In T cells, processes such as migration and immunological synapse formation are accompanied by the dynamic reorganization of the actin cytoskeleton, which has been suggested to be mediated by regulators of RhoGTPases and by F-actin bundlers. SWAP-70 controls F-actin dynamics in various immune cells, but its role in T cell development and function has remained incompletely understood. CD4+ regulatory T (Treg) cells expressing the transcription factor Foxp3 employ diverse mechanisms to suppress innate and adaptive immunity, which is critical for maintaining immune homeostasis and self-tolerance. Here, we propose Swap-70 as a novel member of the Foxp3-dependent canonical Treg cell signature. We show that Swap-70-/- mice have increased numbers of Foxp3+ Treg cells with an effector/memory-like phenotype that exhibit impaired suppressor function in vitro, but maintain overall immune homeostasis in vivo. Upon formation of an immunological synapse with antigen presenting cells in vitro, cytosolic SWAP-70 protein is selectively recruited to the interface in Treg cells. In this context, Swap-70-/- Treg cells fail to downregulate CD80/CD86 on osteoclast precursor cells by trans-endocytosis and to efficiently suppress osteoclastogenesis and osteoclast function. These data provide first evidence for a crucial role of SWAP-70 in Treg cell biology and further highlight the important non-immune function of Foxp3+ Treg cells in bone homeostasis mediated through direct SWAP-70-dependent mechanisms.

Der adoptive Transfer von T-Zell-Rezeptor (TZR) modifizierten T-Zellen gegen krebsspezifische Antigene ist ein vielversprechender Ansatz in der Immuntherapie. Geeignete Zielmoleküle für diese Therapie sollten wichtig für das Überleben von Krebszellen sein und zudem in ausreichenden Mengen auf der Zelloberfläche exprimiert werden, um von T-Zellen erkannt zu werden. Die Identifizierung dieser Zielmoleküle ist jedoch eine Herausforderung und erfordert eine intensive Charakterisierung, um eine ausreichende Prozessierung und Präsentation auf den Tumorzellen zu validieren. Ziel dieser Arbeit war, HLA-A2-spezifische Neoepitope als Zielmoleküle für adoptive T-Zell-Therapie zu validieren. Dafür wurden erfolgreich Immunantworten in einem humanen transgenen Mausmodell nach Peptidimmunisierung induziert und TZRs mit hoher Affinität isoliert. Trotz einer hohen funktionellen Avidität von H3.3K27M-spezifischen T-Zellen wurde keine Erkennung von Tumorzellen erreicht. Zweitens wurden TZR-transduzierte T-Zellen gegen die häufige Melanommutation Rac1P29S isoliert, welche zytotoxisch gegen Melanomzelllinien waren. Letztlich wurde beobachtetet, dass TZRs mit hoher Affinität gegen gespleißte Kras und Rac2 Epitope, welche durch Proteasom-katalysiertes Peptidspleißen erzeugt wurden, keine Immunantwort gegen endogen exprimierte Mutationen hervorrufen konnten. Daraus lässt sich schließen, dass gespleißte Epitope wahrscheinlich seltener vorkommen als zuvor angenommen und daher möglicherweise irrelevant für die adoptive T-Zelltherapie sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Auswahl von Zielmolekülen für die adoptive T-Zell-Therapie mit Hilfe reverser Immunologie auf der Grundlage von Bindungsalgorithmen und der Häufigkeit von Mutationen allein nicht ausreicht. Daher sind vor der Isolierung und Charakterisierung von TZRs zusätzliche Strategien wie z.B. die Analyse des MHC-Immunopeptidoms erforderlich, um die Auswahl geeigneter Zielmoleküle für die T-Zelltherapie zu verbessern. / Adoptive transfer of T cell receptor (TCR)-engineered T cells against tumour-specific neoantigens is a promising approach in cancer immunotherapy. Ideally, targeted antigens are crucial for cancer cell survival and are generated in sufficient amounts to be recognised by T cells. However, the identification of ideal targets remains challenging and requires intensive characterisation to validate sufficient antigen processing and presentation by the tumour cells. This thesis focused on the validation of HLA-A2 binding neoepitopes carrying the recurrent cancer mutations H3.3K27M, Rac1P29S, Rac2P29L or KrasG12V as targets for adoptive T cell therapy. After peptide immunisation, immune responses in a human transgenic mouse model were elicited and high-affinity TCRs successfully isolated. Although H3.3K27M-specific T cells showed high functional avidity, no recognition of cells endogenously expressing mutant H3.3 was achieved. Furthermore, a mechanism to target the common melanoma mutation Rac1P29S with a TCR raised against a heterologous mutation with higher peptide-MHC affinity was described. TCR-transduced T cells induced cytotoxicity against Rac1P29S expressing melanoma cell lines. Lastly, high-affinity TCRs specific for mutant Kras and Rac2 spliced epitopes generated by proteasome-catalysed peptide splicing were successfully isolated, however, TCR-transduced T cells did not induce an immune response against endogenously expressed mutant transgenes. The results indicate that spliced epitopes are probably less abundant than previously estimated and therefore may play a minor role in the generation of targets for adoptive T cell therapy. These data suggest that target selection using a reverse immunology approach based on binding algorithms and frequency of mutations alone is not sufficient. Thus, additional strategies to improve the selection of suitable targets such as the analysis of the MHC immunopeptidome are required prior to TCR isolation and characterisation.

