic children. The study could not show a protective effect of herpesvirus infections in early childhood on the development of atopic disorders in later life. Further studies will help to understand the influence of virus infections on the human allergogenesis.

For the elucidation of the dynamics of signal transduction processes that are induced by cellular interactions, defined events along the signal transduction cascade and subsequent activation steps have to be analyzed and then also correlated with each other. This cannot be achieved by ensemble measurements because averaging biological data ignores the variability in timing and response patterns of individual cells and leads to highly blurred results. Instead, only a multi-parameter analysis at a single-cell level is able to exploit the information that is crucially needed for deducing the signaling pathways involved. The aim of this work was to develop a process line that allows the initiation of cell-cell or cell-particle interactions while at the same time the induced cellular reactions can be analyzed at various stages along the signal transduction cascade and correlated with each other. As this approach requires the gentle management of individually addressable cells, a dielectrophoresis (DEP)-based microfluidic system was employed that provides the manipulation of microscale objects with very high spatiotemporal precision and without the need of contacting the cell membrane. The system offers a high potential for automation and parallelization. This is essential for achieving a high level of robustness and reproducibility, which are key requirements in order to qualify this approach for a biomedical application. As an example process for intercellular communication, T cell activation has been chosen. The activation of the single T cells was triggered by contacting them individually with microbeads that were coated with antibodies directed against specific cell surface proteins, like the T cell receptor-associated kinase CD3 and the costimulatory molecule CD28 (CD; cluster of differentiation). The stimulation of the cells with the functionalized beads led to a rapid rise of their cytosolic Ca2+ concentration which was analyzed by a dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the Ca2+-sensitive dye Fura-2. After Ca2+ imaging, the cells were isolated individually from the microfluidic system and cultivated further. Cell division and expression of the marker molecule CD69 as a late activation event of great significance were analyzed the following day and correlated with the previously recorded Ca2+ traces for each individual cell. It turned out such that the temporal profile of the Ca2+ traces between both activated and non-activated cells as well as dividing and non-dividing cells differed significantly. This shows that the pattern of Ca2+ signals in T cells can provide early information about a later reaction of the cell. As isolated cells are highly delicate objects, a precondition for these experiments was the successful adaptation of the system to maintain the vitality of single cells during and after manipulation. In this context, the influences of the microfluidic environment as well as the applied electric fields on the vitality of the cells and the cytosolic Ca2+ concentration as crucially important physiological parameters were thoroughly investigated. While a short-term DEP manipulation did not affect the vitality of the cells, they showed irregular Ca2+ transients upon exposure to the DEP field only. The rate and the strength of these Ca2+ signals depended on exposure time, electric field strength and field frequency. By minimizing their occurrence rate, experimental conditions were identified that caused the least interference with the physiology of the cell. The possibility to precisely control the exact time point of stimulus application, to simultaneously analyze short-term reactions and to correlate them with later events of the signal transduction cascade on the level of individual cells makes this approach unique among previously described applications and offers new possibilities to unravel the mechanisms underlying intercellular communication. / Zelluläre Interaktionen sind wirkungsvolle Mechanismen zur Kontrolle zellulärer Zustände in vivo. Für die Entschlüsselung der dabei beteiligten Signaltransduktionsprozesse müssen definierte Ereignisse entlang der zellulären Signalkaskade erfasst und ihre wechselseitige Beziehung zueinander aufgeklärt werden. Dies kann von Ensemble-Messungen nicht geleistet werden, da die Mittelung biologischer Daten die Variabilität des Antwortverhaltens individueller Zellen missachtet und verschwommene Resultate liefert. Nur eine Multiparameteranalyse auf Einzelzellebene kann