Diese Arbeit beschreibt die immunologischen Eigenschaften von Acanthochilonema viteae Tropomyosin, einem Muskel-assoziierten Protein. A. viteae ist ein zu den Filarien gehörender Parasit von Gerbilen, ähnlich dem humanpathogenen Filarie Onchocercha volvulus. Diese Arbeit hatte die funktionelle Charakterisierung von A. viteae Tropomyosin im Kontext der natürlichen Infektion und experimentellen Vakzinierung zum Ziel. Das allergene Potential des Tropomyosins und die Produktion von spezifischen IgE-Antikörpern wurden untersucht. Außerdem wurden Tropomyosin-spezifische monoklonale Antikörpern (mAk) entwicklet. Es konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin als vielversprechender Kandidat zur Vakzinentwicklung gegen Filariosen angesehen werden kann, wobei berücksichtigt werden muss, dass deutliche Effekte nur unter Th1-Bedingungen auftreten. Die Vakzinierung mit Protein oder DNA reduzierte Adultwurmzahlen um 30 bzw. 45%. Während einer Infektion fungiert Tropomyosin als funktionelles Allergen und führt zur Produktion von hohen Mengen spezifischen IgEs. Ein Screening synthetischer Peptid-Bibliotheken zeigte gemeinsame 13 IgG- und 11 IgE-Epitope. Weiters konnte Kreuzreaktivität mit anderen Tropomyosinen und diesen gemeinsamen IgE-Epitopen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von mAk konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin auf der Oberfläche der Kutikula der Larvenstadien L3 und microfilariae des Parasiten vorkommt. Durch die Deglykosylierung des nativen Proteins wurde deutlich, dass einige Epitope von posttranslationellen Modifikationen gebildet werden. Weitere Immunisierungen mit Tropomyosin führten zu einem ähnlichen Profil der Zellaktivierung und Antikörperproduktion wie der Adjuvant Aluminiumhydroxid. Jedoch führte die Behandlung zur IL-10 Produktion und zur Zunahme von Gr1+/ CD11b+ Zellpopulationen, welche natürliche Surpressors darstellen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass A. viteae Tropomyosin immunmodulierende Eigenschaften aufweist und als Komponente eines zu entwickelnden Vakzins in Frage kommt. / This study describes the immunological properties of Acanthocheilonema viteae muscle-associated protein tropomyosin. A. viteae is a filarial parasite of jirds that resembles the important human parasite Onchocerca volvulus. Focus of experiments is on unraveling the functional properties of tropomyosin in the context of an infection and experimental vaccination. Additionally, allergenic potential of tropomyosin was investigated and the ability to induce high levels of specific IgE. A part of the study was also aimed at the development of anti-tropomyosin monoclonal antibodies (mAb). This study revealed that tropomyosin is a promising antigen for vaccines against filarial nematodes, however, effective only in a Th1 biased environment. Vaccination with protein or DNA resulted in 30% - 45% protection that was not associated with specific IgG or IgE. During infection tropomyosin is an allergen and leads to the production of high levels of specific IgE. Screening of synthetic peptide libraries showed 13 IgG and 11 IgE co-located epitopes and revealed cross-reactivity with other tropomyosins and sharing of IgE epitopes. mAb were raised against A. viteae tropomyosin and showed that tropomyosin is abundant on the cuticle of L3 and microfilariae of the parasite. Deglycosylation of the native protein showed that some epitopes were formed by the posttranslational modifications. Additionally, immunization shows that tropomyosin induces a similar pattern of cell activation and antibody production as aluminium hydroxide adjuvant, but leads to the induction of IL-10 and the increase of population of GR1+/CD11b+ cells. These cells are regarded as natural suppressors. Taken together, results show that A. viteae tropomyosin has immunomodulating properties and can be considered as a component of an efficient vaccine.

