Zusammenfassung: Unsere Arbeit bestätigt die aus kleineren Studien bekannte hohe Expression der Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 in der normalen Nebenniere und in der Mehrheit der Nebennierenkarzinome. Das auf mRNA Ebene bestätigte Vorkommen beider Chemokinrezeptoren im gesunden Nebennierengewebe deutet auf eine überwiegend für die normale Nebennierenphysiologie wichtige Rolle dieser Chemokinrezeptoren hin. Eine eventuell dennoch bestehende pathophysiologische Relevanz der Rezeptoren wurde ergänzend überprüft und ergab keinen signifikanten Einfluss auf die Prognose des Nebennierenkarzinoms. / Summary: Our study describes the expression profile and prognostic relevance of the chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 in 187 clinically annotated adrenocortical carcinoma specimens. The main findings of our analysis are a strong expression of both chemokine receptors in the majority of primary tumors and metastases. In contrast to other malignancies we did not observe a relevant prognostic impact of CXCR4 and CXCR7 expression. We assume that this observation may be associated with the high constitutive expression of both receptors also in the normal adrenal cortex and their putative role in adrenal homeostasis.

Bei der Kreuzpräsentation durch dendritische Zellen (DC) werden extrazelluläre Antigene in den MHC I-Präsentationsweg eingeschleust und CD8+ T-Zellen präsentiert. Bisher werden die kreuzpräsentierenden DC der Maus durch die Expression der Moleküle CD8 in der Milz und CD103 in der Peripherie abgegrenzt; der kreuzpräsentierende Subtyp primärer humaner DC war vor Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Innerhalb dieser Arbeit konnte erstmals eine durchflusszytometrische Färbung von XCR1 auf der Oberfläche von Zellen etabliert werden, wodurch demonstriert wurde, dass XCR1 auf 83 % der CD8+ und 4 % der CD8-CD4- DC der Milz exprimiert wird. Der Phänotyp der XCR1+ DC der Milz unterschied sich deutlich von dem der XCR1- DC. In Milzen von Batf3- und Irf 8-defizienten Mäusen konnten keine XCR1+ DC detektiert werden. Zudem wurde nach Applikation des Wachstumsfaktors Flt3 Ligand in C57BL/6 Mäusen der Anteil der XCR1+ DC signifikant erhöht. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Entwicklung der XCR1+ DC von diesen Faktoren abhängig ist. Funktionell waren die XCR1+ DC wesentlich effektiver in der Kreuzpräsentation von löslichen und zellassoziierten Antigenen. Damit kann XCR1 als Oberflächenmarker verwendet werden, um murine kreuzpräsentierende DC zu kennzeichnen. Um herauszufinden, ob XCR1+ DC auch im Menschen existieren, wurde die Expression von XCR1 auf Zellen des humanen peripheren Blutes anhand von qPCR und Durchflusszytometrie untersucht. Ausschließlich CD141+ DC exprimierten XCR1-mRNA und -Protein. Durch die Etablierung einer effektiven Sortierungsstrategie zur Isolierung aller DC-Subtypen konnte erstmals gezeigt werden, dass die CD141+ DC den einzigen effektiven kreuzpräsentierenden DC-Subtyp des Blutes darstellen. XCR1 ist somit auch im humanen System spezifisch auf kreuzpräsentierenden DC exprimiert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass es sich bei den XCR1+ DC der Maus und des Menschen um funktionelle Homologe handelt. / Cross-presentation by dendritic cells (DC) is a process, in which extracellular antigen is shunted into the MHC I presentation pathway and presented to CD8+ T cells. So far, murine cross-presenting DC were defined by the expression of the molecules CD8 in the spleen and CD103 in the periphery. However, cross-presenting DC have not been characterized in humans. In this work, a flow cytometric staining of XCR1 was established for the first time which allowed the detection of XCR1 on 83 % of CD8+ DC and 4 % of CD8-CD4- DC of the spleen. The phenotype of splenic XCR1+ DC differed markedly from XCR1- DC. Both, Batf3- and Irf 8-deficient mouse strains showed an absence of splenic XCR1+ DC. Furthermore, the frequency of XCR1+ DC was significantly increased in spleens of C57BL/6 mice treated with Flt3 ligand. These results demonstrate that the development of XCR1+ DC is dependent of these factors. To test the ability to cross-present antigen, all splenic conventional DC were sorted according to their expression of CD8 and XCR1. XCR1+ DC were most efficient in cross-presenting soluble and cell-associated antigen to CD8+ T cells. Therefore, XCR1 is the first surface marker that can be used to delineate murine cross-presenting DC and the development of this distinct DC population is strongly dependent on Batf3, IRF-8 and Flt3 ligand. To explore if XCR1+ DC also exist in men, cell populations of human peripheral blood were analysed for their XCR1-expression using qPCR and flow cytometric staining. Only CD141+ DC express XCR1 mRNA and protein. An efficient sorting strategy for the isolation of all DC subsets was established to compare their ability to cross-present soluble and cell-associated antigen. CD141+ DC were the only effective cross-presenting DC subtype. Therefore, XCR1 is also in the human a receptor expressed specifically on cross-presenting DC. In summary, the data show that the XCR1+ DC of mouse and men are functional homologues.