die entscheidenden Informationen liefern, die für ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalwege unabdingbar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Methode, welche die gezielte Kontaktierung einzelner Zellen mit anderen Zellen oder Partikeln ermöglicht und mit der die dadurch ausgelösten zellulären Reaktionen auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen analysiert und miteinander korreliert werden können. Da dies die schonende Handhabung einzeln adressierbarer Zellen erfordert, wurde ein auf Dielektrophorese (DEP) basierendes mikrofluidisches System eingesetzt, welches die berührungslose Manipulation mikroskaliger Objekte mit hoher zeitlicher und örtlicher Präzision erlaubt. Das System besitzt ein hohes Potential zur Automatisierung und Parallelisierung, was für eine robuste und reproduzierbare Analyse lebender Zellen essentiell, und daher eine wichtige Voraussetzung für eine Anwendung in der Biomedizin ist. Als Modellsystem für interzelluläre Kommunikation wurde die T-Zell-Aktivierung gewählt. Die Aktivierung der einzelnen T-Zellen wurde durch ihre gezielte Kontaktierung mit Mikropartikeln („beads“) induziert, welche mit Antikörpern gegen spezielle Oberflächenproteine, wie die dem T-Zell-Rezeptor assoziierte Kinase CD3 oder das kostimulatorische Protein CD28, beschichtet waren. Die Stimulation der Zellen mit den funktionalisierten beads führte zu einem raschen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, welche über eine ratiometrische Detektion des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 gemessen wurde. Anschließend wurden die einzelnen Zellen aus dem mikrofluidischen System isoliert und weiterkultiviert. Am nächsten Tag wurden Zellteilung und die CD69-Expression – ein wichtiger Marker für aktivierte T-Zellen – analysiert und auf Ebene der individuellen Zelle mit dem zuvor gemessenen Ca2+-Signal korreliert. Es stellte sich heraus, dass der zeitliche Verlauf des intrazellulären Ca2+-Signals zwischen aktivierten und nicht aktivierten, sowie zwischen geteilten und nicht geteilten Zellen signifikant verschieden war. Dies zeigt, dass Ca2+-Signale in stimulierten T-Zellen wichtige Informationen über eine spätere Reaktion der Zelle liefern können. Da Einzelzellen äußerst empfindlich auf ihre Umgebungsbedingungen reagieren, war die Anpassung der experimentellen Vorgehensweise im Hinblick auf die Zellverträglichkeit von großer Bedeutung. Vor diesem Hintergrund wurde der Einfluss sowohl der mikrofluidischen Umgebung, als auch der elektrischen Felder auf die Überlebensrate und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration der Zellen untersucht. Während eine kurzzeitige DEP-Manipulation im mikrofluidischen System die Vitalität der Zellen nicht beeinträchtigte, zeigten diese unregelmäßige Fluktuationen ihrer intrazellulären Ca2+-Konzentration selbst bei geringer elektrischer Feldexposition. Die Ausprägung dieser Fluktuationen war abhängig von der Expositionszeit, der elektrischen Feldstärke und der Feldfrequenz. Über die Minimierung ihres Auftretens konnten experimentelle Bedingungen mit dem geringsten Einfluss auf die Physiologie der Zellen identifiziert werden. Die Möglichkeit, einzelne Zellen zeitlich definiert und präzise mit anderen Zellen oder Oberflächen zu kontaktieren, die unmittelbare Reaktion der Zellen zu messen und diese mit späteren Ereignissen der Zellantwort zu korrelieren, macht die hier vorgestellte Methode einzigartig im Vergleich mit anderen Ansätzen und eröffnet neue Wege, die der interzellulären Kommunikation zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären.

Die Mehrzahl der im Thymus generierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen (Treg) besitzt hohe Affinität gegenüber körpereigenen Antigenen. Es ist bekannt, dass T-Zell Rezeptoren (TCR) auf Treg Zellen in der Peripherie zusätzlich auch fremde Antigene verschiedener Pathogene wie Parasiten, Bakterien und Viren erkennen. Wenig ist bekannt über das klonale T-Zell Rezeptor Repertoire dieser Treg Populationen und ihre Beziehung zu CD4+CD25low effektor T-Zellen (Teff) im Menschen. In dieser Studie analysieren wir humane TCR auf expandierten Treg and Teff Zellen mit definierter Antigen Spezifität für Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II restringierte „fremde“ Epitope des Cytomegalovirus (CMV). Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der gleiche TCR Vb-CDR3 Klon in beiden funktionell unterschiedlichen Subpopulationen in vitro dominant expandiert ist. Im Unterschied zu ihren klonal-identischen Teff Gegenspielern, exprimieren die suppressiven Treg Zellen kaum CD127 und IL-2, aber hohe Mengen an IFNg und IL-10. Zusammen mit der signifikant erhöhten FOXP3 Expression, trotz unvollständiger foxp3-DNA Demethylierung, lassen sich die CMV-spezifischen CD4+CD25high Treg Zellen einem induzierten Treg (iTreg) Phänotyp zuordnen mit Ähnlichkeit zum beschriebenen Tr-1 Phänotyp. Darüber hinaus konnten wir die klonale TCR Identität auch in frisch isolierten CD4+CD25low und CD4+CD25high Subpopulationen bestätigen, was die Entstehung von CMV-spezifischen Treg Zellen bereits in vivo nahe legt. Periphere CD25high Treg Zellen supprimieren die anti-virale Immunantwort in Patienten mit häufigen CMV-Reaktivierungen, was auf ihre Bildung als Reaktion chronischer Antigenexposition interpretiert werden kann. Unsere Ergebnisse beweisen erstmals direkt, dass aus dem gleichen humanen T-Zell Klon Teff und Treg Zellen mit identischer Spezifität entstehen können und lassen vermuten, dass die Treg Induktion in der Peripherie durch häufige Antigenexposition vorangetrieben wird. / The majority of thymically arised regulatory CD4+CD25high T cells (Treg) show high affinity to self-antigens. It has been proposed that T-cell receptors (TCR) on Treg cells in the periphery also recognize foreign-antigens from pathogens, such as bacteria and viruses. Studies in mice have shown that peripheral Treg cells can be generated not only from naïve T cells but also from effector T cells (Teff). However, in humans the clonal TCR-repertoire of these Treg populations and their relation to effector CD4+CD25low Teff is not sufficiently known up to date. Here, we analyzed human TCRs derived from expanded Treg and Teff cells with defined specificity to MHC class-II restricted “foreign” epitopes of Cytomegalovirus (CMV). Remarkably, we found that both functionally distinct subsets share the same dominant TCR-CDR3 clones in vitro. In contrast to their Teff counterparts, the Treg cells express low CD127 and IL-2, but high IL-10 upon antigen stimulation. Therefore, together with increased FOXP3 expression, but incomplete foxp3 DNA-demethylation, human CMV-antigen specific Treg cells exhibit an induced phenotype (iTreg) in vitro with similarity to recently described Tr-1 phenotype. Moreover, the clonal identity was confirmed in freshly isolated CD4+CD25low and CD4+CD25high subsets, suggesting their generation occurred already in vivo. Peripheral CD25high Treg cells suppress the anti-viral immune response in patients with frequent CMV-reactivations, implying their development as reaction on chronic antigen-exposure. Our results demonstrate directly for the first time, that the same human T-cell clone can possess the phenotype of Teff and Treg cells with specificity to identical foreign epitopes and suggest that Treg-induction in the periphery is supported by frequent antigen-exposure.

Da Filarieninfektionen noch immer chemotherapeutisch schwer bekämpfbar sind, ist die Aufklärung von potentiell protektiven Molekülen, die zur Impfstoffentwicklung von Nutzen sein könnten, von Bedeutung. Ein vielversprechendes Antigen stellt in diesem Zusammenhang die Chitinase von infektiösen Drittlarven von Onchocerca volvulus dar. In dieser Arbeit sollte deshalb dieses Protein immunologisch charakterisiert und immundominante Bereiche identifiziert werden. Dazu wurde die cDNA des gesamten Proteins (OvL3-Chitinase) und die cDNA der Domäne, die für die Chitin-Bindung verantwortlich ist (OvL3-CBD), in einen Expressionsvektor kloniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die aufgereinigte OvL3-Chitinase zeigte enzymatische Aktivität. Die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD wurden in Immunisierungsstudien im Tiermodel der Nagetierfilarie A. viteae und M. unguiculatus eingesetzt. Während die Immunisierung mit OvL3-CBD mit dem Adjuvans Alum zu keiner Reduzierung der Adultwurmlast führte, war nach Gabe der OvL3-Chitinase die Anzahl der Adultwürmer um 40 % bzw. um 17,7% reduziert. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase allein und in Kombination mit zwei verschiedenen Adjuvantien (STP und Alum) in Immunisierungsstudien von BALB/c-Mäusen eingesetzt, deren Immunantworten anschließend charakterisiert wurden. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, daß die Chitinase ohne zusätzliche Gabe eines Adjuvans unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Dies wurde durch die Anwesenheit von Antikörpern der Subklasse IgG1 deutlich. Außerdem waren Milzzellen dieser Mäuse nicht in der Lage, nach Restimulation mit Chitinase mit Proliferation zu reagieren. Durch den Einsatz der Adjuvantien STP und Alum konnte eine Polarisation der Immunantworten erfolgen. Während die Immunisierung mit Chitinase und Alum zur deutlichen Bildung von IgG1-Antikörpern und zu einer leichten Erhöhung der Antikörper IgG2a und IgG2b führte, konnte nach Immunisierung mit Chitinase und STP neben Antikörpern der Subklasse IgG1 deutliche erhöhte OD-Werte von IgG2a