CD8+ T Zellen unterstützen die Beseitigung von Pathogenen und sind somit entscheidend bei der Bekämpfung von Infektionen. Neben der Antigendosis und dem inflammatorischen Zytokinemilieu hat auch die Stimulation durch den TZR einen entscheidenden Einfluss auf die CD8+ T Zellantwort. Das transkriptionelle Programm, die finale Größe und Dauer der klonalen Expansion und der Start der Kontraktionsphase werden durch die TZR-Signalstärke bestimmt. Schwache TZR-Stimulation führt zu einer verminderten Expansion und vermittelt eine frühzeitige Kontraktionsphase, die eine Entwicklung von Gedächtniszellen auf den Kosten der Effektorzellen favorisiert. IRF4 wird nach TZR-Ligand-Interaktion in CD8+ T-Zellen hoch reguliert. Seine Expressionskinetik ist stark von der TZR-Signalstärke der Aktivierung abhängig, übersetzt diese und sorgt für die Umsetzung in ein entsprechendes transkriptionelles und differentielles Programm. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die IRF4-Defizienz in CD8+ T-Zellen zu einem verfrühten Abbruch der Expansion und zu einem vorzeitigen Beginn der Kontraktion führt, die durch den FAS-vermittelten Tod-induzierenden Signalweg initiiert wird. Außerdem präsentieren IRF4-defiziente CD8+ T-Zellen vermehrt Phosphatidylserine an ihrer Oberfläche und Komplementdeposition, beides begünstigt die Erkennung und Aufnahme durch Phagozyten. Diese Ergebnisse weisen zudem stark darauf hin, dass durch die fehlende Expression von IRF4 in CD8+ T Zellen, ein schwaches TZR-Signal übermittelt wird, unabhängig von der tatsächlichen Stärke und Dauer des aktivierenden Signals, dass zu einer Verkürzung der Expansionsphase führt und eine verfrühte Kontraktionsphase der Effektorzellen auslöst. Diese Arbeit erweitert schon bekanntes Wissen um IRF4 als Schlüsselregulator für die Differenzierung und Funktionalität der ag-spezifischen CD8+ T-Zellen, da es den Beginn der Kontraktionsphase diktiert mittels Aktivierung von verschiedenen Apoptose- und Phagocytose Signalwegen. / CD8+ T cells promote pathogen clearance and play a crucial role in controlling infections. Besides antigen dose and inflammatory cytokine milieu, the TCR stimulation contributes to the programming of the CD8+ T cell response. A distinct developmental program, the final magnitude and duration of clonal expansion, as well as the timing of the onset of T cell contraction, are determined by the TCR signaling strength. Weak TCR stimulation results in a diminished magnitude of expansion and accelerates the onset of contraction, as it favors the development of memory cells at the expense of effector cells. IRF4 is a transcription factor, that is upregulated in CD8+ T cells following TCR stimulation. Furthermore, its expression kinetic is highly dependent on the TCR signaling strength, which initiated activation. Therefore, it translates the strength of the activating signal and transmits it into a proper transcriptional and developmental program. This study provides unique evidence that the absence of IRF4 expression in CD8+ T cells leads to a hasted termination of clonal expansion and a premature contraction, initiated by the FAS-mediated cell death pathway. Moreover, IRF4-deficient CD8+ T cells exposed phosphatidylserine on their cell surface and showed complement deposition, both facilitating their recognition and uptake by phagocytes. The findings of this study additionally strongly indicate that IRF4 deficiency mimics weak TCR engagement and in turn transmits every TCR signal, independent of its actually affinity and duration, into a developmental program, that give rise to an early memory formation and results in a premature onset of effector CD8+ T cell contraction. This data extend previous knowledge of IRF4 being essential for the differentiation and functionality of ag-specific effector CD8+ T cells, as it furthermore dictates the onset of CD8+ T cell contraction via the activation of several death and phagocytosis inducing pathways.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.