Da Filarieninfektionen noch immer chemotherapeutisch schwer bekämpfbar sind, ist die Aufklärung von potentiell protektiven Molekülen, die zur Impfstoffentwicklung von Nutzen sein könnten, von Bedeutung. Ein vielversprechendes Antigen stellt in diesem Zusammenhang die Chitinase von infektiösen Drittlarven von Onchocerca volvulus dar. In dieser Arbeit sollte deshalb dieses Protein immunologisch charakterisiert und immundominante Bereiche identifiziert werden. Dazu wurde die cDNA des gesamten Proteins (OvL3-Chitinase) und die cDNA der Domäne, die für die Chitin-Bindung verantwortlich ist (OvL3-CBD), in einen Expressionsvektor kloniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die aufgereinigte OvL3-Chitinase zeigte enzymatische Aktivität. Die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD wurden in Immunisierungsstudien im Tiermodel der Nagetierfilarie A. viteae und M. unguiculatus eingesetzt. Während die Immunisierung mit OvL3-CBD mit dem Adjuvans Alum zu keiner Reduzierung der Adultwurmlast führte, war nach Gabe der OvL3-Chitinase die Anzahl der Adultwürmer um 40 % bzw. um 17,7% reduziert. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase allein und in Kombination mit zwei verschiedenen Adjuvantien (STP und Alum) in Immunisierungsstudien von BALB/c-Mäusen eingesetzt, deren Immunantworten anschließend charakterisiert wurden. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, daß die Chitinase ohne zusätzliche Gabe eines Adjuvans unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Dies wurde durch die Anwesenheit von Antikörpern der Subklasse IgG1 deutlich. Außerdem waren Milzzellen dieser Mäuse nicht in der Lage, nach Restimulation mit Chitinase mit Proliferation zu reagieren. Durch den Einsatz der Adjuvantien STP und Alum konnte eine Polarisation der Immunantworten erfolgen. Während die Immunisierung mit Chitinase und Alum zur deutlichen Bildung von IgG1-Antikörpern und zu einer leichten Erhöhung der Antikörper IgG2a und IgG2b führte, konnte nach Immunisierung mit Chitinase und STP neben Antikörpern der Subklasse IgG1 deutliche erhöhte OD-Werte von IgG2a und IgG2b gemessen werden. In beiden Gruppen reagierten Milzzellen nach Restimulation mit Chitinase, wobei die Proliferationswerte der STP/Chitinase-Gruppe über denen der Alum/Chitinase-Gruppe lagen. Durch den Einsatz von Salmonellen, die Chitinase exprimierten, konnten die T-Zell-Antworten verstärkt werden. Es konnten jedoch keine antigen-spezifischen Antikörper gefunden werden. Mit Hilfe von drei verschiedenen T-Zell-Algorithmen (Algorithmus nach Rothbard und Taylor, nach Humphreys und die MHC-II-Bindungs-Motive nach Rammensee) wurden T-Zell-Epitope innerhalb der OvL3-Chitinase identifiziert. Alle vorhergesagten Epitope wurden als synthetische Peptide hergestellt und in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Hierzu wurden Milzzellen von Mäusen verwendet, die dreimal mit rekombinanter Chitinase und dem Adjuvans STP immunisiert worden waren. Um möglichst viele T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase zu ermitteln, wurden überlappende Peptide (Pepscan), die die Gesamtheit der Chitinase umfaßten, in T-Zell-Tests eingesetzt. Die verwendeten Algorithmen wurde auf ihre Sensitivität und Spezifität überprüft, indem die vorhergesagten Epitope mit den ermittelten T-Zell-Epitopen des Pepscans verglichen wurden. Dabei konnte der Algorithmus von Rammensee den besten Index an Sensitivität (0,47) und Spezifität (0,7) erzielen. Eine Kombination der Algorithmen ergab, daß die Verknüpfung des Algorithmus nach Rothbard und Taylor mit den MHC-Bindungs-Motiven nach Rammensee die Sensitivität auf 0,67 erhöhen konnte, doch die Spezifität sank durch die hohe Anzahl der vorhergesagten Epitope auf 0,33. Die Anwendung der Algorithmen auf die Sequenz der OvL3-Chitinase führte zu der Identifizierung von fünf Bereichen, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden, und von denen vier in T-Zell-Proliferationstests deutliche Proliferationswerte erzielten. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD in Kamerun hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, PBMC von Onchozerkose-Patienten zu restimulieren, die aus einem hyperendemischen Onchozerkose-Gebiet stammten. Diese Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse aus den Immunisierungsstudien mit BALB/c-Mäusen, in denen Chitinase eine TH2-Immunantwort hervorrief. Die PBMC der Onchozerkose-Patienten zeigten nur eine sehr geringe Proliferation nach Stimulation mit OvL3-Chitinase und OvL3-CBD. Begleitet wurde diese Proliferation von Ausschüttung typischer TH2-Zytokine wie IL-10 (Chitinase) bzw. IL-4, IL-5 und IL-10 (CBD). Die Untersuchung der Antikörperantworten der Onchozerkose-Patienten zeigte, daß bei 77% der untersuchten Patienten IgG4-Antikörper gegen die Chitinase und bei 20% gegen die OvL3-CBD im Serum nachgewiesen werden konnten. / Chemotherapeutic treatment of filarial infections has rendered difficult and still insufficient. Therefore, the identification of potentially protective molecules which can be used for vaccine development is desirable. The chitinase of larvae stage three of Onchocerca volvulus constitutes a promising antigen. Immunological characterization of this protein and the identification of immunodominat regions was performed in this study. The complete sequence (OvL3-chitinase) and the C-terminal end responsible for the binding of chitin (OvL3-CBD) were cloned in an expression vector, overexpressed in E. coli and subsequently purified. Recombinant chitinase was enzymatically active. The OvL3-chitinase and the OvL3-CBD were used for immunization studies using the rodent filaria A. viteae in the animal model M. unguiculatus. No decreased number of adult worms was observed after immunization with OvL3-CBD in the present of Alum as adjuvans, while chitinase together with STP resulted in the reduction the worm burden to 40 % (first trial) and to 17,7 % (second trial). Additional immunization studies using BALB/c-mice were performed with OvL3-chitinase in the absence or the presence of two different adjuvans. Spleen cells isolated from mice immunized with chitinase in the absence of adjuvans were devoid of proliferative capacity after in vitro antigenic restimulation. Antigen-specific IgG1 antibodies were the only subtype detectable in sera from mice. These results suggested that a Th2 response was induced after immunization with chitinase under these conditions. Including STP or Alum in the immunization protocol a polarization of the obtained immune response was found. Immunization with chitinase together with Alum elicited strong IgG1 response followed by slightly increase of IgG2a and IgG2b. Co-administration of chitinase and STP evoked increased IgG2a and IgG2b antibodies in addition to the observed IgG1 response. Good proliferative responses were observed for spleen cells from mice immunized with chitinase in the present of both adjuvans after in vitro restimulation with chitinase. Furthermore stronger T-cell reactivity was found in the group immunized with chitinase/STP. Also chitinase was expressed in Salmonella and oral immunization of mice with this construct enforced the T-cell reactivity, however antigen specific antibodies were undetectable. To further characterize T cell reactivity against OvL3-chitinase T cell epitopes using the Rothbard and Taylor algorithm (1988), Humphreys prediction and the MHC-II-binding motifs from Rammmensee (1995) were identified. All predicted epitopes were synthesized and tested in T-cell proliferation assays. Additional synthetic L3-chitinase-derived overlapping peptides were also used in T-cell proliferation assays. The sensitivity and specificity of the algorithms was evaluated by comparing the predicted epitopes with the epitopes determined by overlapping peptides. Using this approach, prediction based on MHC-II-binding motifs showed the highest sensitivity (0,47) and specificity (0,7). A further increase of the predictive power was obtained by a combining MHC-II-binding motifs and Rothbard and Taylor algorithm, resulting in increased sensitivity (0,67) but lower specificity (0,33). Five immunodominant regions were identified by all algorithm and four of them were confirmed as T-cell epitopes in T-cell assays. PBMCs isolated from patients affected with Onchocerca volvulus from Cameroon were also tested for their reactivity against OvL3-chitinase and the OvL3 CBD in T-cell proliferation assays. After in vitro restimulation with OvL3-chitinase and CBD only marginal T-cell response was observed accompanied by release of Th2-like cytokines such as IL-10 when stimulated with chitinase and IL-4, IL-5 and IL-10 when stimulated with CBD. Strong antibody responses of the IgG4 isotype were detected in the serum of 77% of the patients against chitinase and only in 20% of the patients against CBD.

Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht. / Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.

Parasitische Würmer gehören mit über 3,5 Milliarden Betroffenen zu den weltweit verbreitetesten Infektionskrankheiten. Der Erfolg dieser Parasiten beruht auf ihren ausgefeilten Mechanismen mit denen sie das Immunsystem ihrer Wirte manipulieren. Interessanter Weise gehen Wurminfektionen mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit an Allergien zu erkranken einher. Wie genau die Parasiten das Immunsystem manipulieren ist weitgehend unbekannt. Um diese Mechanismen besser studieren zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht RNA interference (RNAi), anhand des Modellmoleküls Tropomyosin zu etablieren. Wie sich am Beispiel des Strongyliden Heligmosomoides polygyrus bakeri zeigte, ist RNAi als Manipulationsmethode für Nematoden nicht oder nur in geringem Maße geeignet. Dies lässt sich auf das Fehlen von Aufnahme- und Verbreitungsmechanismen für Doppelstrang-RNA zurückführen. Desweiteren wurden die Auswirkungen von rekombinantem Tropomyosin der Filarie Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) auf die Entstehung allergischer Atemwegserkrankungen im Mausmodell untersucht. Eine viermalige Behandlung mit rAv-TMY in einem Zeitraum von vier Wochen führte zu verringerten entzündlichen Reaktionen in den Atemwegen. Die Analyse immunologischer Parameter ergab, dass rAv-TMY signifikant den Einstrom von Entzündungszellen in die Atemwege reduziert, allem voran den Einstrom von Eosinophilen. Dies lässt sich durch die verringerte Ausschüttung an IL-5, Eotaxin und MCP-5 zurückführen. Zudem wurde die Bildung von antigenspezifischen IgE verringert während sich die Produktion blockierender IgG1 Antikörper erhöhte. Diese Arbeit belegt somit die anti-allergischen Eigenschaften von rAv-TMY. Damit stellt rAv-TMY ein interessantes Kandidatenmolekül zur Behandlung allergischer Reaktionen dar. Desweiteren kann der Vergleich von allergenem, nicht allergenem und modulatorischem Tropomyosin wichtige Informationen über die allgemeinen Eigenschaften von Allergenen und ihrer molekularen Struktur geben. / Parasitic worms are among the world''s most prevalent infectious diseases with more than 3.5 billion. The success of these parasites is based on their sophisticated ways to manipulate the immune system of their hosts. Interestingly, worm infections abate the risk to develop allergic disorders. How exactly parasitic worms modulate the immune system is so far largely unknown. In order to be able to investigate parasite induced modulation, this work aimed to establish RNA interference (RNAi), a method of genetic manipulation, using tropomyosin as target gene. As shown for the example of Heligmosomoides polygyrus RNAi is not or only to a small extent useful as method to genetically manipulate nematodes. This can be explained with the lack of uptake and spreading mechanisms for double stranded RNA. Furthermore, this work examined the impact of the recombinant muscle protein tropomyosin of Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) on the course of a rodent model of allergic airway inflammation. A four-time treatment with rAv-TMY over a period of four weeks resulted in decreased inflammatory responses in the airways. The analysis of immunological parameters showed that rAv-TMY significantly reduces the influx of inflammatory cells into the airways, especially eosinophils. The reduced eosinophil influx can be attributed to the decreased expression of IL-5, eotaxin and MCP-5 in the airways. In addition, the formation of antigen-specific IgE was impaired whereas the production of the blocking antibody IgG1 was increased. These results demonstrate the anti-allergic properties of rAv-TMY. For this reason rAv-TMY becomes an interesting model molecule for the treatment of allergic diseases. Furthermore, the comparison of allergenic, non-allergenic and modulatory tropomyosin might put some light on the nature of allergens and their molecular patterns.