und IgG2b gemessen werden. In beiden Gruppen reagierten Milzzellen nach Restimulation mit Chitinase, wobei die Proliferationswerte der STP/Chitinase-Gruppe über denen der Alum/Chitinase-Gruppe lagen. Durch den Einsatz von Salmonellen, die Chitinase exprimierten, konnten die T-Zell-Antworten verstärkt werden. Es konnten jedoch keine antigen-spezifischen Antikörper gefunden werden. Mit Hilfe von drei verschiedenen T-Zell-Algorithmen (Algorithmus nach Rothbard und Taylor, nach Humphreys und die MHC-II-Bindungs-Motive nach Rammensee) wurden T-Zell-Epitope innerhalb der OvL3-Chitinase identifiziert. Alle vorhergesagten Epitope wurden als synthetische Peptide hergestellt und in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Hierzu wurden Milzzellen von Mäusen verwendet, die dreimal mit rekombinanter Chitinase und dem Adjuvans STP immunisiert worden waren. Um möglichst viele T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase zu ermitteln, wurden überlappende Peptide (Pepscan), die die Gesamtheit der Chitinase umfaßten, in T-Zell-Tests eingesetzt. Die verwendeten Algorithmen wurde auf ihre Sensitivität und Spezifität überprüft, indem die vorhergesagten Epitope mit den ermittelten T-Zell-Epitopen des Pepscans verglichen wurden. Dabei konnte der Algorithmus von Rammensee den besten Index an Sensitivität (0,47) und Spezifität (0,7) erzielen. Eine Kombination der Algorithmen ergab, daß die Verknüpfung des Algorithmus nach Rothbard und Taylor mit den MHC-Bindungs-Motiven nach Rammensee die Sensitivität auf 0,67 erhöhen konnte, doch die Spezifität sank durch die hohe Anzahl der vorhergesagten Epitope auf 0,33. Die Anwendung der Algorithmen auf die Sequenz der OvL3-Chitinase führte zu der Identifizierung von fünf Bereichen, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden, und von denen vier in T-Zell-Proliferationstests deutliche Proliferationswerte erzielten. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD in Kamerun hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, PBMC von Onchozerkose-Patienten zu restimulieren, die aus einem hyperendemischen Onchozerkose-Gebiet stammten. Diese Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse aus den Immunisierungsstudien mit BALB/c-Mäusen, in denen Chitinase eine TH2-Immunantwort hervorrief. Die PBMC der Onchozerkose-Patienten zeigten nur eine sehr geringe Proliferation nach Stimulation mit OvL3-Chitinase und OvL3-CBD. Begleitet wurde diese Proliferation von Ausschüttung typischer TH2-Zytokine wie IL-10 (Chitinase) bzw. IL-4, IL-5 und IL-10 (CBD). Die Untersuchung der Antikörperantworten der Onchozerkose-Patienten zeigte, daß bei 77% der untersuchten Patienten IgG4-Antikörper gegen die Chitinase und bei 20% gegen die OvL3-CBD im Serum nachgewiesen werden konnten. / Chemotherapeutic treatment of filarial infections has rendered difficult and still insufficient. Therefore, the identification of potentially protective molecules which can be used for vaccine development is desirable. The chitinase of larvae stage three of Onchocerca volvulus constitutes a promising antigen. Immunological characterization of this protein and the identification of immunodominat regions was performed in this study. The complete sequence (OvL3-chitinase) and the C-terminal end responsible for the binding of chitin (OvL3-CBD) were cloned in an expression vector, overexpressed in E. coli and subsequently purified. Recombinant chitinase was enzymatically active. The OvL3-chitinase and the OvL3-CBD were used for immunization studies using the rodent filaria A. viteae in the animal model M. unguiculatus. No decreased number of adult worms was observed after immunization with OvL3-CBD in the present of Alum as adjuvans, while chitinase together with STP resulted in the reduction the worm burden to 40 % (first trial) and to 17,7 % (second trial). Additional immunization studies using BALB/c-mice were performed with OvL3-chitinase in the absence or the presence of two different adjuvans. Spleen cells isolated from mice immunized with chitinase in the absence of adjuvans were devoid of proliferative capacity after in vitro antigenic restimulation. Antigen-specific IgG1 antibodies were the only subtype detectable in sera from mice. These results suggested that a Th2 response was induced after immunization with chitinase under these conditions. Including STP or Alum in the immunization protocol a polarization of the obtained immune response was found. Immunization with chitinase together with Alum elicited strong IgG1 response followed by slightly increase of IgG2a and IgG2b. Co-administration of chitinase and STP evoked increased IgG2a and IgG2b antibodies in addition to the observed IgG1 response. Good proliferative responses were observed for spleen cells from