Der (Pro)Renin Rezeptor (PRR) ist ein hoch konservierter Transmembranrezeptor, der ursprünglich beschrieben wurde Renin und Prorenin zu binden. Durch Bindung an Renin und Prorenin beeinflusst der PRR das Renin-Angiotensin-Systems und induziert eine MAP-Kinase-Signaltransduktion. Teile des PRR sind assoziiert mit der vakuolären H+-ATPase (vATPase), welche wichtig für die Azidifizierung zellulärer Organellen ist. Kürzlich wurde eine neue Funktion des PRR für den WNT/β-catenin Signalweg beschrieben. Hier dient der PRR als Verbindungsglied zwischen den WNT Rezeptoren und der vATPase. Die Mechanismen der Funktionen des PRR sind noch nicht verstanden, aber es wird angenommen, dass der PRR in die Regulation verschiedenster zellulärer Mechanismen involviert ist. Es gibt bis jetzt keine biochemische und strukturelle Charakterisierung des PRR. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Studien mit verschiedenen Konstrukten des extrazellulären Teils des PRR durchgeführt. Alle PRR Konstrukte (hsPRR (170-303), hsPRR (101-257) und hsPRR (166-257)) zeigten eine alpha-helikale Faltung und konnten nicht an Renin oder Prorenin binden. Der hsPRR (101-257) liegt in einem Konzentrations- und pH-abhängigen Monomer-/Oligomerequilibrium vor, während der hsPRR (166-257) als Monomer/Dimerequilibrium vorkommt. Diese Daten bilden die Grundlage für weitere strukturelle und funktionelle Untersuchungen. Konditionelle KO Mäuse sind eine exzellente Methode, um die physiologische Rolle des PRR in vivo zu untersuchen. Eines der wichtigsten Proteine des Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweges, β-catenin, ist fundamental für die T-Zell Entwicklung. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die Deletion des PRR in T-Zellen ebenfalls zu einem Verlust von T-Zellen und zu einer Entwicklungsstörung führt. Die Ergebnisse zeigen, dass der PRR wichtig für eine vollständige T-Zellentwicklung ist und unterstützen die Hypothese, dass der PRR eine Rolle für Wnt/β-catenin Singaltransduktion in T-Zellen spielt. / The (pro)renin receptor (PRR) is an evolutionary conserved transmembrane receptor that was first discovered to bind renin and prorenin. Upon binding, PRR was shown to influence the activity of the renin-angiotensin-system (RAS) and to induce MAP kinase signalling. It was previously shown that a truncated, transmembrane part of PRR was associated to vacuolar H+-ATPase (vATPase), a proton pump which is important for acidification. Recently, a new function of PRR in the WNT/β-catenin signalling pathway was described. Here, the PRR was shown to be an adaptor between WNT receptors and the vATPase. The precise mechanisms by which PRR functions, are still elucidative but the PRR is supposed to regulate various cellular processes. Currently, no biochemical characterization or structural analysis is available for PRR. In order to gain understanding of the function of the PRR, structural studies were performed with several truncated proteins of the extracellular part of the PRR. All PRR proteins (hsPRR170-303, hsPRR 101-257 or hsPRR 166-257) showed an overall alpha helical folding and did not bind renin or prorenin. The oligomeric assembly of the proteins was investigated. The hsPRR (101-257) was shown to be in a concentration and pH dependent monomer/oligomer equilibrium, whereas hsPRR (166-257) is only present in a monomer/dimer equililibrium. These data are the basics for further structural and functional studies. Additionally, conditional KO animals are an excellent tool to investigate the physiological role of the PRR in vivo. As the major mediator of the Wnt/β-catenin signaling pathway, β-catenin, is crucial for T cell maturation, a conditionel deletion of PRR in T cells was analyzed. PRR deletion resulted in a loss of mature T cells. Moreover, a defect in T cell maturation in the thymus was determined. Our data showed that PRR is critical for proper T cell development and support the hypothesis that PRR contributes to Wnt/β-catenin signaling in T cells.

