Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL) gehört zu den niedrig malignen B- Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL) und ist die am häufigsten auftretende Leukämieform des Erwachsenenalters. Sie wird durch die Expansion eines reif- zelligen, nicht-funktionellen und CD19-positiven B-Zellklons verursacht, dessen B-Zell-Rezeptor sich selbst als Antigen erkennt und aktiviert. Im Krankheitsver- lauf kommt es zu einer Lymphadenopathie und einer zunehmenden Ausschwem- mung der CLL-B-Lymphozyten in das periphere Blut, im fortgeschrittenen Sta- dium auch zur Organinfiltration, zumeist in das Knochenmark, die Leber und die Milz. Die klinische Symptomatik ist dabei häufig durch Leistungsminderung, Dys- pnoe, verstärkte Blutungsneigung, häufigere Infekte sowie B-Symptomatik ge- prägt. Die meist lange Zeit indolent verlaufende CLL führt unbehandelt zum Tod. In der letzten Dekade wurde die Chemotherapie zunehmend durch zielgerichtete Therapieansätze abgelöst, die jedoch bisher für die überwiegende Mehrheit der Patienten noch nicht kurativ sind. Für die Behandlung rezidivierter und therapie- refraktärer CLL-Patienten bleibt deshalb die Weiterentwicklung von Therapieop- tionen, auch von immuntherapeutischen Ansätzen gegen B-Zell-Linien-spezifi- sche Antigene wie CD19, von Bedeutung. Blinatumomab ist ein CD19-gerichteter bispezifischer Antikörper, der über CD3 T-Zellen MHC-unabhängig aktivieren und so eine B-Zell-Apoptose induzieren kann. Bisher ist Blinatumomab zur Behandlung der CD19-positiven akuten lym- phatischen Leukämie (ALL) klinisch zugelassen. Im Vergleich zur ALL war Blina- tumomab bei der Behandlung von Patienten mit B-NHL nicht so effektiv und musste auch sehr viel höher dosiert werden. Die dieser klinischen Beobachtung zugrunde liegenden Mechanismen sind bisher weitgehend unaufgeklärt. Ein bes- seres Verständnis der Blinatumomab-induzierten biologischen Reaktionen könnte dazu beitragen, potenziell therapeutisch adressierbare Ko-Regulatoren zu identifizieren. Die Immuncheckpoint-Blockade als Monotherapie hat sich bei der CLL als unzu- reichend effizient gezeigt. Da die Immuncheckpoint-Regulatoren PD-1 und PD- L1 jedoch eine kritische Rolle bei der Terminierung von Anti-Tumor-gerichteten T-Zellantworten spielen, sollte in dieser Arbeit eine mögliche Wechselwirkung von Blinatumomab und der PD-1-/PD-L1-Achse in der CLL näher untersucht wer- den. Um die Fragestellung experimentell zu untersuchen, wurde ein primäres in vitro- CLL-Model etabliert. Dafür wurde im Rahmen der Routinediagnostik 18 CLL-Pa- tienten zusätzlich peripheres Blut entnommen, das in der aufzureinigenden PBMC-Fraktion sowohl primäre CLL-B-Lymphozyten als Targetzellen als auch primäre T-Zellen als autologe immunologische Effektorzellen enthielt. Für die Etablierung dieses Modells wurden die ersten 9 CLL-PBMC-Proben in die Zell- kultur überführt und mit verschiedenen Konzentrationen von Blinatumomab ent- weder in der Abwesenheit oder der Gegenwart von Pembrolizumab kultiviert. Nach der Etablierung der Konzentrations-Wirkungsbeziehung und deren zeitli- chen Verlaufes wurden Experimente in weiteren 9 Patientenproben durchgeführt. Dabei wurde mittels Durchflusszytometrie die Viabilität der CLL-B-Lymphozyten, die Expression von PD-L1 auf den CLL-B-Lymphozyten und die PD-1-Expression auf den T-Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert. Blinatumomab zeigte eine anti-CLL-Wirksamkeit, die von seiner Dosis und dem Verhältnis von Effektor- und Targetzellen abhängig war. Dabei unterschied sich das Ausmaß der anti-CLL-Wirkung innerhalb der untersuchten CLL-Proben- gruppe, was auf eine biologisch determinierte Heterogenität der verschiedenen primären CLL-Zellen hindeutet. Sowohl die Expression von PD-1 auf den T-Zel- len als auch die von PD-L1 auf den CLL-B-Zellen wurden unter Blinatumomab- Behandlung stark hochreguliert. Interessanterweise war dieser Effekt auch schon im subletalen Dosisbereich von Blinatumomab zu beobachten. Durch Behand- lung mit Pembrolizumab wurde die gemessene PD-1-Expression auf den T-Zel- len suffizient erniedrigt, was für eine effektive Blockade des Immuncheckpoints spricht. Die PD-1-Hemmung mittels Pembrolizumab-Behandlung führte bei zwei der neun untersuchten Proben und beim letzten Etablierungspatienten zu einer Verstärkung der Blinatumomabwirkung, während für die anderen sieben Proben die Wirkung Blinatumomabs unverändert blieb. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es prinzipiell in einer Subgruppe möglich ist, mittels PD-1-Inhibition die anti-CLL-Wirkung von Blinatumomab zu verstärken. Zum anderen weisen sie da- rauf hin, dass sich eine Wirkungsverstärkung von Blinatumomab über diesen An- satz bei vielen CLL-Patienten nicht erreichen lassen wird. Im Rahmen dieser Arbeit wird der gewählte experimentelle Ansatz mit einem pri- mären Zellmodell kritisch diskutiert. Weitergehende Untersuchungen der ge- nauen molekularen Mechanismen, die den beobachteten heterogenen Reaktio- nen der CLL-Zellen auf Blinatumomab und Pembrolizumab zugrunde liegen, sind geplant. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL), a low-grade malignant B cell non-Hodgkin's lymphoma (B-NHL), is the most common form of leukemia in adults. It is caused by the expansion of a mature, non-functional and CD19-positive B cell clone that expresses an autoactivated B cell receptor that recognizes itself as an antigen. Disease progression is characterized by lymphadenopathy, an increasing num- ber of CLL B lymphocytes in the peripheral blood, and, in advanced stages, infil- tration of organs, usually the bone marrow, liver and spleen. Clinical symptoms include reduced performance status, shortness of breath, increased bleeding ten- dency, frequent infections and B symptoms. CLL, which can be indolent for a long time, leads to death if left untreated. Recently, chemotherapy has been increas- ingly replaced by targeted therapy approaches, which, however, are not yet cu- rative for the vast majority of patients. The further development of therapeutic options, including immunotherapeutic approaches against B-cell lineage-specific antigens such as CD19, therefore remains a challenge, particularly for the treat- ment of patients with relapsed and refractory CLL. Blinatumomab is a CD19-directed bispecific antibody that can MHC-inde- pendently activate T cells via CD3 and thus induce B cell apoptosis. To date, blinatumomab has been clinically approved for the treatment of CD19-positive acute lymphoblastic leukemia (ALL). Interestingly, as compared to ALL, blina- tumomab treatment of B-NHL was not as effective and required much higher doses. A better understanding of biological mechanisms underlying this clinical observation might help to identify therapeutically addressable co-regulators. Immune checkpoint blockade as monotherapy has been shown to be insuffi- ciently effective in CLL. However, as the immune checkpoint regulators PD-1 and PD-L1 play a critical role in the termination of anti-tumor directed T cell re- sponses, this work aimed to analyze a potential interaction of blinatumomab and the PD-1/PD-L1 axis in CLL. For functional experiments, a primary in vitro CLL model was established. As part of routine diagnostics, additional peripheral blood was taken from 18 CLL patients, which contained both primary CLL B lymphocytes as target cells and pri- mary autologous T cells as immunological effector cells in the PBMC fraction to be purified. To establish the model, the first 9 CLL-PBMC samples were trans- ferred to cell culture and tested with different concentrations of blinatumomab either in the absence or presence of pembrolizumab. After determining the con- centration ranges for a dose-response relationship and their respective time course, experiments were carried out on a further 9 patient samples. The viability of the CLL-B lymphocytes, the expression of PD-L1 on the CLL-B lymphocytes and the PD-1 expression on the T cells were analyzed at different time points using flow cytometry. Blinatumomab showed anti-CLL efficacy depending on both its dose and the ef- fector to target cell ratio. The extent of the anti-CLL effect differed within the CLL sample group investigated, indicating biologically determined heterogeneity of the different primary CLL cells. Both the expression of PD-1 on the T cells and of PD-L1 on the CLL-B cells were upregulated upon treatment with blinatumomab. Interestingly, this effect was also observed in the sublethal dose range of blina- tumomab. Treatment with pembrolizumab sufficiently downregulated the meas- ured PD-1 expression on T cells, indicating effective blockade of the immune checkpoint. PD-1 inhibition by pembrolizumab treatment led to an enhancement of the blinatumomab effect in two of the nine samples examined and the last sample of the previous establishment, whereas the effect of blinatumomab re- mained unchanged in the other seven samples. These data provide initial evi- dence for the concept that the anti-CLL effect of blinatumomab can be enhanced by concomitant PD-1 inhibition at least in a CLL subset. However, these data also show that no enhancing effect was observed in the majority of the CLL samples analyzed. In this thesis, the chosen experimental approach of working with a primary cell model is critically discussed. Further studies are planned to analyze the molecu- lar mechanisms underlying the heterogeneous response of CLL cells to blina- tumomab and pembrolizumab.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.