mice immunized with chitinase in the present of both adjuvans after in vitro restimulation with chitinase. Furthermore stronger T-cell reactivity was found in the group immunized with chitinase/STP. Also chitinase was expressed in Salmonella and oral immunization of mice with this construct enforced the T-cell reactivity, however antigen specific antibodies were undetectable. To further characterize T cell reactivity against OvL3-chitinase T cell epitopes using the Rothbard and Taylor algorithm (1988), Humphreys prediction and the MHC-II-binding motifs from Rammmensee (1995) were identified. All predicted epitopes were synthesized and tested in T-cell proliferation assays. Additional synthetic L3-chitinase-derived overlapping peptides were also used in T-cell proliferation assays. The sensitivity and specificity of the algorithms was evaluated by comparing the predicted epitopes with the epitopes determined by overlapping peptides. Using this approach, prediction based on MHC-II-binding motifs showed the highest sensitivity (0,47) and specificity (0,7). A further increase of the predictive power was obtained by a combining MHC-II-binding motifs and Rothbard and Taylor algorithm, resulting in increased sensitivity (0,67) but lower specificity (0,33). Five immunodominant regions were identified by all algorithm and four of them were confirmed as T-cell epitopes in T-cell assays. PBMCs isolated from patients affected with Onchocerca volvulus from Cameroon were also tested for their reactivity against OvL3-chitinase and the OvL3 CBD in T-cell proliferation assays. After in vitro restimulation with OvL3-chitinase and CBD only marginal T-cell response was observed accompanied by release of Th2-like cytokines such as IL-10 when stimulated with chitinase and IL-4, IL-5 and IL-10 when stimulated with CBD. Strong antibody responses of the IgG4 isotype were detected in the serum of 77% of the patients against chitinase and only in 20% of the patients against CBD.

Die Hauptaufgabe des Immunsystems ist der Schutz des Koerpers gegen den externen Angriff von Viren, Bakterien und sonstigen potentiellen Krankheitserregern, sowie die Vermeidung von weiteren Infektionen durch bereits erfahrene Pathogene, die durch die Errichtung eines immunologischen Gedaechtnisses vermieden werden. Zytotoxische T-Zellen sind die Protagonisten der spezifischen Immunantwort beim Bekaempfen von intrazellulaeren Infektionen. Das Proteasom spielt eine wichtige Rolle in der Produktion von antigenischen Peptiden dar, die, sobald sie von MHC-Molekurle praesentiert werden, furr die Aktivierung von T-Zellen in der Immunantwort verantwortlich sind. Diese Thesis praesentiert eine Studie, die belegt, dass die Laenge und Groesse von Fragmenten, die waehrend der Proteasomedegradation entstehen, sehr von der Groesse der Schranke abhaengt, die den Substratfluss durch das Proteasom steuert. Das hier vorgestellte Modell kann daher in der Quantifizierung des antigenischen Umsatzes und deren Praesentation von grossem Nutzen sein. Wir stellen die Vermutung an, dass die Ersetzung von konstitutivem Proteasom durch Immunoproteasom, die waehrend einer Immunantwort in antigenpraesentierenden Zellen stattfindet, das T-Zell-Repertoire stark veraendert und dabei hilft, eine schnelle und effektive Immunreaktion zu starten. Die Schlussfolgerungen dieser Dissertation sind: Die Kinetik der antigenischen Praesentation und ihre Quantifizierung sind wichtige Aspekte fuer das Verstehen der Instandhaltung und Funktionalitaet des T-Zell-Repertoires. Das Immunsystem nutzt die Kinetik des Proteasoms und den Wettbewerb um Ressourcen zwischen den T-Zellen zur Entwicklung von cleveren Strategien gegen Infektionen aus, ohne dabei auf die Produktion von teueren neuen Ressourcen zururckgreifen zu m"ussen. / The major tasks of the immune system are the protection of the body from undesired external pathogenic attack and the prevention of further and already experienced challenges, which are avoided by the establishment of immunological memory. The proteasome machinery plays a crucial role in the generation of antigenic peptides, which are responsible for the activation of T-cell during an immune response. In this PHD thesis the study of the T-cells dynamics and their homeostasis has been investigated. In particular we focused on the immunological function of the intracellular protein degradation. This thesis evidenced that the length and the amount of fragments generated by the proteasome degradation fairly depend on the size of the gates regulating the flux of substrate through the proteasome. This model captures the known characteristics of proteasomal degradation, and can therefore help to quantify MHC antigen processing and presentation. A model dealing with the dynamics