Regulatorische T-Zellen (Treg) eröffnen neue immuntherapeutische Wege zur Kontrolle unerwünschter Immunreaktionen, jedoch wirft die Heterogenität dieser Zellen die Frage auf, welche Treg-Population für die klinische Anwendung. Darauf basierend werden in dieser Arbeit drei Fragestellungen bearbeitet: i) Bestimmung der Häufigkeit von Tregs und deren Subpopulationen in verschiedenen Altersgruppen bei Empfängern einer Organtransplantation (Tx) und einer gesunden Kontrollgruppe; ii) Vergleich der Suppressorkapazität verschiedener Treg-Populationen und in vitro-Expansion der Zellen unter Erhaltung ihrer Funktionalität; iii) Klärung der Differenzierungsmerkmale von Tregs und deren Verknüpfung mit konventionellen T-Zellen (Tconv) mittels Analyse des T-Zell-Rezeptor- (TCR) Repertoires. Sowohl bei gesunden Probanden als auch bei Tx-Empfänger konnte eine altersabhängige Verschiebung von naiven (TregN) hin zu dominant zentralen Gedächtnis-Zellen (TregCM) beobachtet werden, Treg von Tx-Empfängern hatten mehr Effektor-Memory-Zellen (EM) und sie waren mehr aktiviert. In Bezug auf die Kontrolle der frühen Tconv zeigen TregCM eine erhöhte Suppressorkapazität im Vergleich zu TregN. Außerdem sind im Gegensatz zu TregN nur TregCM dazu in der Lage, Apoptose bei Responderzellen zu induzieren. Der Grund hierfür könnte in der stärkeren Expression von CTLA-4 auf TregM liegen. Die Expansionskultur führte zur phänotypischen Veränderung der TregN, deren Umwandlung in TregCM mit einer verbesserten Suppressoraktivität verbunden ist. Die Daten legen nahe, dass das Expandieren mit gesamt Treg für die Adoptive-Treg-Therapie optimal sind, da sie der größte Anteil von ihnen die hochpotenten TregCM sind. TCR-Studien mittels Next Generation Sequencing zeigen weiter, dass TregM aus TregN entstehen, anstatt aus Tconv, in einem Antigen-gesteuerten Prozess. Diese Daten belegen erstmalig neue Erkenntnisse hinsichtlich der Unterschiede der TCR-Repertoires von TregM und Tconv beim Menschen. / Regulatory T cells (Treg) offer new immunotherapeutic options to control undesired immune reactions, but the heterogeinetiy of Treg raises the question which Treg population should be used for clinical translation Thus, this project involves three main parts: i) investigating Treg frequency and subsets distribution with age in healthy donors and transplant (Tx) patients; ii) comparing the suppressive capacity of Treg subsets and expanding them in vitro without losing functionality; iii) clarifyjing the differiation relationship of Treg subsets and their relation to conventional T cells (Tconv) by T cell receptor (TCR) repertoire analysis. From both healthy donors and Tx patients, an age-dependent shift from naïve Treg (TregN) to the dominant central-memory Treg (TregCM) was observed,; However,Treg in Tx patients contained more effector-memory EM cells, , and they were pre-activated due to the exposure to allo antigens,. Regarding control of early Tconv activation, TregCM showed enhanced suppressive capacity compared to TregN; furthermore, only TregCM could induce apoptosis of responder cells while TregN could not, which may result from thehigherexpression of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) on TregM. Following in vitro expansion of the Treg subsets, however, TregN converted mainly into TregCM phenotype with enhanced suppression activity. The poor proliferation capacity of TregEM might indicate EM as the terminal differential stage. These data suggest that expansion with total Treg is optimal for adoptive Treg therapy as the majority of them are the highly potent TregCM. Lastly, TCR repertoire study by next generation sequencing (NGS) indicate that TregM derived from TregN rather than Tconv in an antigen-driven process. The highest similarity of the TCR repertoires was observed between TregCM and TregEM. These data reveal new insights for the first time into the distinct TCR repertoires of Treg subsets and Tconv in human by NGS technology.