Die pädiatrische Akute Lymphatische Leukämie ist heutzutage gut behandelbar. Trotzdem ist die Prognose im Falle eines Rezidives weiterhin schlecht. Die häufigsten extramedullären Orte für Rezidive sind das zentrale Nervensystem und der Hoden. Um ein Rezidiv im Hoden zu verhindern, ist es nötig die zellulären und molekularen Vorgänge zu verstehen. Dafür wurde Patientenmaterial auf seine Expression bestimmter Oberflächenmoleküle analysiert. Verglichen wurden Proben von Patienten mit verschiedenen Rezidiv-Arten. Um die funktionellen Aspekte der Hodenphysiologie auf die Leukämiezellmigration und -lokalisation zu untersuchen wurde ein PDX-ALL Mausmodel mit Hodenbeteiligung etabliert. Um potenziell involvierte Chemokin-Chemokinrezeptor-Achsen zu identifizieren, wurden 55 Knochenmarksproben von Patienten untersucht. Die Expressionsmuster der Rezeptoren wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es wurde festgestellt, dass CXCR4 meistens sehr hoch exprimiert wird. Deshalb wurde anschließend der Einfluss der CXCR4-CXCL12 Achse in in vitro Versuchen mit Hilfe primären Hodenstromas untersucht. Um verschiedene Subpopulationen zu untersuchen, wurde die Isolation von Hodenmakrophagen, Sertoli Zellen und Peritubulären Zellen aus der Maus etabliert und ihr Einfluss auf ALL Zellen untersucht. Es wurde festgestellt, dass Hodenmakrophagen bei Tumorkontakt ihren Phänotyp zugunsten einer tumorfördernden Subpopulation verändern. Zu guter Letzt wurde ein adaptives PDX-ALL Mausmodel mit Hodenbeteiligung entwickelt. Dabei wurden die Hoden von vorpubertären Mäusen bevorzugt infiltriert. Die Bedeutung der CXCR4-CXCL12 Achse für die Hodeninfiltration wurde in einem in vivo Versuch validiert. Während Knochenmark und Milz nach einer anti-CXCR4 Gabe kleine ALL Populationen aufwiesen, war der Hoden komplett Tumor-frei. Das Model kann für Versuche genutzt werden, um weitere Signalwege zu identifizieren, welche in die Hoden gerichtete Migration und das Überleben der Zellen involviert sind. / Advancing therapy strategies led to event-free-survival increase of paediatric acute lymphoblastic leukaemia (ALL). Relapses that occur are often drug resistant and come with poor prognosis. Extramedullary sites for relapse are the central nervous system (CNS) and the testis. To prevent testicular relapse, factors responsible for the infiltration and survival need to be discovered. Primary patient material was analysed with regard to differential expression of surface molecules on leukemic cells from BM. To analyse functional aspects of testis physiology on leukemic cell migration and localisation an adoptive PDX-ALL mouse model with testicular involvement was established. To identify potential chemokine-chemokine receptor axes responsible for the leukaemia cell migration towards the testis, a characterization of 55 patient BM samples was performed. The expression pattern of chemokine receptors on BM derived leukaemia cells was compared by flow cytometry. CXCR4 was identified to be highly expressed on patients cells, regardless of the subclass of relapse. Relevance of the CXCR4-CXCL12 axis was studied in vitro. Primary testicular stroma cultures were available, which provided a useful tool to examine testis directed migration. Isolation of testicular macrophages, Sertoli cells and peritubular cells was established and their impact on ALL cell survival was analysed. The macrophages were found to alter their phenotype upon ALL cell contact towards a tumour favourable subtype. Most importantly, a murine adoptive patient-derived xenograft (PDX)-ALL cell transfer model with testicular involvement was established. Testes of pre-puberty mice were preferentially infiltrated. Blocking CXCR4 with an antibody validated relevance of the CXCR4-CXCL12 signalling axis. The testis showed no infiltration in anti-CXCR4 treated animals. The mouse model will be useful to identify and validate further signalling pathways, participating in testis directed migration and survival.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.