of cytotoxic T-cells and the role of the antigen presentation in shaping the T-cell repertoire has been proposed. This model shows that the replacement of constitutive proteasome with the immunoproteasome re-shapes significantly the T-cell clone repertoire and helps to mount a fast and effective immune response. The last part of this thesis has been devoted to the population dynamics of cytotoxic T-cells over a long timescale. Stochastic models describing the maintenance of T-cell memory clones have been proposed. The conclusions are: the kinetics of the antigen presentation and its quantification are critical aspects for the understanding of the maintenance and the functionality of the T-cell repertoire. The Immune system takes advantage of the kinetics of proteasome and the competition for resources in the T-cell repertoire to develop a clever strategy to challenge infections without expensive production of new resources.

Glukokortikoide (GK) zählen zu den effizientesten Medikamenten bei der Behandlung akuter und chronischer Entzündungskrankheiten. Ihr Einsatz ist häufig durch das Auftreten zahlreicher und teilweise irreversibler Nebenwirkungen beeinträchtigt. Aus diesem Grund wurden neue Glukokortikoid-Rezeptor-Liganden, wie die nicht-steroidalen selektiven Glukokortikoid-Rezeptor-Agonisten (SEGRAs), die eine potente anti-entzündliche Wirkung bei gleichzeitig vermindertem Nebenwirkungspotential aufweisen sollen, entwickelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SEGRA-Substanz BAY1155975 hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die CD28-kostimulierte Aktivierung primärer humaner T-Zellpopulationen mit der von klassischen GK, wie z.B. Prednisolon, verglichen. In humanen Gedächtnis/Effektor- CD4+ T-Zellen wies die höchste Konzentration von BAY1155975 im Vergleich zu Prednisolon eine statistisch signifikant größere Hemmung der CD28-kostimulierten Sekretion von Effektorzytokinen (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 und IL22) auf. Proliferation, Apoptose und die Expression verschiedener Aktivierungsmarker wurden dagegen durch BAY1155975 und Prednisolon gleichermaßen reguliert. Es wird eine stärkere Hemmung des Kalzium-Kalzineurin-NFAT Signalweges durch BAY1155975 in diesen Zellen vermutet. In vivo zeigten BAY1155975 und Prednisolon eine ähnlich starke Hemmung der T-Zell-vermittelten Hautentzündung im DNFB-induzierten Kontaktallergiemodell in Mäusen, wenn die Behandlung der Mäuse mit den Substanzen vor dem Challenge erfolgte. Bei einer Substanzbehandlung der Mäuse während der Sensibilisierung wurde die Hautentzündung dagegen deutlich stärker durch BAY1155975 als durch Prednisolon gehemmt. Zusammenfassend geben die Ergebnisse dieser Arbeit einen Hinweis auf eine stärkere Hemmung der T-Zellsensibilisierung und der Effektorzytokinsekretion durch die SEGRA Substanz BAY1155975 im Vergleich zum klassischen GK Prednisolon. / Glucocorticoids (GCs) are the most effective therapeutic agents for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases. Their use is often accompanied with numerous and sometimes irreversible side-effects. Therefore, new glucocorticoid receptor (GR) ligands with should have potent anti inflammatory efficacy but a reduced side-effect profile have been developed. Non steroidal selective glucocorticoid receptor agonists (SEGRAs) represent a new class of GR ligands with an improved therapeutic index. In this study, we compared the SEGRA, BAY1155975, and the classical GC, prednisolone, regarding their suppressive effect on CD28-costimulated activation of human primary T cell subpopulations. In human memory/effector CD4+ T cells, BAY1155975 at the highest concentration exhibited a significantly stronger inhibition of CD28-costimulated effector cytokine secretion (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 and IL22) in comparison to prednisolone. Interestingly, proliferation, apoptosis and expression of activation markers were similarly regulated by BAY1155975 and prednisolone. Further studies on different signal transduction pathways suggested that BAY1155975 stronger inhibited the calcium-calcineurin-NFAT pathway than prednisolone in these cells. In vivo BAY1155975 and prednisolone showed comparable efficacy in inhibition of T cell dependent skin inflammation in DNFB-induced contact hypersensitivity models in mice, when mice were treated before hapten challenge. In contrast, when mice were treated around hapten sensitization markedly stronger inhibition of skin inflammation was observed for BAY1155975 than prednisolone. In summary, the data of this study give evidence for a stronger inhibition of T cell sensitization and effector cytokine secretion by the SEGRA, BAY1155975, in comparison to the classical GC, prednisolone.