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Tumor-assozierten T-Zellepitopen (TATE) in kutanen T-Zelllymphomen (CTCL) und die Charakterisierung der Tumour-spezifischen zytotoxischen Immunabwehr. Zwei Tumor-spezifische T-Zellklone wurden aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) eines CTCL-Patienten etabliert. Die potentiellen natürlichen T-Zellepitope und Mimotope (synthetische Epitope ohne natürliche Korrelate aber mit meist hohen T-Zellaktivitäten) für diese Klone wurden mit einer kombinatorischen Peptidbibliothek identifiziert. Die Qualität und Quantität der T-Zellaktivitäten waren bei den jeweiligen Peptiden unterschiedlich. Die funktionellen Aviditäten varierten dabei um 3 Größenordnungen. Bei den einzelnen Peptiden korrelierte die Zytolyse und Zytokinsekretion nicht immer. Mit einigen Mimotopen wurden CTCL-Patienten für therapeutische Zwecke vakziniert. Die Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen erhöhten sich während der ersten Vakzinationszyklen und tumorizide Aktivitäten konnten nachgewiesen werden. Diese ersten klinischen Anwendungen der Mimotope zeigen die Möglichkeit solcher Mimotope die sonst unzureichende Immunabwehr zu modulieren. Die Identifizierung neuer TATE ermöglichte die weitere Untersuchung der Tumor-spezifischen T-Zellen in der Peripherie und im Tumor des Patienten. Diese Analysen zeigten, dass diese Zellen im peripheren Blut aktiv aber im Tumor inaktiv waren. Die TILs waren vom effektor-memory Phänotyp expremierten aber nur schwach oder z. T. keine der Moleküle mit Effektorfunktion. Das immunsuppressive Zytokin TGF-beta könnte eine wichtige Rolle bei dieser unzureichenden Immunabwehr bei CTCL spielen. / The major goals of this work was the identification of tumour-associated T cell epitopes (TATE) in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) and the characterisation of the tumour-specific cytolytic immune response. Two tumour-specific cytolytic T cell clones were established from the tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) of one CTCL-patient. The potential natural T cell epitopes and mimotopes (epitopes without natural correlates but with more T cell stimulating capacity) for these T cell clones were identified using a combinatorial peptide library. The quantity and quality of the T cell response was different. The functional avidity of the peptides differed more than 3 orders of magnitude. The cytolysis and cytokine release did not correlate for each peptide. Some of the mimotopes were injected into CTCL-patients for therapeutic purpose. The frequency of the mimotope-specific T cell increased during the first vaccination cycles and a tumouricidal capacity could be observed. This first clinical application of the mimotopes showed the capacity of the mimotopes for the modulation of weak anti-tumour immune response. The identification of the new TATE allowed further characterisation of the tumour-specific T cells in the periphery and in the tumour of the patient. High frequency of the tumour-specific T cells could be detected in the tumour but they failed to show effector functions in comparison to the tumour-specific T cells in the peripheral blood. The tumour-specific T cells had the effector memory phenotype but expressed none or less amount of the cytolytic effector molecules. The reason for the suboptimal anti-tumour response in CTCL could be the immunesuppressive cytokine TGF-beta.

Das Schicksal aktivierter T-Zellen wird durch eine Vielzahl NF-kappaB regulierter Ziel-Gene bestimmt, wobei aktivierende und deaktivierende Signale für die Ausbalancierung einer adäquaten T-Zell Antwort benötigt werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die negativ-regulatorische Modulierung des Carma1-Bcl10-Malt1 (CBM)-Proteinkomplexes für die Steuerung der NF-kappaB Aktivität in T-Zellen von großer Bedeutung ist. Überraschenderweise ist die Bildung des CBM-Komplexes abhängig von IKKbeta, einer Kinase, die zuvor ausschließlich mit CBM-nachgelagerten Effektorfunktionen in Verbindung gebracht wurde. IKKbeta übernimmt eine duale Funktion bei der Regulation des CBM-Komplexes: Obwohl IKKbeta zunächst für die Bildung des CBM-Komplexes benötigt wird, führt die Phosphorylierung der CBM-Komplexkomponente Bcl10 durch IKKbeta bereits kurze Zeit nach Beginn der T-Zell Aktivierung zu einer Dämpfung der Signalübertragung. Biochemische Analysen zeigen, dass die Phosphorylierung von Bcl10 die Proteinaffinitäten innerhalb des CBM-Komplexes beeinflusst, wodurch es zu einer Umlagerung des Komplexes mit negativ-regulatorischem Effekt kommt. Weiterführende Experimente haben aufgedeckt, dass Bcl10 im Zuge anhaltender T-Zell Stimulation lysosomal degradiert wird. Die Degradation von Bcl10 führt zum Zerfall des CBM-Komplexes und unterbindet die weitere Signalübertragung trotz persistenter Stimulation. Die Tatsache, dass beide in dieser Arbeit identifizierten negativ-regulatorischen Mechanismen am CBM-Komplex angreifen, unterstreicht die Bedeutung dieses Komplexes für die Signalübertragung in T-Zellen. Weiterhin besteht aufgrund der präsentierten Daten Anlass zur Annahme, dass in aktivierten T-Zellen ein vielfältig positiv und negativ regulierter Multikomponentenkomplex gebildet wird, der eine nicht-hierarchische Signalübertragung unterstützt. / A multitude of NF-kappaB regulated target genes determines the fate of activated T cells, whereas activating and de-activating signals are crucial for balancing adequate T cell responses. The presented data illustrate that negative-regulatory modulation of the Carma1-Bcl10-Malt1 (CBM)-complex is of great importance for the control of NF-kappaB activity in T cells. Surprisingly IKKbeta, a kinase that so far was thought to be involved in CBM-downstream effector functions, is needed for CBM-complex formation. IKKbeta exhibits a dual function regulating the CBM-complex: while initially being essential for the formation of the CBM-complex, phosphorylation of the CBM-complex component Bcl10 by IKKbeta shortly after the onset of T cell activation leads to a damping of signal transduction. Biochemical analysis reveal that Bcl10 phosphorylation influences the intermolecular protein affinities of the CBM-complex components causing a remodeling of the complex with a negative-regulatory effect. Further experiments uncover that upon persistent T cell activation Bcl10 is degraded by the lysosome. Bcl10 degradation promotes the collapse of the CBM-complex and thereby interferes with ongoing signal transduction despite persistent stimulation. Considering the fact that both negative-regulatory processes affect CBM-complex activity underscores the important role of this complex in T cell signal transduction. Moreover, the presented data demonstrate that formation of a multi-component signaling complex in activated T cells facilitates versatile positive, negative and non-hierarchical regulation.

Das Zytokin Interleukin-7 (IL-7) ist für die Entstehung und das Überleben reifer T Zellen von zentraler Bedeutung. Die Gabe von IL-7 führt sowohl in der Maus als auch im Menschen zu erhöhten T Zellzahlen und einem veränderten T Zellphänotyp. Folglich könnte sich die therapeutische Gabe von IL-7 bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem positiv auswirken. Diese Hypothese wird derzeit in mehreren klinischen Studien untersucht. Bisher wurde allerdings nur die Wirkung von IL-7 auf T-Zellen studiert. Zu dessen Wirkung auf andere Immun- oder Stromazellen sowie deren IL-7-abhängigen Beitrag zur Regulation der T-Zellhomöostase ist nur wenig bekannt. Daher war es Ziel der Arbeit, den Einfluss einer therapeutischen Gabe von IL-7 auf adoptiv-transferierte T-Zellen in IL-7-Rezeptor (IL-7R)-kompetenten und defizienten lymphopenischen Mäusen zu studieren. Die Untersuchungen bestätigen, dass die Gabe von IL-7 T-Zellantworten unterstützt, zeigen jedoch auch, daß viele dieser Effekte von IL-7R-exprimierenden Wirtszellen abhängig sind. Dies weist darauf hin, dass IL-7R-vermittelte Signale in Wirtszellen indirekt T-Zellantworten beeinflussen. Zudem zeigte sich, dass effiziente anti-Tumor-T Zellantworten von IL 7R-vermittelten Signalen in Wirtszellen abhängen. Vor allem nicht-hämatopoetische Wirtszellen fungieren hier als Regulatoren der IL-7-Therapie-vermittelten T Zelldifferenzierung. Unsere Ergebnisse bestätigen außerdem, dass Stromazellen in verschiedenen Organen il-7 exprimieren und zeigen darüber hinaus, dass diese Zellen durch die Gabe von IL-7 beeinflusst werden. Wir folgern daraus, dass die Effekte der IL-7-Therapie auf T Zellhomöostase teilweise indirekt über il-7-exprimierende Stromazellen vermittelt werden. Um diese Zellen genauer identifizieren und untersuchen zu können, haben wir ein neues transgenes Mausmodell charakterisiert, was es erleichtern wird, die beteiligten molekularen Signalwege zu analysieren und den Erfolg der adoptiven T Zelltherapie zu verbessern. / Interleukin-7 (IL-7) is an essential cytokine required for the development and maintenance of mature T cell. Its availability is limited under normal conditions, but rises during lymphopenia, leading to increased T cell proliferation. The administration of recombinant IL-7 to normal or lymphopenic mice and humans results in increased T cell numbers and altered T cell phenotype. Hence, IL-7 administration could mediate therapeutic benefits in immunocompromised patients and is currently tested in several clinical trials. However, besides its well-studied effects on T cells little is known about the effect of IL-7 on other immune and non-immune cells and their influence on T cell homeostasis. Therefore, we evaluated the effect of IL-7 therapy on adoptively transferred T cells in IL-7 receptor (IL-7R)-competent and IL-7R-deficient lymphopenic mice. We confirm the benefits of IL-7 therapy on T cell responses but additionally show that many of these effects are dependent on IL-7R expression by host cells, indicating that IL-7R signaling in host cells modulates T cell responses. We show that efficient T cell responses against cancer are dependent on host IL-7R signaling. Based on studies in bone-marrow chimeric mice, we identify non-hematopoietic host cells as main regulators of IL-7 therapy-modulated T cell differentiation. We conclude from these data that IL-7 therapy affects non-hematopoietic stromal cells that modulate the success of adoptive T cell therapy. Our results confirm that stromal cells in various organs express il-7 and show that these cells are targeted by IL-7 therapy in vivo. Hence, we propose that il-7-expressing cells regulate IL-7 therapy-modulated T cell homeostasis. To identify and study these il-7 expressing stromal cells in more detail, we characterized a new transgenic mouse model that will facilitate determining the molecular pathways to improve the success of adoptive T cell therapy.