Die Herstellung von T-Zellen mit definierten Spezifitäten durch den Transfer von T-Zellrezeptor (TCR) Genen ist eine effiziente Methode, um Zellen für eine Immuntherapie bereitzustellen. Eine besondere Herausforderung ist dabei, ein ausreichend hohes Expressionsniveau des therapeutischen TCR zu erreichen. Da T-Zellen mit einem zusätzlichen TCR ausgestattet werden, entsteht eine Konkurrenzsituation zwischen dem therapeutischen und dem endogenen TCR. Bevor diese Arbeit begonnen wurde war nicht bekannt, welche TCR nach einem Gen-Transfer exprimiert werden. Daher haben wir Modelle etabliert, in denen TCR Gene in Maus und humane T-Zellen mit definierten endogenen TCR transferiert wurden. Die Expression beider TCR wurde mithilfe von Antikörpern und MHC-Multimeren analysiert. Diese Modelle haben gezeigt, dass bestimmte TCR andere TCR von der Zelloberfläche verdrängen können. Dies führte in einem Fall zu einer vollständigen Umkehr der Antigenspezifität. Aufgrund dieser Ergebnisse haben wir das Konzept von „starken“ (gut exprimierten) und „schwachen“ (schlecht exprimierten) TCR vorgeschlagen. Zusätzlich wurde die Verdrängung „schwacher“ und „starker“ humaner TCR durch Maus TCR beobachtet. Parallel dazu wurde berichtet, dass die konstanten (C) Regionen von Maus TCR für die erhöhte Expression auf humanen Zellen verantwortlich sind. Dies führte zu einer Strategie zur Verbesserung der Expression humaner TCR, die auf dem Austausch der humanen C-Regionen durch die von Maus TCR basiert (Murinisierung). Ein Problem ist dabei die mögliche Immunogenität dieser hybriden Konstrukte. Deshalb haben wir jene Bereiche der Maus C-Regionen identifiziert, die für die erhöhte Expression verantwortlich sind. In der TCRalpha Kette wurden vier und in der TCRbeta Kette fünf Aminosäuren gefunden, die ausreichend für diesen Effekt waren. Primäre humane T-Zellen mit TCR, die diese neun „Maus“ Aminosäuren enthielten, zeigten eine bessere Funktionalität als T-Zellen mit Wildtyp TCR. / The in vitro generation of T cells with a defined antigen specificity by T cell receptor (TCR) gene transfer is an efficient method to create cells for immunotherapy. One major challenge of this strategy is to achieve sufficiently high expression levels of the therapeutic TCR. As T cells expressing an endogenous TCR are equipped with an additional TCR, there is a competition between therapeutic and endogenous TCR. Before this work was started, it was not known which TCR is present on the cell surface after TCR gene transfer. Therefore, we transferred TCR genes into murine and human T cells and analyzed TCR expression of endogenous and transferred TCR by staining with antibodies and MHC-multimers. We found that some TCR have the capability to replace other TCR on the cell surface, which led to a complete conversion of antigen specificity in one model. Based on these findings we proposed the concept of ‘‘strong’’ (well expressed) and “weak” (poorly expressed) TCR. In addition, we found that a mouse TCR is able to replace both “weak” and “strong” human TCR on human cells. In parallel to this result, it was reported that the constant (C)-regions of mouse TCR were responsible for the improved expression of murine TCR on human cells. This led to a strategy to improve human TCR by exchanging the C-regions by their murine counterparts (murinization). However, a problem of these hybrid constructs is the probable immunogenicity. Therefore, we identified the specific parts of the mouse C-regions which are essential to improve human TCR. In the TCRalpha C-region four and in the TCRbeta C-region five amino acids were identified. Primary human T cells modified with TCR containing these nine “murine” amino acids showed an increased function compared to cells modified with wild type TCR. For TCR gene therapy the utilization of these new C-regions will reduce the amount of foreign sequences and thus the risk of immunogenicity of the therapeutic TCR.