Ziel der hier vorgelegten Untersuchung war es, die Bedeutung von S. aureus-Exotoxinen/Superantigenen als Pathogenitätsfaktor bei der AD zu analysieren, da kausalpathogenetisch ausgerichtete Experimentalansätze sowie systematische klinische Untersuchungen zu dieser Thematik bei Patienten mit AD ausstanden. In einer Querschnittsstudie war eine Assoziation zwischen dem Grad der S. aureus-Besiedlung und dem Schweregrad der AD nachzuweisen. Von 74 Kindern mit AD waren 60 (81%) mit S. aureus kolonisiert. S. aureus Exotoxin-sezernie-rende Stämme wurden bei 40 Patienten (53%) von der Haut isoliert. Am häufigsten wurden SEA- und SEC-sezernierende Stämme nachgewiesen, gefolgt von SEB, TSST-1 und SED. Der ausgeprägteste Schweregrad der AD wurde in der mit Exotoxin-sezernierenden S. aureus-kolonisierten Gruppe beobachtet. Für die Schwere der Erkrankung, gemessen am SCORAD-Score wurde eine Varianzaufklärung von 30% für die Exotoxine und 50% für die S. aureus-Infektion errechnet. In einer Subgruppe von Patienten wurde der Einfluß von S. aureus-Exotoxinen auf intradermale T-Zell-Rezeptor-Vß-Repertoir-Veränderungen untersucht. Bei den Patienten mit chronischer AD, die mit SEB-sezernierendem S. aureus besiedelt waren, war mittels immunhistologischer Untersuchung in der Haut nachzuweisen, dass zwischen 25% und 65% der intradermalen T-Zellen das zugehörige Superantigen-reaktive Vß-T-Zell-Repertoire gegenüber 5% bis 17% der T-Zellen im Blut exprimieren. Weder in der Haut noch im Blut war eine Akkumulation nicht-superantigenreaktiver T-Zell-Subpopulationen nachzuweisen. Auch fand sich keine selektive Akkumulation von Vß-T-Zell-Subpopulationen bei Kindern mit S. aureus-Kolonisierung ohne Exotoxinnachweis. Die Ergebnisse belegen, dass bei Kindern mit AD und positivem S. aureus-Exotoxinnachweis auf ekzematöser Haut ein Grossteil der dermal akkumulierten T-Zellen auf diese S. aureus-Exotoxine/Superantigene reagieren können und wesentlich an der Pathogenese der AD beteiligt sind. In einer Teilpopulation bei 58 Kindern mit AD wurden Prävalenz und Rolle von Serum-IgE-Antikörpern gegen die S. aureus-Exotoxine SEA und SEB untersucht. Bei 34% der Kinder mit AD (20/58) konnten wir spezifische IgE-Antikörper gegen SEA und/oder SEB nachweisen (45% zu SEB, 10% zu SEA und 45% zu SEA und SEB). Alle gegen SEA und SEB sensibilisierten Kindern waren mit S. aureus kolonisiert gegenüber 71% (27/38) der nicht-sensibilisierten Kinder. Der Grad der S. aureus-Besiedlung, die Prävalenz von SEB-sezernierendem S. aureus auf der Haut, sowie die Prävalenz von S. aureus-Hautinfektionen war in der sensibilisierten Gruppe höher. Die höchste Varianzaufklärung von 37% wurde zwischen dem Vorliegen von S. aureus-Hautinfektionen und dem Nachweis spezifischer SEA/SEB-IgE-Antikörper ermittelt; diese stellen somit einen Risikofaktor für eine Sensibilisierung gegen S. aureus-Exotoxine dar. Die SEA/SEB-sensibilisierte Gruppe zeigte einen höheren Schweregrad der AD, höhere Serum-Gesamt-Spiegel und eine polyvalente Sensibilisierung gegen Inhalations- und Nahrungsmittelallergene. Insgesamt belegen unsere klinischen, immunologischen und statistischen Ergebnisse, dass die S. aureus-Exotoxine einen wesentlichen Einfluss auf die Immunpathogenese der AD haben. Eine orale Therapie mit CyA kann bei S. aureus-kolonisierten Kindern die S. aureus-Besiedlungsdichte reduzieren. In der S. aureus-infizierten Gruppe war die Prävalenz von Exotoxin-produzierendem S. aureus und die Krankheitsaktivität höher, wobei eine Verminderung der Besiedlung nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben den Schluss, dass S. aureus-Exotoxine als Triggerfaktor die Exazerbation der AD im Kindesalter wesentlich unterstützen. Deswegen sollte in ein therapeutisches Konzept eine konsequente Prävention bzw. eine Behandlung von S. aureus-Infektionen einbezogen werden. Kinder mit bereits schwerer AD profitieren von einer immunmodulatorischen Therapie. / Background: The skin of patients suffering from atopic dermatitis (AD) exhibits a striking susceptibility to