IL-10 und TGF-beta sind immunsupprimierende Zytokine, die in verschiedenen Tumoren, u.a. im Melanom, entdeckt wurden und als Hauptursache für das Versagen der Anti-Tumorimmunantwort angesehen werden. Allerdings wurden divergente Daten auch berichtet. Um diese Diskrepanz zu erklären, wurde die Expression dieser Zytokine mittels quantitativer RT-PCR im Melanom und in Haut gesunder Individuen verglichen. Weiterhin wurde die Induktion beider Zytokine in Kokulturexperimenten mit Dendritische Zellen und T-Zellen zusammen mit Tumorzellen sowie ihr Einfluß auf das Immunsystem untersucht. Beide Zytokine sowie deren Rezeptoren wurden im Melanom exprimiert, aber im Vergleich mit gesunder Haut auf signifikant geringerem Level. Dementsprechend waren die Expressionen von IL-10-induzierbare-SOCS-3 und auch TGF-beta-induzierbare-SMAD-7 im Tumor gering und in der gesunden Haut hoch. T-Zellen, die mit einer großen Zahl an Tumorzellen kokultiviert wurden, entwickelten einen anergischen Zustand, aber ohne mit dem IL-10 oder TGF-beta Level zu korrelieren. Dendritische Zellen, die zusammen mit Tumorzellen kokultiviert wurden, wiesen eine gemischte Population an vollständig und unvollständig differenzierten iDCs auf, produzierten hohe Level IL-10 und konnten die CD4 T Zellproliferation weniger effizient induzieren. Trotzdem konnten sie zur Reifung induziert werden, wobei die Blockierung von IL-10 nicht die Fähigkeit der resultierenden, reifen DCs veränderte, CD4 T-Zellproliferation zu induzieren. DCs, deren Reifung in der Gegenwart von Tumorzellen induziert wurde, produzierten erhöhte Level an IL-10, dagegen gleiche oder verminderte Level an TGF-beta und waren effizienter in der Induktion der CD4 T-Zellproliferation. Die fehlende Korrelation von IL-10 und TGF-beta mit den Immundefiziten in situ und in vitro legt den Schluß nahe, ihre Rolle bei Krebs neu zu überdenken. / IL-10 and TGF-beta are immunosuppressive cytokines expressed in tumors including melanoma and, therefore, deemed major cause for failing anti-tumor immune responses. To re-evaluate their role, their expression was compared by quantitative RT-PCR in melanoma and skin of healthy individuals, their induction in dendritic cells and T cells co-cultured with tumor cells, and their effects on the immune cells were tested. Both cytokines as well as their receptors were expressed in melanoma at significantly lower levels than in healthy skin. Consequently, the expressions of IL-10-responsive SOCS-3 and TGF-beta-responsive Smad-7 were low in tumors but high in healthy skin. T cells co-cultured with tumor cells developed an anergic state but without increased IL-10 or TGF-beta expression. In vitro tumor-associated iDCs produced high IL-10 levels and were less efficient in inducing T cell proliferation. Nonetheless, they could be induced to mature, and blocking IL-10 did not alter the capacity of the resulting mDCs to induce T cell proliferation. mDCs co-cultured with tumor cells produced increased IL-10 but similar or decreased TGF-beta level and were more efficient in inducing T cell proliferation. The lack of correlation of IL-10 and TGF-beta with immune deficits in situ and in vitro suggests a necessity of re-evaluating their roles in cancer.