colonization with S. aureus. Some strains of S. aureus secrete exotoxins with T cell superantigen activity (toxigenic strains) and abnormal T cell functions are known to play a critical role in AD. Objective: The aim of this study was to determine the impact of exotoxin production by skin-colonizing S. aureus on disease severity and the presence of T-cell subsets in lesional skin. Furthermore, we investigated the effect of oral cyclosporin A in severe pediatric atopic dermatitis on disease severity and S. aureus colonization density. Methods: In a cross sectional study of 74 children with atopic dermatitis, the presence and density of toxigenic and non-toxigenic strains of S. aureus was correlated with disease severity. In a subgroup of patients the T cell receptor (TCR) Vß repertoire of peripheral blood and lesional T cells was investigated and correlated with individual superantigen activity of skin colonizing S. aureus. Furthermore, in a subgroup of patients, the presence of IgE antibodies to SEA and SEB was correlated with severity of the disease and the total and other unrelated allergen-specific IgE titers and density of colonization with S. aureus strains on atopic skin and episodes of superficial S. aureus skin infections. Eleven children with severe AD (SCORAD score > 50) were treated for eight weeks with 2.5 to 5 mg/kg CyA. In five children the skin was only colonized with S. aureus whereas the remaining six patients had clinically relevant skin infections with requirement for systemic antibiotic therapy. The isolates from the latter patients were sensitive for the selected antibiotics. Clinical and microbiological investigations were performed before and after CyA therapy. Results: 53% of children with AD were colonized with toxigenic strains of S. aureus producing SEC, SEA, TSST-1, SEB and SED in decreasing frequency. Children colonized with toxigenic S. aureus strains presented with higher disease severity as compared to the non-toxigenic and S. aureus negative groups. The influence of exotoxin production on the SCORAD score was determined as R2 = 0.3 (ie, 30% of the SCORAD score is explained by exotoxin production), whereas infection with S. aureus revealed R2 = 0.5. Patients colonized with toxigenic S. aureus exhibited shifts in the intradermal TCR Vß repertoire which correspond to the respective superantigen-responsive T cell subsets. In a subgroup of patients, twenty of 58 children (34%) were sensitized to superantigens (45% to SEB, 10% to SEA, 45% to SEA and SEB). In this group, severity of AD and levels of specific IgE to food and air allergens were higher. The degree of disease severity correlated to a higher extent with the presence of SEA/SEB-specific antibodies than with total serum IgE levels. Density of colonization with superantigen-secreting S. aureus strains was higher in the superantigen IgE-positive group. Sixty-three of these children experienced repeated episodes of superficial S aureus skin infections. The influence of S. aureus skin infection on the presence of SEA/SEB-specific antibodies was determined as R2 = 0.37 (ie, 37% of the the presence of SEA/SEB-specific antibodies is explained by S. aureus superficial skin infection). In the group of patients, who were treated with CyA, clinical signs and symptoms of AD improved in all patients (mean SCORAD score reduction from 74 to 29). However, disease severity was more supressed by CyA in the "colonized" patients compared with the patients with clinical S. aureus infections. Furthermore, there was a significant decrease in S. aureus density on atopic skin after CyA treatment in "colonized" patients but not in "infected" patients. The prevalence of exotoxin producing strains was higher in the "infected" group. Conclusion: The data demonstrate that S. aureus released exotoxins can modulate disease severity and dermal T cell infiltration. Patients, suffering from AD may take profit from both consequent prevention or treatment of S. aureus skin infection as well as immunmodulating approaches.